李旋，葉軍航，趙尹蕾，吉婷婷，李雅潔，周文淵,2*

（1.揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225127）（2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，SA）是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，廣泛存在于水、空氣、人和動(dòng)物的皮膚等環(huán)境中[1]。它可以引起傷口感染，誘發(fā)各種炎癥，甚至污染食品和食用農(nóng)產(chǎn)品，導(dǎo)致食物中毒事件的發(fā)生[2]。使用抗生素（如氨芐西林、卡那霉素和萬(wàn)古霉素等）來(lái)預(yù)防和控制SA是最直接有效的方法，但是過(guò)度使用抗生素會(huì)使金葡菌產(chǎn)生耐藥菌株，對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物健康造成危害，甚至對(duì)生態(tài)環(huán)境安全構(gòu)成威脅[3]。因此，尋找可代替抗生素治療的生物制劑非常重要。

噬菌體是細(xì)菌的病毒，能夠?qū)Ｒ恍缘亓呀馑拗骷?xì)菌，作用機(jī)理明確[4]。噬菌體對(duì)宿主細(xì)菌具有專(zhuān)一性能夠直接攻擊并殺害相應(yīng)致病菌[5]，并且具有易于篩選、數(shù)量龐大[6]、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。最重要的是用于人體和動(dòng)物較為安全，不會(huì)導(dǎo)致菌群出現(xiàn)耐藥性，甚至可以殺死耐藥菌[7]，適合用于食品中多重耐藥SA的控制。目前，一些基于噬菌體的產(chǎn)品已經(jīng)在市場(chǎng)上上市，如ListexTMP100 和ListShieldTM[8]，它們的安全性得到美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）的認(rèn)可，并被美國(guó)農(nóng)業(yè)部（USDA）批準(zhǔn)可以作為抗菌加工助劑，用于食品抗菌。噬菌體根據(jù)是否能進(jìn)行溶原途徑的生活史分為烈性噬菌體和溫和噬菌體，研究表明烈性噬菌體和溫和噬菌體均具有控制SA生長(zhǎng)的潛力。Ngassam-Tchamba 等[9]分離的三株烈性噬菌體（Romulus、Remus 和ISP）在體外對(duì)與牛乳腺炎相關(guān)的SA具有良好裂解活性。Zhang 等[10]分離的溫和噬菌體JS02 對(duì)SA表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，并且能抑制SA生物膜的形成。Chang 等[11]將溫和噬菌體SA13 隨機(jī)缺失突變后的突變噬菌體SA13m 應(yīng)用于牛奶中抑制SA，結(jié)果顯示金葡菌在冰箱溫度（4 ℃）和室溫（25 ℃）下均降低至不可檢測(cè)的水平。Al-Anany 等[12]研究發(fā)現(xiàn)溫和噬菌體HK97 與亞抑菌濃度的抗生素環(huán)丙沙星聯(lián)合使用，對(duì)SA具有良好清除效果。然而，尚未有研究系統(tǒng)性比較溫和噬菌體和烈性噬菌體在形態(tài)、生物學(xué)特性以及基因組組成上的差異。

本研究分離出4 株SA的噬菌體（包括2 株烈性噬菌體和2 株溫和噬菌體），利用透射電鏡觀察其形態(tài)特征差異，隨后對(duì)所分離噬菌體的效價(jià)、宿主譜、耐酸堿能力、熱穩(wěn)定性、一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)、最佳感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of Infection，MOI）值等生物學(xué)特性進(jìn)行比較研究，最后通過(guò)全基因組測(cè)序比較分析烈性噬菌體和溫和噬菌體基因組特征。本文通過(guò)比較溫和噬菌體和烈性噬菌體在形態(tài)、生物學(xué)特性以及基因組組成的差異，為篩選更加高效的噬菌體作為生物抑菌劑，用于控制食品加工過(guò)程中金葡菌污染奠定理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株及樣品來(lái)源

