李向陽(yáng) 張曉敏 梁廣霞 王琳 付衛(wèi)旭 牛憲立

基金項(xiàng)目：

珠海市衛(wèi)生健康局珠海市醫(yī)學(xué)科研基金項(xiàng)目（ZH3310200016PJL）；2021年貴州省衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（gzwkj2021-011號(hào)）；貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目（QZYY-2022-006號(hào)）；遵義醫(yī)科大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（F-ZH-011）。

作者簡(jiǎn)介：

李向陽(yáng)（1986—），男，漢族，本科，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)樾难芗澳[瘤醫(yī)學(xué)。E-mail：416254544@qq.com

通信作者：

牛憲立（1975—），男，漢族，博士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：nxl2016gd@163.com

【摘? 要】

目的：研究黃連總生物堿調(diào)節(jié)鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKII）對(duì)局灶性腦缺血（MCAO）大鼠神經(jīng)功能損傷后的影響。方法：隨機(jī)將50只雄性SD大鼠分為假手術(shù)組、對(duì)照組、黃連總生物堿（高濃度、中濃度和低濃度）治療組，采用線栓法建立大鼠局灶性腦缺血（MCAO）模型，假手術(shù)組不給予線栓處理，術(shù)后對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。各治療組給予黃連總生物堿灌胃治療，按照人與大鼠等效劑量關(guān)系折算，假手術(shù)組用等量生理鹽水灌胃；用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)大鼠腦組織中CaMKII的含量；采用BCA法和WST-1法分別測(cè)超氧化物歧化酶（SOD） 的活力和丙二醛（MDA）的含量；制備腦組織病理切片，HE染色觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：與假手組相比，模型組評(píng)分和腦梗死體積明顯升高，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過(guò)黃連治療后神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死體積都有明顯降低（P＜0.05）。模型組與假手術(shù)組的CaMKII的含量相比明顯升高（P＜0.01）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織損傷程度加重，外周血氧化因子SOD活性降低，MDA含量升高；黃連治療后，低、中、高劑量組SOD水平升高，MDA水平降低。HE染色觀察腦組織病變程度，給藥組大鼠的病變程度較模型組有明顯改善。結(jié)論：黃連總生物堿通過(guò)調(diào)節(jié)腦缺血大鼠模型中CaMKII活性的影響，對(duì)海馬細(xì)胞的神經(jīng)損傷有一定的恢復(fù)和治療作用。

【關(guān)鍵詞】

黃連總生物堿；腦缺血再灌注；鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II

【中圖分類號(hào)】R285.5??? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）22-0010-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.22.zgmzmjyyzz202322004

Study on Total Alkaloids of Coptis Coptidis Attenuates Neurological Injury in Focal

Cerebral Ischemia （MCAO） Rats by Regulating CaMKII

LI Xiangyang1? ZHANG Xiaomin1? LIANG Guangxia1? WANG Lin1? FU Weixu1? NIU Xianli2*

1.Department of? Oncology，F(xiàn)ifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical University， Zhuhai 519100，China;

2.Department of? Biochemistry， Zhuhai Campus of Zunyi Medical University， Zhuhai 519041，China

