湯泮泮 葉興蓉 陸雪萍 李龍 謝佳穎 馮莉萍 陳旭 任萍 陸禮和

基金項(xiàng)目：

作者簡(jiǎn)介：

湯泮泮（1988—），男，漢族，碩士，主管藥師，研究方向?yàn)橹兴幖疤烊划a(chǎn)物研究與開發(fā)。E-mail：690055283@qq.com

通信作者：

陸禮和（1987—），男，漢族，碩士，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物及中藥開發(fā)研究。E-mail： 657484647@qq.com

【摘? 要】

目的：多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)化直緣烏頭中草烏甲素滲漉提取工藝。 方法：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸泡時(shí)間、乙醇用量、滲漉流速為影響因素，草烏甲素轉(zhuǎn)移率和干膏率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。采用HPLC測(cè)定草烏甲素含量，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，流動(dòng)相為0.2%三乙胺水溶液［用磷酸調(diào)節(jié)pH值（3.1±0.1）］-乙腈（60∶40）。結(jié)果：最佳條件為藥材粉碎過(guò)10目篩，加3倍藥材量70%乙醇浸泡時(shí)間16 h，7倍藥材量70%乙醇，滲漉流速2 mL/min，草烏甲素轉(zhuǎn)移率＞95%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便穩(wěn)定、重復(fù)性好，為草烏甲素的進(jìn)一步分離純化與利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】

草烏甲素；綜合評(píng)分；滲漉提取；正交試驗(yàn)

【中圖分類號(hào)】R284.2??? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）22-0025-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.22.zgmzmjyyzz202322007

Multi-index Integrated Evaluation MethodOptimization of Percolation and Extraction

Process of Bulleyacinitine A from Aconitum bulleyanumm

TANG Panpan? YE Xingrong? LU Xueping? LI Long? XIE Jiayin? FENG Liping? CHEN Xu? REN Ping? LU Lihe*

Yunnan Institute of Materia Medica，Yunnan Provincial Key Laboratory for TCM and

Ethnic Drug of New Drug Creation， Kunming 651000，China

Abstract：

Objective Multi-index Integrated Evaluation MethodOptimization of Percolation and Extraction Process of Bulleyacinitine A from Aconitum bulleyanumm. Methods Based on the analysis of the single factor experiment results， orthogonal test were used to determine the effects of ethanol dosage，ethanol concentration，soaking time and percolation speed on the extraction process of Aconitum bulleyanumm.by taking the dry extract yield and transfer rate of Bulleyacinitine A are taken as theindices for the comprehensive evaluation.HPLC was employed to determine contents of Bulleyacinitine A with detection wavelengths of 260 nm and mobile phases of was 0.2% triethylamine aqueous solution ［pH（3.1±0.1） adjusted with phosphoric acid］ -acetonitrile （60∶40）. Results The optimum percolation process was to add 10 times amount of Aconitum bulleyanumm （sieve No.1） and the 70% of ethanol，and soak for 16 hours.The percolation speed was 2 mL/min per minute. Transferring rate of Bulleyacinitine A was more than 95%. Conclusion This optimized percolation process is simple and stable with good repeatability，it can provide a theoretical basis for Separation and purification of Bulleyacinitine A．

Keywords：

Bulleyacinitine A;Composite Score; Percolation Process; Orthogonal Test

草烏甲素是從天然植物中提取分離純化得到的生物堿，具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)作用，臨床用于治療風(fēng)濕及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肩周炎等［1］，與非甾體消炎鎮(zhèn)痛藥和阿片類鎮(zhèn)痛藥相比，草烏甲素的安全性較好［2-3］。從2005版、2010版、2015版、2020版《中國(guó)藥典》二部均收載了草烏甲素原料及其制劑 ［4-7］，隨著草烏甲素制劑在臨床上的廣泛應(yīng)用，草烏甲素市場(chǎng)需求較旺盛，作為草烏甲素提取用原料藥材需求量也不斷增加。