47 株SA菌株YZUsa1-YZUsa47 分離自江蘇省內(nèi)養(yǎng)豬場(chǎng)；ATCC 29213 購(gòu)自北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司；3株SA菌株MRSA 85/2082、MRSA JCSC4744和MRSA WZ153 來(lái)自揚(yáng)州大學(xué)生物危害因素防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；霍氏腸桿菌（Enterobacterhormaechei）Eh-YZU05 分離自豬糞便，單核增生性李斯特菌（Listeriamonocytogenes）ATCC 1911、腸炎沙門(mén)氏菌（Salmonellaenteritidis）CICC 21513、大腸桿菌（Escherichiacoli）CICC 10664 及最小弧菌（Vibrio mimicus）CICC 21613 購(gòu)自CICC 菌種保藏中心。

1.2 主要試劑和儀器

盧里亞-貝爾塔尼（Luria-Bertani，LB）培養(yǎng)基，購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；Baird-Parker 瓊脂基礎(chǔ)，購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；腦心浸出液肉湯（Brain Heart Infusion，BHI），購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；7.5%氯化鈉肉湯，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；絲裂霉素C購(gòu)自上海麥克林生物公司。

SW-CJ-1F 型無(wú)菌操作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備制造有限公司；JEM-1200EX 型透射電鏡，日本電子株式會(huì)社；HC-2066 型高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；H/T16MM 型冷凍離心機(jī)，北京博勱儀器有限公司；BDY-2012 型恒溫?fù)u床，上海百典儀器設(shè)備有限公司。

1.3 噬菌體分離

1.3.1 烈性噬菌體分離

利用SA菌株ATCC 29213 作為宿主進(jìn)行SA噬菌體分離。采集揚(yáng)州市內(nèi)污水樣品500 mL，污水樣品的前處理過(guò)程以及噬菌體分離純化過(guò)程參照Chang 等[11]的方法進(jìn)行。用8 000 r/min 的高速離心機(jī)離心10 min以除去雜質(zhì)，之后使用0.45 μm 和0.22 μm 濾器過(guò)濾除菌后，得到噬菌體原液。將3 mL 2×的LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)液和100 μL 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SA菌株ATCC29213加入處理后的污水中，在37 ℃的溫度下?lián)u床培養(yǎng)8 h以上。將培養(yǎng)后的培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)離心、過(guò)濾得到原液，并保存在4 ℃的冰箱。

1.3.2 溫和噬菌體分離

挑取純化后的金葡菌YZUsa13 和YZUsa14 單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中[13]，于37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)12 h，調(diào)整菌液濃度為2×107CFU/mL。分別在LB 培養(yǎng)基中加入167 μL 濃度為0.3 mmol/L 的絲裂霉素C 和菌液，置于37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)6 h，每隔1 h 取1 mL 通過(guò)0.22 μm 濾膜后，與菌液各100 μL 加入10 mL 離心管中，利用層平板法測(cè)定噬菌體滴度。

1.4 透射電鏡觀察

噬菌體的形態(tài)學(xué)觀察參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行，并略作修改。先將噬菌體液進(jìn)行濃縮，然后在200 目碳涂層銅網(wǎng)上滴加20 μL 的濃縮后的噬菌體（1010PFU/mL）懸浮液，充分吸附約15 min 后取出銅網(wǎng)使其自然干燥2～3 min。然后用2%（m/V）的磷鎢酸鈉（pH 值為7.6）溶液染色2 min 后，使用透射電鏡（TEM，Hitachi H600A）觀察噬菌體形態(tài)。

1.5 噬菌體宿主譜的測(cè)定

噬菌體的宿主譜采用空斑法[11]進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)雙層平板法將100 μL 菌液（108CFU/mL）和5 mL 的LB 半固體培養(yǎng)基混勻后倒在LB 固體培養(yǎng)基上，自然干燥后取10 μL 噬菌體培養(yǎng)液（MOI=100）滴在表面，倒放在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。每組實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3 次。

