王獻(xiàn)，尚自強(qiáng)，楊冬，楊惠

（1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院胸外科，河南 洛陽 471003；2.河南省人民醫(yī)院，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院胸外科，鄭州 450003；3.河南省人民醫(yī)院，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，鄭州 450003）

我國(guó)是食管癌的高發(fā)國(guó)家，其中鱗狀細(xì)胞癌約占食管癌的90%，食管癌造成的傷殘調(diào)整壽命年位居所有惡性腫瘤第4位［1］。食管早期癥狀隱匿，確診時(shí)大多處于晚期階段，70%～80%患者無法手術(shù)，嚴(yán)重影響患者的生存率［2］，因此探討促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展的分子生物學(xué)機(jī)制具有重大意義。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與其所在的微環(huán)境密切相關(guān)，研究［3］顯示腫瘤微環(huán)境可通過調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境釋放細(xì)胞因子，影響腫瘤的進(jìn)展。炎癥促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲并可誘導(dǎo)免疫抑制，是進(jìn)展性腫瘤微環(huán)境的標(biāo)志之一。白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β是上游促炎細(xì)胞因子，可激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)。已有研究［4-5］顯示IL-1β能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)生、腫瘤侵襲和免疫抑制。程序性死亡受體1（programmed death receptor 1，PD-1）是眾所周知的免疫檢查點(diǎn)，T細(xì)胞活化后可刺激CD4+和CD8+T細(xì)胞的表達(dá)。研究［6］顯示，PD-1在食管癌中的表達(dá)水平增加，PD-1抑制劑在食管癌中具有臨床價(jià)值。本研究旨在探討IL-1β和PD-1在食管癌組織中的表達(dá)情況及對(duì)患者臨床病理特征和預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年1月至2020年5月于河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的食管癌患者127例，根據(jù)術(shù)后3年患者的存活情況，將患者分為存活組（n=95）和死亡組（n=32）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)后病理確診為食管癌；（2）接受手術(shù)聯(lián)合放化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他腫瘤；（2）資料不完整。收集患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)深度。本研究獲得河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：2016012），所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)食管癌患者組織中PD-1、程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PDL1）的表達(dá)：將食管癌組織至于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后制備成厚度約4 μm的切片，經(jīng)脫蠟、水化、滲透和封閉后，滴加抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體（1 ∶200），置于4 ℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗，滴加相應(yīng)種屬二抗（1 ∶400），室溫下孵育60 min，PBS沖洗3遍。滴加顯色液，置于顯微鏡下觀察，呈淡黃色、棕黃色和棕褐色為陽性表達(dá)。

1.2.2 腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、IL-6和IL-1β的水平：根據(jù)ELISA試劑盒說明檢測(cè)外周血中細(xì)胞因子、TNF-α、IL-6和IL-1β水平。正常范圍內(nèi)為正常表達(dá)，高于正常范圍為高表達(dá)。

1.2.3 術(shù)后隨訪：患者出院后以電話和門診相結(jié)合的方式進(jìn)行隨訪，術(shù)后第1年，每半年隨訪1次，自第2年起每1年隨訪1次，最短隨訪時(shí)間為5個(gè)月，最長(zhǎng)隨訪時(shí)間為36個(gè)月，失訪患者5例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用Kaplan-Meier生存曲線計(jì)算不同組間的生存率，并采用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行分析。組間一般臨床資料比較采用χ2檢驗(yàn)，利用單因素和多因素Cox回歸分析影響患者術(shù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組一般臨床資料比較

結(jié)果顯示，死亡組年齡≥60歲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)至肌層、腫瘤直徑＞3 cm、PD-1陽性表達(dá)、IL-1β高水平和TNF-α高水平患者比例均高于生存組，IL-6高水平患者比例低于生存組，組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見表1。

表1 2組一般臨床資料的比較［n（%）］Tab.1 Comparison of general clinical data between the two groups［n（%）］

2.2 Cox多因素回歸分析影響患者術(shù)后死亡的危險(xiǎn)因素

將表1中2組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的因素帶入Cox多因素回歸分析模型中分析，結(jié)果顯示，浸潤(rùn)至肌層、腫瘤直徑＞3 cm、IL-1β高水平和PD-1陽性表達(dá)為影響患者術(shù)后死亡的危險(xiǎn)因素。見表2。

表2 Cox多因素回歸分析影響患者術(shù)后死亡的危險(xiǎn)因素Tab.2 Cox multivariate regression analysis of risk factors for postoperative mortality in patients