目前草烏甲素只能從烏頭屬植物中分離得到，如滇西烏頭（Aconitum bulleyanumm Diels）、粗莖烏頭（Aconitum crassicaule W.T.Wang）［8］、長(zhǎng)緣烏頭（Aconitumm georgei Comber）［9］和直緣烏頭（Aconitum transsectum Diels）［10］等，其中直緣烏頭主要為工業(yè)生產(chǎn)草烏甲素的原料［11］。沈勇等［12-14］采用甲醇滲漉，張紅彬［15］采用堿浸泡和石油醚回流提取，付彬彬［16］采用閃式提取草烏甲素，提取過(guò)程中堿性溶劑、有毒有害試劑回收利用較難把控，限制了工業(yè)化生產(chǎn)。本研究采用HPLC法建立了乙醇滲漉液中草烏甲素含量測(cè)定方法［17-18］，以草烏甲素轉(zhuǎn)移率和干膏率作為指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)［19］優(yōu)化直緣烏頭中草烏甲素滲漉提取工藝，為后續(xù)草烏甲素純化研究提供技術(shù)支撐。

1? 儀器與材料

1.1? 儀器? DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒有限公司）；ME204/02型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；SK-8200HP型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2? 材料? 草烏甲素對(duì)照品（批號(hào)：100530-202103，含量以99.2%計(jì)）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙醇為食品級(jí)，三乙胺、磷酸、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，純凈水由Milli-Q純水系統(tǒng)制備，其余試劑為分析純。

直緣烏頭藥材（購(gòu)于云南玉龍縣），經(jīng)云南省藥物研究所正高級(jí)工程師蘇鈦鑒定為毛茛科直緣烏頭Aconitum transsectum Diels的干燥根，草烏甲素含量為0.18%（根據(jù)文獻(xiàn)［11］自測(cè)），批號(hào)：2020414。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 溶液的制備

2.1.1? 供試品溶液制備? 取試驗(yàn)工藝中的滲漉液1mL，加相應(yīng)70%乙醇，并定容至10mL量瓶中，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2? 對(duì)照品溶液制備? 精密稱取草烏甲素對(duì)照品10mg，置于50mL量瓶中，80%乙醇溶解定容至刻度，搖勻，分別精密吸取4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.0mL、8.0mL于10mL量瓶中，80%乙醇稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，即得（每1mL分別含0.08mg、0.10mg、0.12mg、0.14mg、0.16mg草烏甲素）。

2.2? 指標(biāo)成分的測(cè)定

2.2.1? 色譜條件? Ecosil C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；0.2%三乙胺水溶液［用磷酸調(diào)節(jié)pH值（3.1±0.1）］-乙腈（60∶40）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm；柱溫30℃；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量10μL。

2.2.2? 線性關(guān)系考察? 吸取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y=13751X+19.1（R2=0.9995），在0.08～0.16mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3? 精密度考察? 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下草烏甲素對(duì)照品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其峰面積的RSD值為2.1%，表明該儀器精密度良好。

2.2.4? 穩(wěn)定性考察? 取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、16 h、24 h按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其峰面積RSD值為2.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5? 重復(fù)性考察? 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液6份，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其含量RSD值為2.2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6? 加樣回收率試驗(yàn)? 精密量取已知含量同一批滲漉液，平行取樣6次，每份1mL，精密加入等量草烏甲素對(duì)照品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算草烏甲素的平均加樣回收率為99.45%，RSD為2.7%。

2.3? 干膏的測(cè)定? 精密量取25mL滲漉液至干燥恒重的蒸發(fā)皿，80℃水浴蒸干。常壓105℃干燥至恒重，置干燥器冷卻30 min，迅速稱定重量，計(jì)算干膏重量。