1.6 生物學(xué)特性測(cè)定

1.6.1 最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定

最佳MOI 的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[13]的測(cè)定方法，略有改動(dòng)。將菌液濃度調(diào)整至1×106CFU/mL，按照噬菌體和宿主菌的不同比例（0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10 和100）將噬菌體和宿主菌混勻后37 ℃搖床培養(yǎng)8 h 后，于8 000 r/min 條件下離心10 min，過(guò)濾并測(cè)定效價(jià)，效價(jià)最高的比例即為最佳MOI。每組做三次平行實(shí)驗(yàn)。

1.6.2 一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)（One-stepGrowth）的測(cè)定

一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行測(cè)定，略有改動(dòng)。將噬菌體和108CFU/mL 宿主菌按照最佳MOI 混合，37 ℃靜置培養(yǎng)7 min 后8 000 r/min 離心10 min，棄上清后加入5 mL 的LB 培養(yǎng)基重懸沉淀，放在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于不同時(shí)間點(diǎn)（0、5、10、15、30、45、60、75 和90 min）或（0、10、20、30、40、50、60、75、90、105、120、135、150、165、180、200、220 和240 min）取100 μL 梯度稀釋后與宿主菌各100 μL 倒雙層平板。每組實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3 次。

1.6.3 耐酸堿性實(shí)驗(yàn)

噬菌體的耐酸堿性實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行測(cè)定，分別取1 mL 噬菌體于若干10 mL 的離心管中，分別加入1 mL pH 值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0 的SM 緩沖液中，37 ℃下作用2 h 后測(cè)定效價(jià)。

1.6.4 熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

噬菌體熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行測(cè)定，取1 mL 效價(jià)約為108PFU/mL 的噬菌體于試管中并放在40、50、60、70 ℃的恒溫金屬浴中依次作用20、40和60 min 后測(cè)定效價(jià)。

1.7 基因組測(cè)序及分析

對(duì)噬菌體 SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的全基因組序列進(jìn)行測(cè)定和分析。噬菌體基因組DNA提取參照文獻(xiàn)[14]中所述方法。分別采用瓊脂糖凝膠電泳和Qubit ?dsDNA HS 分析試劑盒（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）對(duì)噬菌體基因組DNA 進(jìn)行定性定量。

通過(guò)Illumina HiSeq 平臺(tái)（Illumina，SanDiego，CA，USA）對(duì)噬菌體基因組序列進(jìn)行測(cè)定，插入片段大小為500 bp。使用FGENESB（http://www.softberry.com）、GeneMarkS[15]和Glimmer v3.02[16]軟件對(duì)開(kāi)放閱讀框（Open Reading Frames，ORFs）進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）和BLASTp[17]對(duì)ORFs 進(jìn)行注釋。將基因組信息上傳至 NCBI 網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的GenBank 編號(hào)分別為OP432864、MW864252、ON229621 和ON220160。

1.8 噬菌體系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

截至2021 年4 月，GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄192個(gè)金黃色葡萄球菌噬菌體基因組序列。本研究通過(guò)軟件kSNP3 v3.0 對(duì)噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13、SAPYZU-SapM14和上述192 個(gè)SA噬菌體基因組序列的單核苷酸多態(tài)性（Single-Nucleotide Polymorphisms，SNPs）進(jìn)行解析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[18]。以噬菌體ErwiniaphagephiEa2809 作為外組噬菌體，并使用iTOL 進(jìn)行注釋[19]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD，n=3），每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中點(diǎn)線(xiàn)圖、柱狀圖由Origin 2023 軟件繪制完成。

2 結(jié)果與討論

如圖1，本研究以金葡菌ATCC 29213 為宿主菌，通過(guò)雙層平板法，從揚(yáng)州市內(nèi)污水樣品中分離得2 株SA烈性噬菌體，分別命名為 SAPYZU-04 和SAPYZU-15。利用絲裂霉素C 從已分離純化的金葡菌YZUsa13 和YZUsa14 中誘導(dǎo)出2 株溫和噬菌體，分別命名為SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14。4 株噬菌體的噬菌斑均呈圓形透亮、邊界清晰，直徑為0.8～1.5 mm。