2.3 IL-1β高水平且PD-1陽性表達(dá)對(duì)患者生存率的影響

IL-1β正常水平+PD-1陰性組、IL-1β高水平+PD-1陽性組和IL-1β正常水平+PD-1陽性組/IL-1β高水平+PD-1陰性組患者的3年生存率分別為92.4%、13.3%和84.2%，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=82.318，P＜0.01），且IL-1β高水平+PD-1陽性組患者生存率最低，見圖1。

圖1 IL-1β高水平且PD-1陽性表達(dá)對(duì)患者生存率的影響Fig.1 The effect of high level of IL-1β and positive expression of PD-1 on the survival rate of patients

3 討論

食管癌是最嚴(yán)重的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，惡性潛能高，預(yù)后較差，我國(guó)亦是食管癌的高發(fā)國(guó)家［7］。研究［8］顯示，晚期食管癌接受標(biāo)準(zhǔn)化療的有效性僅為20%～35%，中位生存時(shí)間為6～10個(gè)月，而PD-1抑制劑的3期臨床試驗(yàn)顯示其有望成為食管癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。探究適用于食管癌靶向治療的方案，對(duì)改善患者預(yù)后具有重要的臨床價(jià)值。

IL-1家族通過影響抗原識(shí)別模式和淋巴細(xì)胞功能對(duì)炎癥和免疫反應(yīng)發(fā)揮關(guān)鍵作用。由IL-1β編碼的IL-1β蛋白在人體的急性和慢性炎癥過程中作為一種分泌蛋白發(fā)揮作用。慢性炎癥被認(rèn)為是致癌、腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志之一，可引發(fā)各種腫瘤的發(fā)展，如肝細(xì)胞癌、胃癌及肺癌［9-10］。IL-1β在慢性阻塞性肺病患者的小氣道上皮細(xì)胞中上調(diào)約2～3倍，且影響慢性阻塞性肺病的氣道炎癥，促進(jìn)肺癌的發(fā)生［11］。IL-1β在慢性炎癥向腫瘤誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)變中已經(jīng)發(fā)揮了重要作用。本研究中死亡組患者IL-1β高水平患者比例顯著高于生存組，可見IL-1β高水平是影響患者術(shù)后死亡的危險(xiǎn)因素。

最初，PD-1被確定在凋亡細(xì)胞中高表達(dá)，隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)其是一個(gè)關(guān)鍵的免疫檢查點(diǎn)，調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞的抗原反應(yīng)。隨后的研究［12］發(fā)現(xiàn)臨床腫瘤樣本中PD-L1 異常升高與預(yù)后不良呈正相關(guān)，支持將PD-1通路阻斷應(yīng)用于癌癥治療。PD-L1/PD-1通路是抗腫瘤免疫中的關(guān)鍵免疫檢查點(diǎn)，PD-L1蛋白通常在免疫細(xì)胞和免疫組織中表達(dá)，其表達(dá)在許多癌癥中上調(diào)。癌細(xì)胞表達(dá)的PD-L1可以與癌癥特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表達(dá)的PD-1結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，針對(duì)檢查點(diǎn)的免疫療法在臨床上取得了巨大的成功。本研究結(jié)果顯示，PD-1陽性表達(dá)為影響食管癌患者術(shù)后3年死亡的危險(xiǎn)因素，生存分析結(jié)果顯示，IL-1β高表達(dá)+PD-1陽性的患者生存率僅為13.3%，提示IL-1β高表達(dá)和PD-1陽性表達(dá)促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。

KAPLANOV等［13］研究結(jié)果顯示，IL-1β抑制與抗PD-1可恢復(fù)T 細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫，增強(qiáng)抗腫瘤細(xì)胞免疫，發(fā)揮抗腫瘤活性。研究［14-15］顯示，心血管高風(fēng)險(xiǎn)患者每3個(gè)月接受一次抗IL-1β抗體（卡那單抗）治療，持續(xù)4年，與安慰劑組相比，治療組的肺癌發(fā)病率降低67%，死亡率降低77%。在攜帶 BALB/c的4T1腫瘤中，微環(huán)境IL-1β可減少腫瘤生長(zhǎng)并改善抗腫瘤細(xì)胞免疫參數(shù)，但并未導(dǎo)致完全消退。使用抗IL-1β或抗 PD-1 作為單一藥物治療僅略微減少了腫瘤生長(zhǎng)。阻斷PD-1抗體已被廣泛用于治療上皮癌患者，但只有小部分患者腫瘤持久消退，而抗IL-1β治療與抗PD-1治療相結(jié)合可能是一個(gè)新的治療方向。

綜上所述，IL-1β高水平和PD-1陽性表達(dá)為影響食管癌患者術(shù)后死亡的危險(xiǎn)因素，IL-1β高水平且PD-1陽性患者術(shù)后3年生存率最低，抗IL-1β聯(lián)合抗PD-1治療可能是一個(gè)新的治療方向。