胡明亮

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院胃腸營養(yǎng)外科，沈陽 110004）

肺癌是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，致死率居惡性腫瘤首位［1］。糖尿病患者的腫瘤發(fā)生率遠(yuǎn)高于非糖尿病人群，且預(yù)后較差。高血糖是各類腫瘤發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素［2］，與結(jié)直腸癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展甚至死亡密切相關(guān)［3-6］，但目前糖尿病與肺癌的關(guān)系仍不明確［7］。因此，探討高糖微環(huán)境對肺癌細(xì)胞增殖的影響，并深入揭示其分子機(jī)制，對指導(dǎo)高危人群的自我防范、開拓治療肺癌的新方法具有重要意義。

炎癥和持續(xù)性感染在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、惡性轉(zhuǎn)化、侵襲、轉(zhuǎn)移等不同階段均起關(guān)鍵作用。炎癥小體是一類大分子多蛋白復(fù)合物，是介導(dǎo)機(jī)體多種炎癥反應(yīng)的重要信號。Nod樣受體蛋白3（Nod like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體被活化后，促使無活性的pro-caspase-1生成有活性的caspase-1，并切割白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-18前體，生成有活性的IL-1β和IL-18并釋放到細(xì)胞外，啟動炎癥相關(guān)的細(xì)胞程序性死亡［8］，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9］。本研究利用高糖培養(yǎng)基模擬高血糖微環(huán)境，以特異性PPAR-γ激活劑羅格列酮和NLRP3炎癥小體激動劑尼日利亞菌素鈉鹽（Nigericin sodium salt，NSS）處理人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞，探究PPAR-γ對高糖微環(huán)境下NCI-H460細(xì)胞增殖的影響，探討高糖微環(huán)境下肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為肺癌的精準(zhǔn)診療提供新的靶點(diǎn)和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫），1640培養(yǎng)基［以色列Biological Industries（BI）公司］，胎牛血清（美國Hyclone公司），CCK-8試劑盒（美國Abbkine公司），葡萄糖、甘露醇、DMSO（美國Sigma公司），羅格列酮（美國MCE公司），NSS（美國GLPBIO公司），BCA蛋白濃度檢測試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)有限公司），NLRP3抗體、caspase-1抗體（美國Abcam公司），IL-1β抗體、IL-18抗體（美國Abbkine公司），PPAR-γ抗體、GAPDH抗體（美國Proteintech公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)NCI-H460細(xì)胞。待細(xì)胞生長至80%～90%后，0.5%胰蛋白酶消化，按1 ∶2傳代培養(yǎng)。分別用5.5 mmol/L葡萄糖（空白組）、5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇（高滲對照組）和30 mmol/L 葡萄糖（高糖組）培養(yǎng)基處理NCI-H460細(xì)胞，用終濃度為20 μmol/L的羅格列酮或終濃度為10 μmol/L NSS處理細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，加入等量的DMSO作為對照組。

1.2.2 CCK-8法測定細(xì)胞增殖能力：收集各組NCI-H460細(xì)胞，并制成單細(xì)胞懸液，以2×103/孔接種于96孔板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)（0、24、48、72 h），加入CCK-8溶液10 μL/孔，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，利用多功能酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度（optical density，OD）值，并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：各組NCI-H460細(xì)胞處理后，胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，以2×103/孔接種于6孔板中，反復(fù)吹打并搖勻，使細(xì)胞均勻分散，繼續(xù)培養(yǎng)至＞50個細(xì)胞/集落，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下計(jì)數(shù)并分析集落形成數(shù)。

1.2.4 Western blotting：各組NCI-H460細(xì)胞處理后，RIPA常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定蛋白濃度。蛋白充分變性，取30 μg行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，100 V 50 min轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入NLRP3抗體、caspase-1抗體、IL-18抗體、IL-1β抗體、PPAR-γ抗體（1 ∶1 000稀釋）及GAPDH抗體（1 ∶2 000稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，相應(yīng)二抗（1 ∶5 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST洗膜后，ECL發(fā)光，Bio-rad凝膠成像分析儀掃描分析蛋白豐度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均由3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果的±s表示，采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖微環(huán)境對NCI-H460細(xì)胞增殖的影響