圖1 噬菌斑形態(tài)圖Fig.1 Morphology of phage plaque

2.1 噬菌體的電鏡形態(tài)

通過(guò)透射電鏡觀察噬菌體微觀形態(tài)，結(jié)果如圖2所示。烈性噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 均有一個(gè)呈正多面體結(jié)構(gòu)頭部和一個(gè)可伸縮的尾巴，頭部長(zhǎng)度分別約為64.96 nm 和88.68 nm，尾部長(zhǎng)度約為165.03 nm 和 176.89 nm 。而溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14均有一個(gè)呈橢球形頭部和一個(gè)不可伸縮的長(zhǎng)尾，頭部長(zhǎng)度分別約為長(zhǎng)直徑：84.26、71.82 nm 和短直徑：44.73、47.71 nm，尾部長(zhǎng)度約為254.43 nm 和266.17 nm。結(jié)果顯示烈性噬菌體SAPYZU-04和SAPYZU-15的顯微形態(tài)與黨瑞瑩等[20]、張志宏等[21]和涂尊方等[22]的研究一致；而溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的電鏡形態(tài)與Zhang 等[10]、Yang 等[23]和Feng 等[24]的研究結(jié)果一致。

圖2 噬菌體的形態(tài)Fig.2 Morphology of phage

2.2 裂解譜

應(yīng)用空斑法測(cè)試噬菌體 SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14對(duì)51 株金葡菌菌株YZUsa1-YZUsa47、ATCC 29213、MRSA 85/2082、MRSA JCSC4744、MRSA WZ153 和5 株其他菌屬菌株的裂解特性，結(jié)果如表1 所示。烈性噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 均能裂解51 株金葡菌，裂解率為100%，并且噬菌斑較透亮，+++數(shù)量均達(dá)到56%；而噬菌體SAPYZU-SapM13能裂解48 株SA菌株，裂解率為94%，噬菌體SAPYZU-SapM14能裂解44 株SA菌株，裂解率為86%。然而，這4 株噬菌體對(duì)于單核增生性李斯特菌ATCC 1911、腸炎沙門(mén)氏菌CICC 21513、大腸桿菌CICC 10664、最小弧菌CICC21613以及霍氏腸桿菌Eh-YZU05均沒(méi)有裂解能力。4 株噬菌體 SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14均比王一帆等[25]（1/11，9%）、Yang 等[23]（13/30，43%）、黨瑞瑩等[20]（23/63，36%）、Feng 等[24]（61/138，44%）和張志宏等[21]（10/37，27%）分離的噬菌體的裂解譜更寬。噬菌體較寬的宿主譜是其用于生物防治的重要特性[26]，因此，噬菌體裂解譜的測(cè)定對(duì)于選擇應(yīng)用于食品中的生物抑菌劑至關(guān)重要。此外，溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14在進(jìn)行宿主譜測(cè)定實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)他們的溶原菌仍有裂解作用，該結(jié)果與Zhang 等[10]和Feng 等[24]的研究一致。研究表明一些噬菌體裂解宿主菌是一種“從外裂解”的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程是高濃度噬菌體吸附宿主菌后快速破壞宿主細(xì)菌細(xì)胞[27]。因此，本研究的溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14進(jìn)行宿主譜測(cè)定時(shí)濃度遠(yuǎn)大于宿主細(xì)菌細(xì)胞是其顯示裂解特性的原因之一。

表1 噬菌體的宿主譜Table 1 Host spectrum of phage

2.3 最佳MOI

用不同 MOI 比例的噬菌體 SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14感染宿主菌，培養(yǎng)8 h 后測(cè)定噬菌體效價(jià)。如圖3 所示，噬菌體SAPYZU-04 在MOI 為0.01（P＜0.05）時(shí)，效價(jià)最高（約為109PFU/mL）；噬菌體SAPYZU-15在MOI 為0.000 1 時(shí)，效價(jià)最高（約為1010PFU/mL）；噬菌體SAPYZU-SapM13在MOI 為0.1 時(shí)，效價(jià)最高（約為1010PFU/mL）；噬菌體SAPYZU-SapM14在MOI為0.01（P＜0.01）時(shí)，效價(jià)最高（約為109PFU/mL）。因此，噬菌體 SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的最佳MOI 分別為0.01、0.000 1、0.1 和0.01。