Abstract：

Objective To investigate the effect of total alkaloid-regulated calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ （CaMKII） from Coptis coptidis on neurological injury after focal cerebral ischemia （MCAO） in rats. Methods Fifty male SD rats were randomly divided into sham operation group， control group， and total alkaloids of Coptis coptidis （high concentration， medium concentration， and low concentration） treatment group. Focal cerebral ischemia （MCAO） model was established by suture method. The rats in sham operation group were not given suture treatment. The total alkaloids of Coptis coptidis were given to each treatment group by gavage according to the equivalent dose relationship between human and rats. The sham operation group was given the same amount of normal saline. The content of CaMKII in rat brain was detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The activity of superoxide dismutase （SOD） and the content of malondialdehyde （MDA） were measured by BCA method and WST-1 method， respectively. The pathological sections of brain tissue were prepared and the morphological changes were observed by HE staining. Results Compared with the sham hand group， the score and infarct volume of the model group were significantly increased， and the neurological function score and infarct volume of each experimental group were significantly decreased after coptis coptidis treatment （P＜0.05）. The content of CaMKII in the model group was significantly higher than that in the sham group （P＜0.01）. Compared with the sham operation group， the degree of brain tissue injury was aggravated， the activity of SOD in peripheral blood was decreased， and the content of MDA was increased in the model group. After treatment with Coptis coptidis， SOD level increased and MDA level decreased in low， medium and high dose groups. The degree of brain tissue lesions was observed， and the degree of lesions in the drug group was significantly improved compared with that in the model group. Conclusion Total alkaloids of Coptis coptidis have a certain recovery and therapeutic effect on the nerve injury of hippocampal cells by regulating the content and phosphorylation of CaMKII in the rat model of cerebral ischemia.

Keywords：

Coptis Chinensis；Cerebral Ischemia-reperfusion；Calcium/Calmodulin Dependent Protein Kinase II

腦血管疾病是因?yàn)槟X部血液循環(huán)故障引起的，造成對(duì)腦組織損傷的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其嚴(yán)重危害了人們健康，臨床上主要表現(xiàn)為急性腦血管病，急性腦血管病可分為出血性、缺血性兩種，其中缺血性腦血管病約占所有腦血管病的70%～80%［1］。Ca2+/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaM KinaseⅡ）在腦中含量十分豐富且對(duì)中樞正常神經(jīng)元活動(dòng)至關(guān)重要。短暫腦缺血即可誘發(fā)缺血敏感組織該酶活性顯著抑制， 再灌注后其活性逐漸恢復(fù)［2］。大量研究［3］表明， Ca2+/CaM Ⅱ活性抑制與缺血性遲發(fā)性神經(jīng)元死亡（DND） 關(guān)系密切。黃連（Coptis chinensis Franch）為傳統(tǒng)中藥，黃連素是黃連的主要成分，具有廣泛的藥理作用［4-5］。有研究［6-7］表明，在個(gè)體和細(xì)胞水平上都可以保護(hù)和修復(fù)損傷的神經(jīng)組織和細(xì)胞。黃連可以顯著改善大鼠腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)功能，減小腦梗死灶體積，具有抗腦缺血/再灌注損傷的作用［8-10］。因此，本研究通過(guò)建立大鼠MCAO模型，檢測(cè)黃連對(duì)大鼠腦缺血再灌注模型中CaMKII含量的影響，探討黃連保護(hù)缺血性腦損傷的作用機(jī)制，為黃連在腦缺血疾病上的臨床用藥提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物? SPF級(jí)健康成年SD雄性大鼠，6月齡，體重約220 g，由珠海市百試通生物科技公司提供（許可證號(hào)：SCXK［粵］2020-0051）。

1.2? 腦缺血模型的制備? 大鼠麻醉前禁食8 h，自由飲水，腹腔注射10%的水合氯醛0.35 mL/100 g進(jìn)行麻醉后，依據(jù)參考文獻(xiàn)［15］，對(duì)大鼠頸部總動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎，構(gòu)建腦缺血模型。

1.3? 實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物神經(jīng)功能評(píng)分? 依照Longa 5等制定的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)模型大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，從而根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇符合要求的模型大鼠。依照Longa的5分法評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)： 0分無(wú)明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀；1～4分為有效模型，1分為提尾時(shí)不能完全伸展前爪，2分行走時(shí)向左右側(cè)旋轉(zhuǎn)，3分為行走時(shí)向左右側(cè)傾倒，4分不能自由行走。積分越高說(shuō)明動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.4? 實(shí)驗(yàn)分組與處理? 將50只的SD大鼠隨機(jī)分成5組，每組10只。黃連總生物堿（低濃度2.5 g/L、中濃度5.0 g/L和高濃度10.0 g/L）治療組、模型組、假手術(shù)組，治療組用黃連總生物堿灌胃，對(duì)照組和假手術(shù)組用等量生理鹽水灌胃。按照人與大鼠等效劑量關(guān)系折算，每只大鼠1 d灌胃兩次，每次2 mL，連續(xù)灌胃7 d。在最后1次給藥12 h之后，對(duì)大鼠進(jìn)行頸椎脫臼法處死，取腦并標(biāo)記保存。