CCK-8及平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組和高滲對照組相比，30 mmol/L高糖處理72 h并培養(yǎng)24 h后，高糖組NCI-H460細(xì)胞OD值顯著升高（圖1A），克隆形成體積更大、數(shù)量更多（圖1B），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），說明高糖微環(huán)境能夠提高人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞的增殖能力。

圖1 高糖微環(huán)境對人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞增殖的影響Fig.1 The effect of high-glucose microenvironment on proliferation of human large cell lung cancer NCI-H460 cell

2.2 高糖微環(huán)境對NCI-H460細(xì)胞炎癥小體的影響

Western blotting結(jié)果顯示，與空白組和高滲對照組比較，30 mmol/L高糖處理72 h后，高糖組NLRP3、caspase-1及活性IL-18、IL-1β表達(dá)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），提示高糖微環(huán)境能夠誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活性升高。見圖2。

圖2 高糖微環(huán)境對人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞炎癥小體的影響Fig.2 The effect of high-glucose microenvironment on NLRP3 inflammasome of human large cell lung cancer NCI-H460 cell

2.3 高糖微環(huán)境對NCI-H460細(xì)胞PPAR-γ蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示，與空白組和高滲對照組相比，30 mmol/L高糖處理72 h后，PPAR-γ蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），提示高糖微環(huán)境可能通過PPAR-γ調(diào)控NLRP3炎癥小體的活性。見圖3。

圖3 高糖微環(huán)境對人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞PPAR-γ蛋白的影響Fig.3 The effect of high-glucose microenvironment on PPAR-γ protein of human large cell lung cancer NCI-H460 cell

2.4 羅格列酮對高糖微環(huán)境下NCI-H460細(xì)胞炎癥小體的影響

用特異性PPAR-γ激活劑羅格列酮刺激高糖微環(huán)境下的NCI-H460細(xì)胞，分析NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在高糖微環(huán)境下羅格列酮能夠顯著下調(diào)NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），提示PPAR-γ能有效抑制NLRP3炎癥小體的活性。見圖4。

圖4 羅格列酮對高糖微環(huán)境下人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞炎癥小體的影響Fig.4 The effect of rosiglitazone on NLRP3 inflammasome of human large cell lung cancer NCI-H460 cell in high-glucose microenvironment

2.5 羅格列酮對高糖微環(huán)境下NCI-H460細(xì)胞增殖的影響

利用CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒和平板克隆技術(shù)分析高糖微環(huán)境下PPAR-γ對NCI-H460細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，與高糖組相比，30 mmol/L高糖+PPAR-γ處理72 h后，NCI-H460細(xì)胞OD值在48 h后顯著降低（圖5A），克隆形成體積更小、數(shù)量更少（圖5B），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01），說明PPAR-γ能夠抑制高糖微環(huán)境下NCI-H460細(xì)胞的增殖。

圖5 羅格列酮對高糖微環(huán)境下人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞增殖的影響Fig.5 The effect of rosiglitazone on proliferation of human large cell lung cancer NCI-H460 cell in high-glucose microenvironment

2.6 PPAR-γ通過抑制NLRP3炎癥小體影響高糖微環(huán)境下NCI-H460細(xì)胞增殖

應(yīng)用NLRP3炎癥小體激動劑NSS聯(lián)合羅格列酮處理30 mmol/L高糖培養(yǎng)的NCI-H460細(xì)胞并分析細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，與30 mmol/L高糖+PPAR-γ組相比，高糖+PPAR-γ+NSS組NCI-H460細(xì)胞OD值在48 h后顯著升高，形成克隆體積更大、數(shù)量更多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。提示NLRP3炎癥小體激動劑NSS能逆轉(zhuǎn)高糖微環(huán)境下PPAR-γ對NCI-H460細(xì)胞增殖的抑制作用。見圖6。

圖6 NLRP3炎癥小體介導(dǎo)PPAR-γ在高糖微環(huán)境下抑制NCI-H460細(xì)胞增殖Fig.6 NLRP3 inflammasome mediates inhibition of PPAR-γ on the proliferation of NCI-H460 cells in high-glucose microenvironment