圖3 噬菌體最佳MOI 測(cè)定結(jié)果Fig.3 Results of determination of the optimal complex number of phage infection

圖4 噬菌體的熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of phages

2.4 噬菌體的熱穩(wěn)定性

如圖 4 所示，金黃色葡萄球菌噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14在40 ℃和50 ℃條件下作用1 h效價(jià)基本不變，效價(jià)分別為5.63×107、1.34×109、1.12×109和1.27×1010PFU/mL；在60 ℃條件下隨著作用時(shí)間越長(zhǎng)，噬菌體 SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14效價(jià)越低。分別在70 ℃孵育40、20和20 min時(shí)，噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15 和SAPYZU-SapM14完全失活，而噬菌體SAPYZU-SapM13在70 ℃孵育60 min 時(shí)完全失活。結(jié)果表明4 株噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14對(duì)高溫的耐受能力均強(qiáng)于Kraushaar 等[28]報(bào)道的金葡菌噬菌體。

2.5 噬菌體的耐酸堿能力

如圖5 所示，噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14在酸度較高的環(huán)境（pH 值為2）中會(huì)完全失活；在pH 值為3～12 時(shí)活性較穩(wěn)定。在pH 值為5 時(shí)，噬菌體SAPYZU-04 的效價(jià)最高為1.31×107PFU/mL（P＜0.05）；pH 值為9時(shí)，噬菌體 SAPYZU-15 的效價(jià)最高為8.94×106PFU/mL；而噬菌體 SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14在pH 值為8 時(shí)效價(jià)最高，分別為9.18×107PFU/mL 和9.52×107PFU/mL。結(jié)果表明噬菌體SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14在pH值為3～12范圍內(nèi)均保持良好活性，其對(duì)酸堿的耐受能力均強(qiáng)于盧瑋等[29]分離的金葡菌噬菌體（pH 值為6～11 范圍內(nèi)穩(wěn)定）。

圖5 噬菌體的耐酸堿能力Fig.5 Resistance of phages to acidity and alkalinity

2.6 一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)

將噬菌體 SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14分別與宿主菌混合后培養(yǎng)，得到噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)。如圖6 所示，烈性噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 侵染宿主的10 min 內(nèi)效價(jià)無(wú)明顯變化，表明它們的潛伏期均為10 min。在10～150 min 內(nèi)，噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 的效價(jià)一直保持升高趨勢(shì)，隨后趨于穩(wěn)定，表明它們的裂解期均約為140 min，裂解量分別約為每個(gè)細(xì)胞210 和322 PFU。而溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的潛伏期較長(zhǎng)，分別約為15 和30 min；裂解期較短，分別約為30 和45 min，裂解量分別為每個(gè)細(xì)胞52 和49 PFU。上述結(jié)果顯示，烈性噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15的裂解量均高于Gutierrez 等[30]分離的金葡菌烈性噬菌體（每個(gè)細(xì)胞15 和25 PFU）。溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的裂解量比Feng等[24]分離的溫和噬菌體JD419 裂解量（每個(gè)細(xì)胞33 PFU）更高。潛伏期和爆發(fā)量是表示噬菌體裂解能力的重要生物學(xué)特性，具有較短潛伏期和較大爆發(fā)量的噬菌體更適合作為生物防治劑[31]。

圖6 噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.6 one step growth curve of phages