1.5? TTC染色? 在-20 ℃冰箱中取出鼠腦組織，切成2 mm厚度，依次放入十二孔板中，注入2%TTC染液，避光37 ℃恒溫孵育20 min，抽出染色液，4%的多聚甲醛固定24 h，通過(guò)Imdge-Pro Plus軟件測(cè)量，正常大腦染成鮮紅色，缺血組織出現(xiàn)蒼白色。梗死體積（%）=梗死體積/對(duì)側(cè)大腦半球體積×100%。

1.6? 酶聯(lián)免疫? 吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè) CaMKII的含量組織樣品在PBS中勻漿后取上清液，CaMKII的含量采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)。根據(jù)CaMKII檢測(cè)試劑盒的操作步驟，封閉后在37 ℃孵箱中孵化1 h。往每孔里加入90 μL的酶作用底物，沖洗、孵育、顯色。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為450 nm測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。各步驟均嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行。

1.7? 測(cè)定SOD活力及MDA含量? 按上述方法制備組織勻漿，嚴(yán)格按照SOD檢測(cè)試劑盒和MDA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書的操作步驟，酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù)，得到各孔OD值。

1.8? 肝組織病理學(xué)觀察? 將取得的大鼠腦組織用4%多聚甲醛固定12 h、常規(guī)脫水、石蠟浸蠟包埋、定形后制作石蠟切片。按照HE染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，固定封片后置于光學(xué)顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察神經(jīng)元病理學(xué)變化情況及拍照采圖。

1.9? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 各指標(biāo)采用均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析；組內(nèi)兩兩比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件處理。

2? 結(jié)果

2.1? 各組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分和腦梗死體積比較? 對(duì)SD大鼠MCAO模型構(gòu)建完成后，以Longa的5分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，與假手組相比，模型組評(píng)分和腦梗死體積明顯升高，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過(guò)黃連治療后神經(jīng)功能評(píng)分和腦梗死體積都有明顯的降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。詳見表2。

2.2? 大鼠腦組織勻漿上清液CaMKII的含量測(cè)定? 對(duì)酶標(biāo)儀檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行分析，如下表3、圖1所示，其中表3是標(biāo)準(zhǔn)溶液倍比稀釋液的吸光度值及濃度值，圖1是標(biāo)準(zhǔn)溶液倍比稀釋液的曲線圖，X代表濃度值，Y代表吸光度值，該圖的曲線方程為方程：y=（A-D）/［1+（x/C）^B］+D，其中A=5.48892，B=-1.33598，C=6.85143，D=0.08579，r2=0.99982。測(cè)出待測(cè)樣品的吸光度值，即可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線或者標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和待測(cè)樣品的吸光度值，計(jì)算出待測(cè)樣品的濃度。

對(duì)照組的CaMKII的含量（3.547±0.021）ng/mL與假手術(shù)組（0.526±0.034）ng/mL相比顯著升高（P＜0.01）；治療組中Ca2+/CaMKII的活性［高濃度（0.720±0.044）ng/mL、中濃度（0.863±0.045）ng/mL、低濃度（1.543±0.170）ng/mL］與對(duì)照組（3.547±0.021）ng/mL相比明顯降低（P＜0.05），而且黃連總生物堿降低CaMKII的含量具有劑量依賴性，其劑量越高，降低效果越明顯，與假手術(shù)組的值越接近。

2.3? 各組大鼠腦組織勻漿上清液SOD、MDA的含量水平比較? 模型組與與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織損傷程度加重，外周血氧化因子SOD活性降低，MDA含量升高；黃連治療后，低、中、高劑量組氧化因子SOD水平升高，MDA水平降低。