3 討論

研究［10-12］表明，血糖升高與腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、病情進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。目前普遍認(rèn)為，高血糖、高胰島素血癥、慢性炎癥、脂質(zhì)代謝紊亂及性激素水平異?？赡苁翘悄虿』颊吣[瘤高發(fā)的主要危險(xiǎn)因素，然而其分子機(jī)制尚不明確。因此，積極尋找有效的生物學(xué)靶點(diǎn)，對避免腫瘤發(fā)生、延緩腫瘤發(fā)展、輔助腫瘤治療具有重要的臨床意義。

葡萄糖是腫瘤生長的能量來源，本研究利用高糖（30 mmol/L葡萄糖）培養(yǎng)基模擬體內(nèi)高血糖微環(huán)境處理人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖微環(huán)境可顯著增強(qiáng)NCI-H460細(xì)胞的增殖能力。研究［13］表明，糖尿病可能通過多種機(jī)制影響腫瘤進(jìn)展，并可能成為肺癌預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素［14］，其中，炎癥是最重要的機(jī)制之一。炎癥和持續(xù)性感染可能導(dǎo)致各種惡性腫瘤的發(fā)生［15-16］，越來越多的證據(jù)表明炎癥在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、血管生成和侵襲中發(fā)揮著重要的作用［17-18］。NLRP3炎癥小體與炎癥性疾病、代謝性疾病、自身免疫性疾病及腫瘤等的發(fā)生密切相關(guān)。NLRP3炎癥小體的效應(yīng)分子IL-1β和IL-18參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖微環(huán)境可顯著提高NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白如NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表達(dá)，提示高糖微環(huán)境下炎癥小體被激活，可能參與了高糖微環(huán)境對腫瘤的影響。

高糖微環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞增殖旺盛，合理降糖對肺癌的治療具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)，胰島素可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和分化，并引起化療耐藥，而治療2型糖尿病的一線口服藥物PPAR-γ配體激動劑羅格列酮不僅能夠有效降低血糖，同時(shí)還具有抗腫瘤作用。PPAR-γ具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成等抗腫瘤作用，可降低腫瘤的發(fā)病率和死亡率，但具體分子機(jī)制尚不清楚［19］。在晚期前列腺癌、卵巢癌、前列腺癌和睪丸癌等腫瘤中，PPAR-γ表達(dá)水平較高［20-23］，但高水平PPAR-γ在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。臨床研究［24］發(fā)現(xiàn)，高PPAR-γ水平對結(jié)腸癌、宮頸癌、濾泡性甲狀腺癌和食道癌預(yù)后有益。體外研究［24-26］發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ過表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤生長，而沉默PPARγ則逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。研究表明，PPAR-γ天然配體15-脫氧-Δ-前列腺素 J2（15-deoxy-Δ-prostaglandin J2，15d-PGJ2）可通過抑制NF-κB誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。合成的PPAR-γ配體，如阿格列酮、曲格列酮和西格列酮，可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡抑制腫瘤生長［23］。此外，西格列酮能夠提高順鉑對卵巢癌的治療效果。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖微環(huán)境下PPAR-γ蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。PPAR-γ通過抑制NLRP3炎癥小體活性發(fā)揮抗炎作用，為了明確PPAR-γ是否通過NLRP3炎癥小體影響高糖微環(huán)境下肺癌細(xì)胞的增殖能力，本研究利用PPAR-γ激活劑羅格列酮處理高糖微環(huán)境下NCI-H460細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羅格列酮能有效抑制NLRP3炎癥小體的活性、下調(diào)NCI-H460細(xì)胞的增殖能力，而這一作用可被NLRP3炎癥小體激動劑逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果提示，在高糖微環(huán)境下，PPAR-γ通過下調(diào)NLRP3炎癥小體，抑制NCI-H460細(xì)胞增殖。

綜上所述，本研究利用30 mmol/L葡萄糖處理人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞，探討高糖微環(huán)境下肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。結(jié)果顯示，PPAR-γ通過抑制NLRP3炎癥小體活性，減少高糖微環(huán)境下NCI-H460細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。以上結(jié)果為指導(dǎo)肺癌合并糖尿病患者的治療奠定了理論基礎(chǔ)。