2.7 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

全基因組序列分析結(jié)果顯示烈性噬菌體SAPYZU-04 和 SAPYZU-15 基因組全長(zhǎng)分別為140 584 bp 和 135 178 bp，而溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的基因組全長(zhǎng)分別為44 922 bp 和44 232 bp。其中噬菌體SAPYZU-04的GC 含量為31.48%，預(yù)測(cè)到188 個(gè)ORFs；噬菌體SAPYZU-15 的GC 含量為29.90%，預(yù)測(cè)到187 個(gè)ORFs；噬菌體SAPYZU-SapM13的GC 含量為33.98%，包含71 個(gè)ORFs；噬菌體SAPYZU-SapM14的GC 含量為33.89%，包括73 個(gè)ORFs。

截至2021 年4 月，GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中記錄192個(gè)金黃色葡萄球菌噬菌體基因組序列。本研究通過(guò)這些金黃色葡萄球菌噬菌體基因組序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，解析4 株噬菌體和其他金黃色葡萄球菌噬菌體之間的關(guān)系。此樹(shù)形圖（圖7）劃分了3 個(gè)主要的遺傳譜系（I-Ⅲ）。聚類(lèi)分析結(jié)果表明，烈性噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 與Hellelleviridae 科的噬菌體聚在一個(gè)譜系中（譜系Ⅱ），且SAPYZU-04 和SAPYZU-15與噬菌體qdsa001基因組核苷酸序列最相似，相似性＞99.0%；溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14與Azeredovirinae 亞科Dubowvirus屬的噬菌體聚在一個(gè)譜系中（譜系Ⅲ），且SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14與TEM126 和SAP26 的基因組核苷酸序列一致性＞95%。因此，根據(jù) ICTV2022 年最新的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[32]，噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 屬于Hellelleviridae 科；而 SAPYZU-SapM13和 SAPYZU-SapM14屬 于Azeredovirinae 亞科Dubowvirus屬。

圖7 系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.7 Phylogenetic analysis