2.4? 評(píng)價(jià)指標(biāo)? 草烏甲素轉(zhuǎn)移率越高，提取效果越好，可作為考察提取效果的主要指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)為 0.6，同時(shí)，干膏得率越小，說(shuō)明雜質(zhì)少，干膏得率可作為次要指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)為 0.4，因此以干膏得率和草烏甲素轉(zhuǎn)移率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)滲漉工藝進(jìn)行綜合評(píng)分［11-12］。

干膏得率＝滲漉液總體積×干膏重量/（取樣體積×原藥材重量）

草烏甲素轉(zhuǎn)移率＝干膏草烏甲素含量×干膏重量/（原藥材草烏甲素含量×原藥材重量）

滲漉綜合評(píng)分＝干膏得率/最大干膏得率×40＋草烏甲素轉(zhuǎn)移率/最大草烏甲素轉(zhuǎn)移率×60

2.5? 單因素試驗(yàn)

2.5.1? 粉碎度考察? 取藥材適量，粉碎，分別過(guò)4mm、10mm、24mm、50mm目篩各20 g，3倍量80%乙醇濕潤(rùn)浸泡，裝柱，加入5倍量80%乙醇，滲漉流速1mL/min，浸泡時(shí)間16 h，搖勻，直接取滲漉液0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，粉碎度10目篩時(shí)草烏甲素含有量最高及耗時(shí)較短，故選擇其進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5.2? 乙醇體積分?jǐn)?shù)? 取藥材粉碎過(guò)10目篩20 g，3倍量一定乙醇濃度濕潤(rùn)浸泡，浸泡時(shí)間16 h，裝柱，加入5倍量相應(yīng)乙醇濃度進(jìn)行滲漉，滲漉流速1mL/min，考察50%、65%、80%、95%乙醇濃度對(duì)提取效果的影響。結(jié)果見表1，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)綜合評(píng)分影響較大，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，綜合評(píng)分先升高再降低， 80%乙醇時(shí)綜合評(píng)分最高。結(jié)合經(jīng)濟(jì)成本，選乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、80%、90%乙醇作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.5.3? 浸泡時(shí)間? 取藥材粉碎過(guò)10目篩20 g，3倍量80%乙醇濕潤(rùn)浸泡，裝柱，加入5倍量相應(yīng)乙醇濃度進(jìn)行滲漉，滲漉流速1mL/min，考察浸泡時(shí)間4 h、8 h、16 h、24 h對(duì)提取效果的影響。結(jié)果見表2，浸泡時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分影響較大，隨著浸泡時(shí)間的增加，綜合評(píng)分趨勢(shì)放緩，浸泡時(shí)間16 h時(shí)綜合評(píng)分最高。結(jié)合經(jīng)濟(jì)成本，故固定浸泡時(shí)間為8 h、16 h、24 h作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.5.4? 乙醇用量? 取藥材粉碎過(guò)10目篩20 g， 3倍量80%乙醇濕潤(rùn)浸泡，浸泡時(shí)間16 h，裝柱，滲漉流速1mL/min，考察乙醇用量5倍、7倍、9倍、12倍、17倍對(duì)提取效果的影響。結(jié)果見表3，乙醇用量對(duì)綜合評(píng)分影響較大，隨著乙醇用量的增加，綜合評(píng)分趨勢(shì)放緩，乙醇用量15倍時(shí)綜合評(píng)分最高。結(jié)合經(jīng)濟(jì)成本，故固定乙醇用量為10倍、15倍、20倍作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.5.5? 滲漉流速? 取藥材粉碎過(guò)10目篩20 g，3倍量80%乙醇濕潤(rùn)浸泡，浸泡時(shí)間16 h，加入12倍80%乙醇進(jìn)行滲漉，考察滲漉流速0.5mL/min、1mL/min、2mL/min、3mL/min對(duì)提取效果的影響。結(jié)果見表3，滲漉流速對(duì)綜合評(píng)分影響較大，隨著滲漉流速的增加，綜合評(píng)分趨勢(shì)放緩，滲漉流速1mL/min時(shí)綜合評(píng)分最高。結(jié)合經(jīng)濟(jì)成本，故滲漉流速為1mL/min、2mL/min、3mL/min作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.6? 正交試驗(yàn)? 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，取藥材粉碎過(guò)10目篩20 g，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、乙醇用量（B）、滲漉流速 （C）、浸泡時(shí)間 （D） 為影響因素， 進(jìn)行4因素3水平L9（34） 正交試驗(yàn)。因素水平見表1，結(jié)果見表2，方差分析見表5。

