張遠(yuǎn)芳，江濤，萬(wàn)建春

（1.江西泉谷科技有限公司，江西南昌，330038；2.南昌海關(guān)技術(shù)中心，江西南昌，330038）

0 引言

2,4-D（2,4-Dichlorophenoxyacetic acid），又名2,4-D酸、2,4-二氯苯氧乙酸，是一種人工合成的植物生長(zhǎng)劑，同時(shí)也是一種廣泛使用的苯氧羧酸類除草劑［1］。2,4-D 屬低毒除草劑，滲透力強(qiáng)，易進(jìn)入植物體內(nèi)，但不易被雨水沖刷去除，使用后易于在植物體內(nèi)形成殘留［2］，易對(duì)人體健康和環(huán)境造成危害，因此許多國(guó)家都對(duì)其規(guī)定了嚴(yán)格的殘留限量。我國(guó)也在《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）［3］中規(guī)定了其在谷物、蔬菜、水果及食用菌等中的最大殘留限量，如規(guī)定谷物中2,4-D 的最大殘留限量范圍為0.01 mg/kg~2 mg/kg，以高粱為例，最低為0.01 mg/kg；蔬菜中最大殘留限量范圍為0.05 mg/kg~0.5 mg/kg，以玉米筍為例，最低為0.05 mg/kg；水果中2,4-D 最大殘留限量范圍為0.01 mg/kg~1 mg/kg，以仁果類水果為例，最低為0.01 mg/kg；食用菌2,4-D 最大殘留限量為0.1 mg/kg。

目前適用于谷物、蔬菜、水果及食用菌的標(biāo)準(zhǔn)方法主要有《糧食和蔬菜中2,4-滴殘留量的測(cè)定》（GB/T 5009.175—2003）［4］?！冻隹谒?,4-滴殘留量檢驗(yàn)方法》（SN/T 0152—2014 ）［5］為氣相色譜法，氣相色譜法在前處理時(shí)多需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生，較為復(fù)雜和費(fèi)時(shí)?！妒卟酥?,4-D 等13 種除草劑多殘留的測(cè)定 液相色譜質(zhì)譜法》（NY/T 1434—2007）［6］為液相色譜質(zhì)譜法，適用基質(zhì)僅為蔬菜。除標(biāo)準(zhǔn)方法外，雖然其他文獻(xiàn)對(duì)2,4-D 殘留量的檢測(cè)方法也多有報(bào)道［7-11］，但測(cè)定基質(zhì)較為單一，包含了對(duì)谷物、蔬菜、水果及食用菌多種植物源性食品基質(zhì)中2,4-D殘留量測(cè)定的方法報(bào)道較少。本文建立了利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)植物源性食品中包含谷物、蔬菜、水果、食用菌中2,4-D 殘留量的分析方法，本方法靈敏度高，前處理較為簡(jiǎn)便且定量限為10μg/kg，回收率良好，可以滿足《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）中關(guān)于谷物、蔬菜、水果及食用菌中2,4-D 最大殘留限量（谷物、蔬菜、水果及食用菌品類中2,4-D的最大殘留限量的最低值0.01mg/kg）的規(guī)定。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有電噴霧（ESI）離子源（美國(guó)AB Sciex 公司），配Agilent 1200 高效液相色譜儀；分析天平（德國(guó)Sartorius 公司，感量0.1 mg，0.01 g）；旋渦混合器（德國(guó)IKA 公司）；超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）；冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；振蕩混合器（常州國(guó)宇儀器制造有限公司）；氮吹濃縮儀（美國(guó)Organo-matian Associates 公司）；固相萃取裝置（美國(guó)Supelco 公司）。

圖1 各基質(zhì)樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 各類別樣品添加濃度為10.0 μg/kg 質(zhì)控樣品定量離子S/N結(jié)果圖

1.2 試劑材料

乙腈（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；乙酸乙酯（色譜純，美國(guó)TEDIA 公司）；2,4-D（純度99.0%，CAS號(hào)：94-75-7，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司）；鹽酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲酸（色譜純，上海安譜公司）；氫氧化鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；Oasis MAX 柱（500mg/6mL，美國(guó)Waters 公司，使用前依次用5mL 甲醇和5mL 水活化，且保持柱體濕潤(rùn)）；針式濾頭（0.22 μm 水相，天津津騰）；配制溶液的水均為GB/T 6682—2008 規(guī)定的一級(jí)水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及試劑配制