2.8 全基因組序列分析

對(duì)4 株噬菌體基因組攜帶基因的蛋白功能進(jìn)行注釋?zhuān)Y(jié)果如圖8 所示。噬菌體SAPYZU-04 的基因組編碼32 個(gè)DNA 代謝相關(guān)基因，包括核酸內(nèi)切酶基因（orf38）、DNA 解旋酶基因（orf115）和DNA 聚合酶Ⅰ基因（orf144）等；噬菌體SAPYZU-15 的基因組包含多個(gè)DNA 代謝基因，其中包括3 個(gè)DNA 合成相關(guān)基因（orf1、orf3和orf5）、2 個(gè)DNA 聚合酶Ⅰ（orf10、orf11）和 DNA 綁定蛋白（orf82）；噬菌體SAPYZU-SapM13的基因組編碼13 個(gè)與噬菌體DNA復(fù)制、調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因，包括核酸外切酶基因（orf7）、轉(zhuǎn)錄因子（orf9）、DNA 復(fù)制基因（orf25）和DNA 解旋酶（orf45）等；而噬菌體SAPYZU-SapM14編碼11 個(gè)與噬菌體DNA 代謝相關(guān)的基因，包括轉(zhuǎn)錄因子（orf11）、DNA 綁定蛋白（orf24）、DNA 解旋酶（orf28）和核酸內(nèi)切酶（orf51）等。其中SAPYZU-15基因組編碼豐富的DNA 合成基因加速了噬菌體大分子的合成。SAPYZU-04 的基因組編碼3 個(gè)DNA 組裝基因（orf66、orf68和orf69），SAPYZU-15 的基因組編碼1 個(gè)DNA 組裝基因（orf117），SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14均包含2 個(gè)DNA 包裝基因（分別為orf48、orf49、orf52和orf53）。其中SAPYZU-15編碼的DNA 包裝基因與噬菌體LSA2308[33]的氨基酸序列具有95.9%的相似性；LSA2308 的爆發(fā)量約為407 PFU/cell。DNA 包裝蛋白可以有效地將DNA 泵入尾部噬菌體原衣殼中，加速噬菌體的組裝[34]。噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 的基因組中分別包含3 個(gè)和1 個(gè)尾部蛋白基因（分別為orf108、orf110、orf158和orf142），噬菌體SAPYZU-SapM13編碼5 個(gè)尾部相關(guān)蛋白基因，包括尾管蛋白基因（orf57）和主要尾部蛋白基因（orf58和orf62）等；而SAPYZU-SapM14編碼6 個(gè)尾部相關(guān)蛋白基因，包括尾部蛋白基因（orf57、orf61、orf62）等。這些獨(dú)特的尾部蛋白基因可能是此4 株噬菌體具有廣泛的裂解譜的原因。其中SapYZU-15含有的尾蛋白基因與噬菌體KSAP11[35]的基因組氨基酸序列有95.90%的相似性。KSAP11 具有廣泛的裂解譜，對(duì)30 株SA菌株（包括MSSA 和MRSA 菌株）具有裂解活性。噬菌體SAPYZU-04 包含1 個(gè)穿孔素基因（orf53）和3 個(gè)裂解酶基因（orf52、orf100和orf102），SAPYZU-15 包含1 個(gè)穿孔素基因（orf107）、5 個(gè)裂解酶基因（orf103、orf105、orf149、orf153和orf155）；而SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的基因組均只包含1 個(gè)穿孔素基因（分別為orf70和orf2）和1 個(gè)裂解酶基因（分別為orf71和orf3）。穿孔素基因在裂解過(guò)程中誘導(dǎo)宿主細(xì)胞膜去極化，調(diào)節(jié)裂解時(shí)間[36]。其中SAPYZU-15 基因組中有2 個(gè)裂解酶基因（orf103和orf155）與MR003 具有較高的氨基酸序列相似性（97.90%和99.00%），MR003[37]是高效的SA烈性噬菌體。因此，在這些基因的協(xié)同作用下，噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 潛伏期更短，裂解量更高。此外，溫和噬菌體基因組中的整合酶基因和CI阻遏蛋白是決定其生命周期的重要因素，整合酶基因通過(guò)催化兩個(gè)DNA 分子之間重組使得噬菌體在宿主染色體中進(jìn)行基因的整合和切除[38]，并且溫和噬菌體通過(guò)CI 阻遏蛋白阻斷裂解基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而進(jìn)入溶原周期；而抗阻遏蛋白控制噬菌體在侵染時(shí)進(jìn)入裂解周期[39]。本文的溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14基因組編碼特異性整合酶證明它們具有溶原性，均預(yù)測(cè)到抗阻遏蛋白，但是未預(yù)測(cè)到CI阻遏蛋白和噬菌體抗性基因，可能導(dǎo)致溫和噬菌體SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14在宿主譜測(cè)定時(shí)易進(jìn)入裂解周期，上述結(jié)果與Tian 等[13]的研究結(jié)果一致。

圖8 全基因組分析Fig.8 Whole genome analysis

3 結(jié)論

金黃色葡萄球菌嚴(yán)重威脅食品安全，同時(shí)也是全球關(guān)注的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)安全可靠的生物防治方法，以提高公共衛(wèi)生水平，確保消費(fèi)者安全。本研究分離的烈性噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 效價(jià)均達(dá)到109PFU/mL，而且具有較寬的裂解譜，兩株噬菌體對(duì)51 株SA 菌株的裂解率均高達(dá)100%；在40～60 ℃溫度范圍內(nèi)、pH值在3～12 范圍內(nèi)均保持良好活性；潛伏期較短、裂解能力強(qiáng)，裂解量分別高達(dá)每個(gè)細(xì)胞210 和322 PFU。全基因組序列分析結(jié)果顯示 SAPYZU-04 和SAPYZU-15 均包含多種DNA 代謝基因、多個(gè)裂解酶基因、獨(dú)特的DNA 包裝基因及尾部蛋白基因。因此，烈性噬菌體SAPYZU-04 和SAPYZU-15 是一種更合適、更有前景的生物防治選擇，有望應(yīng)用于控制食品中金葡菌的污染。