即各因素最優(yōu)水平分別為A1、B2、C2、D2。方差分析（表7）結(jié)果顯示，因素A的F值為26.168，大于F0.05（2，2）＝19.00，說(shuō)明A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)有顯著性影響（P＜0.05），結(jié)合直觀分析顯示的A1水平較好，因此A因素選取A1水平，即滲漉提取的乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。而B（乙醇用量）的F值為0.510、C（滲漉流速）F值為0.353均小于F0.05（2，2）＝19.00，表明B和C因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)無(wú)顯著性影響（P＞0.05）。正交試驗(yàn)結(jié)果中綜合評(píng)分顯示，滲漉工藝為A1B2C2D2的評(píng)分最高，A因素為A1水平，與方差分析結(jié)果一致；B、C、D因素為 B2、C2、D2均取各水平的中間值，從滲漉效率和節(jié)約溶劑角度考慮也較為合理。綜上，通過(guò)正交試驗(yàn)初步選擇滲漉工藝條件為A1B1C2D2，即70%乙醇（3倍藥材量）浸泡時(shí)間16 h，再加70%乙醇滲漉（7倍藥材量），滲漉流速2mL/min。

2.7? 滲漉工藝驗(yàn)證試驗(yàn)? 取藥材粉碎過(guò)10目篩20 g，平行3份，加入70%乙醇（3倍藥材量）浸泡時(shí)間16 h，再加70%乙醇滲漉（7倍藥材量），滲漉流速2mL/min，計(jì)算草烏甲素轉(zhuǎn)移率和干膏得率，結(jié)果見表8。結(jié)果顯示，草烏甲素平均轉(zhuǎn)移率為97.94%，RSD為0.66%；干膏平均得率為45.73%，RSD為 0.72%；平均綜合評(píng)分值為97.94%；結(jié)果表明，3次試驗(yàn)結(jié)果和正交試驗(yàn)綜合評(píng)分96%～97%之間，RSD值為0.66%，表明該提取工藝參數(shù) A1B1C2D2穩(wěn)定、科學(xué)、可行。

3? 討論

草烏甲素在臨床上廣泛應(yīng)用，市場(chǎng)需求較旺盛，提升草烏甲素的提取效率，是一項(xiàng)重要的研究工作。預(yù)實(shí)驗(yàn)曾對(duì)滲漉法和回流法提取進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)滲漉法的草烏甲素轉(zhuǎn)移率高，故選擇滲漉法。本文先對(duì)滲漉提取中粉碎度、浸泡時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、流速進(jìn)行單因素試驗(yàn)，再對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、滲漉流速、浸泡時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。在粉碎粒度考察時(shí)，發(fā)現(xiàn)過(guò)細(xì)時(shí)，未能達(dá)到滲漉提取效果，耗時(shí)較長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移率較低，故直緣烏頭在滲漉提取過(guò)程中不宜粉碎過(guò)細(xì)，避免滲漉過(guò)程中發(fā)生堵塞柱筒現(xiàn)象，影響滲漉效果。最終，采用最佳滲漉工藝為最粗粉加70%乙醇（3倍藥材量）浸泡時(shí)間16 h，再加70%乙醇滲漉（7倍藥材量），滲漉流速2mL/min進(jìn)行提取，耗時(shí)短，綜合評(píng)分較高。該方法簡(jiǎn)便穩(wěn)定、重復(fù)性好，為草烏甲素的進(jìn)一步分離純化與利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2023-03-01? 編輯：陶希睿）