2,4-D 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1.0mg/mL）：準(zhǔn)確稱取10.0mg 2,4-D 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10mL 容量瓶中，加入甲醇超聲溶解后，再用甲醇定容至10mL。氫氧化鈉溶液（10 mol/L）：準(zhǔn)確稱取400.0g 氫氧化鈉固體于1L 容量瓶中，加入水溶解后，定容至1L，轉(zhuǎn)移至塑料瓶中儲(chǔ)存?zhèn)溆?。甲酸甲醇溶液?%）：準(zhǔn)確量取2mL 甲酸和98mL 甲醇，混勻后備用。1mol/L 鹽酸：準(zhǔn)確移取90mL 鹽酸溶液至1L容量瓶中，加入水混勻后，定容至1.0L，備用。1mol/L氫氧化鈉溶液：準(zhǔn)確移取50mL 濃度為10mol/L 氫氧化鈉溶液至500mL 容量瓶中，加水混勻后，定容至刻度，搖勻，備用。

1.4 樣品前處理方法

稱取谷物試樣1 g，水果、蔬菜、食用菌試樣5 g，置于50 mL 具塞聚乙烯離心管中，加入5 mL 濃度為1 mol/L 鹽酸于漩渦混合器上渦動(dòng)30 s 后，加入20 mL 乙酸乙酯，渦勻，置于振蕩混合器中振蕩10 min，離心，取上清液置于另一套50 mL 具塞聚乙烯離心管中，殘?jiān)貜?fù)提取一遍，合并上清液，氮?dú)獯蹈伞? mL 濃度為1 mol/L 氫氧化鈉溶液溶解殘?jiān)?，渦旋混勻，離心，上清液過(guò)MAX 柱（水果、谷物、食用菌全部過(guò)柱，蔬菜取2.5 mL 過(guò)柱），再依次用5 mL 水和5 mL 甲醇淋洗，10 mL 2%甲酸甲醇洗脫，40 ℃氮?dú)獯蹈桑? mL水定容，經(jīng)0.22 μm 水系針式濾頭過(guò)濾后，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.5 測(cè)定方法

色譜柱：Phenomenex Luna C8 柱，50mm×2.0 mm（i.d），3.0 μm；柱溫35 ℃；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相A 為乙腈，B 為0.1%甲酸；以65%流動(dòng)相A 及35%流動(dòng)相B 等度洗脫；進(jìn)樣20 μL；電噴霧離子源；負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)控（MRM）；離子源溫度400 ℃；氣簾氣壓力（CUR）10 psi；霧化氣（Gas1）55 psi；輔助氣（Gas2）55 psi；噴霧電壓（IS）3500 v；其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 提取方法的優(yōu)化

相對(duì)于單一基質(zhì)，多種基質(zhì)樣品的提取既要考慮到各基質(zhì)中目標(biāo)化合物的提取效果，避免不同基質(zhì)中的雜質(zhì)，又要考慮能否將提取方法整合統(tǒng)一，適用于多種基質(zhì)。首先考慮目標(biāo)化合物2,4-D 屬于苯氧羧酸類除草劑，易溶于水，化學(xué)結(jié)構(gòu)中含羧酸基功能團(tuán)，在堿性條件下易離解成鹽，降低在有機(jī)相中的溶解度，因此在提取時(shí)需要加入適量的酸以抑制其電離，從而容易被有機(jī)相提取。有文獻(xiàn)研究以稻米基質(zhì)為例，在鹽酸-乙腈提取體系中，鹽酸濃度高于0.1 mol/L 時(shí)，苯氧羧酸類除草劑回收率大于80%［8］，以水果基質(zhì)為例，用鹽酸調(diào)節(jié)樣品溶液的pH 值，當(dāng)pH 值為在2.0~3.0 時(shí)，大部分苯氧羧酸類除草劑的回收率集中在80%~100%［9］。其次是在選擇合適的有機(jī)提取試劑上，有研究比較了2,4-D 在正己烷、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯中的溶解度及萃取時(shí)的雜質(zhì)情況，以乙酸乙酯較好［10］。最后綜合上述研究結(jié)果及各基質(zhì)間的差異，本方法采用以鹽酸酸化，再以乙酸乙酯為提取試劑的提取方式進(jìn)行各基質(zhì)樣品的提取，同時(shí)結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)時(shí)對(duì)各基質(zhì)調(diào)節(jié)pH 的具體情況，最終確定酸化時(shí)加入的鹽酸的濃度及體積。