2.4? 各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果? 假手術(shù)組腦神經(jīng)元組織結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，無(wú)明顯異常病變。模型組大鼠腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞間隙增大，有明顯水腫，胞體腫脹變形，胞質(zhì)中空泡增多，神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，核仁變淺或溶解缺失，呈現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變。不同劑量的黃連治療組處理后，各組神經(jīng)元的病變均有明顯的改善，且隨著劑量的增大，改善效果越明顯，神經(jīng)元細(xì)胞較為規(guī)則，排列較為有序，水腫減輕。如圖2所示。

3? 討論

腦部血液循環(huán)障礙引起的腦血管性疾病，從而造成腦組織損傷的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其嚴(yán)重危害了人們的健康［16］。腦缺氧缺血所引起的損傷除發(fā)生在缺血期外， 更可能發(fā)生在缺血組織再灌注時(shí)。后者是由于氧的重新供應(yīng)， 導(dǎo)致氧自由基的產(chǎn)生而引起的［17］。缺氧缺血性腦損傷時(shí)， 由于氧自由基的大量產(chǎn)生等導(dǎo)致細(xì)胞膜Ca2+ 通道開放，使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度異常升高，進(jìn)一步干擾了線粒體氧化磷酸化過(guò)程，且大量激活鈣依賴性酶類使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，同時(shí)又產(chǎn)生大量氧自由基，加重細(xì)胞損害，從而引起海馬細(xì)胞的損傷與凋亡。另外被激活的血小板其Ca2+亦增加，可形成微血栓。過(guò)量的自由基攻擊位于細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸從而引起脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)，并進(jìn)一步形成MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化物。測(cè)定MDA含量能夠反映體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，間接反映缺血對(duì)細(xì)胞造成的損傷［18-19］。

鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ），是Ser/Thr蛋白激酶CaMKS家族中多功能的酶成員，在神經(jīng)組織廣泛分布，參與調(diào)節(jié)突觸的轉(zhuǎn)送過(guò)程，形成長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng) （LTP），是介導(dǎo)記憶和學(xué)習(xí)的關(guān)鍵物質(zhì)。其次，CaMKⅡ還持有調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄等功能。在腦缺血損傷的病理過(guò)程中，CaMKⅡ起著格外重要的作用［20-21］。在短暫性腦缺血時(shí)，由于鈣離子超載，導(dǎo)致CaMKⅡ含量和磷酸化水平異常升高，致使神經(jīng)組織受到損傷［22-23］。有研究［24-26］表明黃連總生物堿在個(gè)體和細(xì)胞水平均可保護(hù)和修復(fù)損傷的神經(jīng)組織和細(xì)胞。從結(jié)果可以看出模型組的CaMKII的含量與假手術(shù)組相比顯著升高（P＜0.01）；治療組中Ca2+/CaMKII的含量與模型組相比明顯降低（P＜0.05），且具有一定劑量依賴性。黃連總生物堿可以通過(guò)降低局灶性腦缺血大鼠模型中CaMKII含量的作用， CaMKII含量異常升高導(dǎo)致的一系列神經(jīng)損傷的效果，其機(jī)制可能與增加血清SOD活性及降低MDA含量有關(guān)。

綜上所述，黃連總生物堿通過(guò)調(diào)控CaMKII可減輕局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能的損傷和對(duì)腦梗死體積有明顯地改善作用，減少了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與腦缺血過(guò)程促進(jìn)了CaMKII的表達(dá)，黃連總生物堿可能調(diào)控了CaMKII的表達(dá)從而減輕氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

［1］

牛非，胡金鳳，菀玉，等.星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血中的變化和作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27（10）：1342-1345.

［2］COULTRAP S J，VEST R S，ASHPOLE N M，et al. CaMKⅡin cerebralischemia［J］.Acta Pharmacol Sin，2011，32（7）： 861-872.

