陳陽，高文婷，李肖，姬曉彤，白劍英，2

（1.山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，太原 030001；2.煤炭環(huán)境致病與防治教育部重點實驗室，太原 030001）

雙酚A［2，2-bis（4-hydroxyphenyl）propane，BPA］是一種典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，廣泛用于生產(chǎn)聚碳酸酯和環(huán)氧樹脂等［1-2］。研究［3-7］表明，BPA可增加女性不孕和復(fù)發(fā)流產(chǎn)率，與肥胖、2型糖尿病、肝功能異常的發(fā)生有關(guān)，還可增加患癌癥的風(fēng)險。BPA可通過調(diào)節(jié)脂肪酸從頭合成相關(guān)基因的表達(dá)，影響脂質(zhì)合成［8］，此外，成年小鼠長期接觸BPA會增加其肝臟的脂質(zhì)含量［9］。越來越多的研究［10-11］表明BPA具有毒性作用，因此，BPA的使用已受到限制。近年來，某些結(jié)構(gòu)上類似于BPA的新型化學(xué)物，如雙酚AF［4，4’-（hexafluoroisopropylidene）diphenol，BPAF］、雙酚B［2-bis（4-hydroxyphenyl）butane，BPB］、雙酚S（4-hydroxyphenyl sulfone，BPS）和雙酚F（4，4’-methylenediphenol，BPF）作為BPA的替代品被廣泛使用。研究［12-14］顯示，在水、沉積物等環(huán)境介質(zhì)中均檢測到BPA及類似物。在中國南京高淳區(qū)學(xué)齡前兒童尿樣中，典型雙酚類似物BPA、BPAF、BPF和BPS的總質(zhì)量濃度為2～3 113 ng·L-1，與我國深圳和廣州3～11歲兒童的檢測結(jié)果一致［15］。

由于BPA及其類似物存在化學(xué)結(jié)構(gòu)的相似性，BPA類似物是否安全也受到了廣泛關(guān)注。我國的一項流行病學(xué)研究［16］發(fā)現(xiàn)，暴露于BPS可增加非酒精性脂肪肝（non-alcohol fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率。LIU等［17］研究發(fā)現(xiàn)，部分BPA類似物可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（triglyceride，TG）合成增多。因此，BPA類似物對肝細(xì)胞脂代謝的作用值得深入研究。本研究擬觀察BPA、BPAF、BPB和BPS染毒HL-7702細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況、TG含量及TG合成相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，以探討B(tài)PA、BPAF、BPB和BPS是否引起肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積，為制定BPA及其類似物的環(huán)境衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人正常肝細(xì)胞株HL-7702，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)秦緒軍教授惠贈。

1.1.2 主要儀器：Galaxy 170S CO2培養(yǎng)箱（德國Eppendorf公司），Model 680型酶標(biāo)儀（美國Bio-rad公司），UV-2450型紫外分光光度儀（上海納諾儀器有限公司），line gene 9600型熒光定量PCR儀（杭州BIOER科技有限公司），HFsafe-1200型生物安全柜［力新儀器（上海）有限公司］，高速低溫離心機(jī) Neofuge 15R［力新儀器（上海）有限公司］，倒置熒光顯微鏡 BX51（日本 Olympus 公司）。

1.1.3 主要試劑：BPA、BPAF、BPB、BPS（上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司），DMEM高糖培養(yǎng)基（上海金畔生物科技有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），二甲基亞砜、胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司），BCA 試劑盒（武漢博士德生物有限公司），油紅O粉末（美國Sigma公司），TG試劑盒（南京建成生物工程研究所），PCR引物（上海生工生物工程股份有限公司），SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（上海翌圣生物科技有限公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒Primer Script RT MASTER Mix、RNA提取試劑RNAiso Plus（日本TaKaRa公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將人正常肝細(xì)胞HL-7702接種于DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組及染毒：選取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板并培養(yǎng)。待細(xì)胞密度約達(dá)80%時，將細(xì)胞隨機(jī)分為6組，分別為空白對照組，溶劑對照（0.1% DMSO）組，油酸（1 mmol/L OA）組，1、10、50 μmol/L BPA、BPAF、BPB和 BPS組。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實驗。