2.1.2 凈化方式的優(yōu)化

在凈化方式上，由于本方法涵蓋了多種基質(zhì)樣品，因此可能面臨經(jīng)提取后大量雜質(zhì)同時(shí)被提取出來(lái)，導(dǎo)致成分多、檢測(cè)干擾大的問(wèn)題，固相萃取可以在復(fù)雜樣品溶液經(jīng)過(guò)萃取柱中吸附劑時(shí)，通過(guò)吸附劑的極性相互作用、疏水作用或離子交換等作用選擇性地對(duì)樣液中的成分進(jìn)行吸附，再進(jìn)行選擇性洗脫，從而很好地實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品的分離、純化和富集。2,4-D 屬酸性物質(zhì)，因此可以考慮采用陰離子交換柱。另有文獻(xiàn)研究報(bào)道［11］，以大豆基質(zhì)為例，采用Oasis MAX 柱進(jìn)行凈化，試驗(yàn)結(jié)果的回收率均在70%以上，因此考慮采用Oasis MAX 柱進(jìn)行凈化。另外為了更好地提升回收率，從兩方面對(duì)凈化條件進(jìn)行了優(yōu)化改進(jìn)，一是為了更好地促進(jìn)離子交換，本方法采取了對(duì)提取后氮吹干的殘?jiān)尤霘溲趸c溶液進(jìn)行適當(dāng)堿化的操作；二是為了更好的洗脫效果，對(duì)洗脫液進(jìn)行了改進(jìn)。經(jīng)試驗(yàn)考察驗(yàn)證，最終確定了本方法采取的凈化條件。

2.2 測(cè)定儀器的選擇

目前檢測(cè)2,4-D 的主要方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，其中采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜法分析時(shí)需要對(duì)樣品溶液進(jìn)行衍生化處理。高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法相比于前兩種方法具有操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)［12］。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法融合了前處理操作相對(duì)較簡(jiǎn)便，靈敏度高，定性定量更準(zhǔn)確等多種優(yōu)點(diǎn)，因此本研究采取高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定。

2.3 色譜-質(zhì)譜調(diào)節(jié)的優(yōu)化

2.3.1 色譜條件的選擇

對(duì)于多種基質(zhì)中2,4-D 的分離，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較，選擇采用以乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相，Phenomenex Luna C8 柱（50 mm×2.0 mm，3.0 μm）分離。結(jié)果各基質(zhì)中目標(biāo)物2,4-D 色譜峰分離良好，峰形尖銳。各基質(zhì)樣品的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖1 所示。

2.3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)1 μg/mL 的2,4-D 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，并結(jié)合其理化性質(zhì)，在Q1MS（Q1）模式下確定母離子，在Product Ion（MS2）模式下選定2 個(gè)豐度較高、干擾較少的子離子分別作為定性和定量離子，其中響應(yīng)較高者作為定量離子，并依次對(duì)各子離子的去簇電壓（DP）、碰撞氣能量（CE）、入口電壓（EP）及碰撞室出口電壓（CXP）進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的參數(shù)見1.5 測(cè)定方法部分的表1。

2.4 定量限

對(duì)各類別樣品取1 倍添加濃度10.0μg/kg 質(zhì)控樣所得的MRM 色譜圖進(jìn)行處理，得到的定量離子S/N 結(jié)果如圖2，其結(jié)果S/N 均遠(yuǎn)大于10，滿足定量限要求。本方法定量限可達(dá)到10μg/kg（樣品定容至1mL 的信噪比結(jié)果）。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制、線性相關(guān)系數(shù)及回歸方程

用各類別基質(zhì)提取液將標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋得到表2 中標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度由低到高進(jìn)樣檢測(cè)，以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制校正曲線。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，各相關(guān)系數(shù)及線性回歸方程見表2。

表2 水果、蔬菜、谷物、食用菌各基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)及線性回歸方程

表3 水果、蔬菜、谷物、食用菌基質(zhì)中2,4-D 殘留量回收率及精密度數(shù)據(jù)

2.6 回收率與精密度

在水果、蔬菜、谷物、食用菌基質(zhì)中均添加2,4-D 10/20/40μg/kg，3 個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6 次平行試驗(yàn)，計(jì)算添加回收率及精密度。回收率及精密度數(shù)據(jù)見表3。從表中可以看出回收率范圍為80.9%~118%，精密度范圍為2.3%~12.7%，滿足分析要求。

3 結(jié)論

本文以植物源性食品包含水果、蔬菜、谷物及食用菌為基質(zhì)，建立了利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)植物源性食品中包含谷物、蔬菜、水果、食用菌中2,4-D殘留量的分析方法。本方法覆蓋植物源性樣品基質(zhì)種類較多，靈敏度高，前處理較為簡(jiǎn)便，且定量限、線性相關(guān)系數(shù)、回收率及精密度均能滿足檢測(cè)需求，可以用于植物源性食品中包含水果、蔬菜、谷物、食用菌中2,4-D 殘留量的檢測(cè)。