［3］ASHPOLE N M，HUDMON A.Excitotoxic neuroprotection and vulnera- bilitywith CaMK Ⅱ inhibition［J］.Mol Cell Neurosci，2011，46（4）： 720-730.

［4］ 宋玨，路通，謝林，等.黃連解毒湯的藥動(dòng)學(xué)-藥效學(xué)相關(guān)性研究［J］.中草藥， 2011（10）： 2042-2046.

［5］張榮媛，尚愛(ài)佳，段秋華，等.大鼠腦缺血再灌注損傷后不同時(shí)間血清SOD和MDA的變［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)， 2007（6）：428-429.

［6］崔學(xué)軍.黃連及其有效成分的藥理研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥師，2006，9（5）：469.

［7］吳敏，王階.黃連有效成分小檗堿抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中藥雜志，2008，33（18）：2103-2106.

［8］王志潭，竇錦明，王修彬，等.黃連解毒湯藥效部位對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用研究［J］.山東中醫(yī)雜志，2012，31（5）：354-356.

［9］朱華旭，張新龍，曾明飛，等.黃連解毒湯中小檗堿在腦缺血模型大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)與藥效學(xué)相關(guān)性研究［J］.中草藥，2012（3）：125-128.

［10］王文哲，周靜，郭立瑋，等.黃連解毒湯中小檗堿及其他成分模擬組合在腦缺血大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)比較研究［J］.中草藥，2014（1）：45-49.

［15］KULIK T， KUSANO Y， ARONHIME S， et al. Regulation of cerebral vasculature in normal and ischemic brain ［J］. Neuropharmacology， 2008， 55（3）：281-288.

［16］張連宏.簡(jiǎn)述中醫(yī)藥治療缺血性腦血管疾病的研究進(jìn)展［J］.當(dāng)代醫(yī)藥論叢，2014（2）： 165-166.

［17］OSUKA K，WATANABE Y，USUDA N. Phosphorylation of neuronal nitric oxide synthase at Ser847 by CaM-K Ⅱ in the hippocampus of rat brain after transient forebrain ischemia［J］.J Cereb Blood Folw Metab，2002，22（9）：1098-1106.

［18］LIU Z，XU J，SHEN X，et al.CaMKⅡ antisense oligodeoxynucle- otides protect against? ischemia-induced neuronal death in the rat hippocampus［J］.J Neurol Sci，2012，314（1）： 104-110.

［19］HUDMON A，SCHULMAN H，KIM J，et al. CaMK Ⅱ tethers to L-type Ca2+ channels，establishing a local and dedicated integrator of Ca2+ signals for facilitation［J］.J Cell Biol，2005，171（3）： 537-547.

［20］CONTRERAS J E，SANCHEZ H A，VELIZ L P，et al.Role of connexin-based gap junction channels and hemichannelsin ischemia-induced cell death in nervous tissue［J］.Brain Res Brain Res Rev，2004，47（1-3）： 290-303.

［21］王立英，楊世杰.腦缺血-再灌注損傷機(jī)制及藥物治療方法的研究進(jìn)展［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012（6）：1227-1235.

［22］李海濤，李玉明.CaMKⅡ在神經(jīng)缺血性損傷中的作用［J］.山東醫(yī)藥，2013（28）：95-98.

［23］何雨，金玉芬.血管性癡呆大鼠海馬鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ變化機(jī)制的研究［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志， 2011（1）：116-117.

［24］李秀芳，孫衍鯤，張維明. 天麻酯溶性酚性成分對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2011（5）：842-845.

［25］牛憲立，蘇良辰，姬可平，等.黃連浸出液對(duì)腦缺血小鼠海馬區(qū)細(xì)胞總蛋白和SOD的影響［J］.基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2013（3）： 291-295.

［26］左茹，曹雪濱，張文生.黃連素治療阿爾茨海默病的研究進(jìn)展［J］.中草藥，2014（8）： 1184-1187.

（收稿日期：2023-03-02? 編輯：陶希睿）