1.2.3 油紅O染色：選取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中，按上述分組進(jìn)行染毒，染毒時每組設(shè)置3個平行孔，染毒24 h后，用PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，加入60%異丙醇浸洗5 min，加入油紅O工作液浸染20 min（常溫避光），加入蘇木素復(fù)染核1 min，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴的情況，并采集圖像。

1.2.4 GPO-PAP酶法測定細(xì)胞內(nèi)TG含量：細(xì)胞染毒24 h，用PBS漂洗2次，胰酶消化后，加入1 mL PBS緩沖液制成細(xì)胞懸液，其中250 μL于1 000 r/min離心10 min后棄上清，用BCA法測定蛋白濃度，其余750 μL用于測定TG含量。按照文獻(xiàn)［18］的方法，用異丙醇、己烷、乙醚等有機(jī)溶劑抽提細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)。按試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行測定。

1.2.5 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）測定肝細(xì)胞內(nèi)TG合成相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

染毒結(jié)束后，用PBS清洗細(xì)胞2次，加入適量的RNAiso裂解細(xì)胞，提取RNA。用超微量紫外分光光度儀檢測總 RNA 濃度和純度，純度范圍為 1.8～2.2。采用20 μL體系反轉(zhuǎn)錄，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。以2 μL cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參，使用Line Gene 9600熒光定量PCR儀檢測TG合成相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。PCR引物序列見表1。

表1 相關(guān)基因引物序列Tab.1 Related gene primer sequences

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 油紅O染色結(jié)果

如圖1所示，空白對照組與溶劑對照組細(xì)胞內(nèi)未見紅色脂滴，1 mmol/L OA組細(xì)胞內(nèi)可見有大量紅色脂滴，且紅色脂滴圍繞細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)邊緣呈環(huán)狀分布，說明HL-7702脂肪變性模型建立成功，可作為陽性對照。與空白對照組和溶劑對照組相比，1、10、50 μmol/L BPA組、BPAF組、BPB組和BPS組細(xì)胞內(nèi)均可觀察到大小不等的紅色脂滴。

2.2 細(xì)胞內(nèi)TG含量

如圖2所示，處理HL-7702細(xì)胞24 h，與空白對照組和溶劑對照組相比，1 mmol/L OA組細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯增加（P＜0.05）；1、50 μmol/L BPA組，10、50 μmol/L BPAF組，1、10、50 μmol/L BPB組和50 μmol/L BPS組細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯增加（P＜0.05）。

圖2 BPA及其類似物染毒后肝細(xì)胞內(nèi)TG含量（n=3）Fig.2 Triglyceride content in liver cells after exposure to BPA and its analogues（n=3）

2.3 TG合成相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

如圖3所示，處理HL-7702細(xì)胞24 h，與空白對照組和溶劑對照組相比，10 μmol/L BPAF組，1、10 μmol/L BPS組細(xì)胞LIPIN2mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05），與空白對照組相比，10 μmol/L BPB組細(xì)胞內(nèi)LIPIN2mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與溶劑對照組相比，50 μmol/L BPAF組、50 μmol/L BPB組細(xì)胞內(nèi)LIPIN2mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）。

圖3 BPA及其類似物染毒后肝細(xì)胞內(nèi)LIPIN2 mRNA表達(dá)水平的變化（n=3）Fig.3 Changes in LIPIN2 mRNA expression levels in liver cells after exposure to BPA and its analogues（n=3）

如圖4所示，處理HL-7702細(xì)胞24 h，與空白對照組和溶劑對照組相比，50 μmol/L BPA組、10 μmol/L BPAF組、50 μmol/L BPB組和1 μmol/L BPS組細(xì)胞內(nèi)DGAT2mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與空白對照相比，1 mmol/L OA組細(xì)胞內(nèi)DGAT2mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05），10 μmol/L BPB組細(xì)胞內(nèi)DGAT2mRNA表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與溶劑對照組相比，10 μmol/L BPA組細(xì)胞內(nèi)DGAT2mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）。

圖4 BPA及其類似物染毒后肝細(xì)胞內(nèi)DGAT2 mRNA表達(dá)水平的變化（n=3）Fig.4 Changes in the expression level of DGAT2 mRNA in liver cells after exposure to BPA and its analogues（n=3）

3 討論

BPA及其類似物不僅對神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)具有毒性作用，而且對肝臟脂代謝也有一定的影響。但目前關(guān)于BPA及其類似物對肝臟脂代謝的研究還較少見。

本研究中，油紅O染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，1 mmol/L OA 組細(xì)胞內(nèi)有明顯的脂肪蓄積，脂滴數(shù)量較多，且大小不等，圍繞細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)邊緣呈環(huán)狀分布，說明油酸用于建立HL-7702細(xì)胞脂肪變性模型成功。BPA、BPAF、BPB和BPS染毒不同劑量組細(xì)胞內(nèi)均可觀察到大小不等的紅色脂滴，說明不僅是BPA，BPA類似物也可導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂肪蓄積。TG含量測定發(fā)現(xiàn)，與空白和溶劑對照組相比，1、50 μmol/L BPA組，10、50 μmol/L BPAF組，1、10、50 μmol/L BPB組和50 μmol/L BPS組細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯增加，其余各劑量組細(xì)胞內(nèi)TG含量也有增加的趨勢。因此，形態(tài)學(xué)觀察和定量分析都表明BPA及其類似物BPAF、BPB和BPS均可導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂肪蓄積，TG含量增加。

LIPIN家族蛋白具有磷脂酸磷酸酶活性，在脂質(zhì)合成中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞內(nèi)脂肪酸水平升高時，存在于細(xì)胞質(zhì)中的LIPIN蛋白轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER），與磷脂酸（phosphatidic acid，PA）結(jié)合，并催化PA去磷酸化，促進(jìn)甘油二酯（diacylglycerol，DAG）合成［19］。卞京等［20］研究發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)發(fā)育遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR）大鼠肝臟中LIPIN2mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，可引起肝臟脂肪含量增加。孕期營養(yǎng)限制導(dǎo)致后代脂肪組織增多，脂肪細(xì)胞中LIPIN1和LIPIN2的過度表達(dá)導(dǎo)致TG積累增加［21］。賀真等［22］用MEHP處理人肝癌HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LIPIN2基因的高表達(dá)使細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯增加，其高表達(dá)為細(xì)胞內(nèi)TG合成的最后一步提供了更多的底物。二?；视王；D(zhuǎn)移酶（diacylglycerol acyltransferase，DGAT）是催化TG合成最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶。DGAT2過表達(dá)使野生小鼠肝臟內(nèi)TG含量增加［23］。ZHANG等［24］研究發(fā)現(xiàn)，DGAT2過表達(dá)可刺激牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞中脂滴形成和TG積累。研究［20］發(fā)現(xiàn)，DGAT2mRNA表達(dá)水平升高可促進(jìn)HepG2細(xì)胞內(nèi)TG合成增加。本研究中，BPA及其類似物染毒細(xì)胞24 h后，與空白對照組比較，10 μmol/L BPAF組，10 μmol/L BPB組，1、10 μmol/L BPS組細(xì)胞內(nèi)LIPIN2mRNA表達(dá)水平明顯升高，50 μmol/L BPA組，10 μmol/L BPAF組，10、50 μmol/L BPB組和1 μmol/L BPS組細(xì)胞內(nèi)DGAT2mRNA表達(dá)水平均明顯升高。BPAF、BPB和BPS均可通過上調(diào)LIPIN2和DGAT2mRNA表達(dá)促進(jìn)TG合成增加。BPA僅上調(diào)DGAT2mRNA表達(dá)，說明BPA類似物影響肝細(xì)胞TG合成的途徑可能更廣泛，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)BPA可能通過上調(diào)DGAT2mRNA的表達(dá)促進(jìn)TG合成的增加，導(dǎo)致人正常肝細(xì)胞內(nèi)脂肪蓄積。不僅如此，BPAF、BPB及BPS還可能通過上調(diào)LIPIN2mRNA的表達(dá)提供更多的DAG，進(jìn)一步導(dǎo)致TG合成的增加，因此，BPA替代物的安全性值得進(jìn)一步探討。