姚秀琪,韋礱,覃慶婷,何深怡,吳海嬌,凌紹明

(百色學院 化學與環(huán)境工程學院,廣西 百色 533000)

亞硝酸鹽是一種存在于水、土壤和生物體內(nèi)的無機化合物,在農(nóng)業(yè)和工業(yè)中常用作防腐劑和添加劑[1]。然而,亞硝酸鹽離子可以作為亞硝胺和亞硝酸化合物的前體,這些物質(zhì)會致癌和誘變,因此攝入大量亞硝酸鹽會嚴重損害人體健康[2-3]。此外,亞硝酸鹽是氮循環(huán)的活性中間體之一,可作為評價氮循環(huán)氧化和還原步驟平衡狀態(tài)的重要指標[4]。亞硝酸鹽離子也是水質(zhì)污染程度的一個指標,世界衛(wèi)生組織建議[4]雨水中亞硝酸鹽的最高含量為3 mg·L-1。對飲用水,歐洲監(jiān)管機構[5]將亞硝酸鹽的最大允許含量定為0.1 mg·L-1。因此,亞硝酸鹽的定量分析對水質(zhì)安全和食品安全監(jiān)測具有重要的意義。目前,檢測亞硝酸根的方法主要有液相色譜法[6]、熒光法[7]、分光光度法[8]、化學發(fā)光法[9]、電化學法[10-11]、離子色譜法[12-13]、共振瑞利散射光譜法[14]和表面增強拉曼光譜法[15]等。

上述檢測NO2-方法,各有優(yōu)勢與不足。如碳量子點熒光法[7]檢測亞硝酸根借助碳點與NO2-的專一作用機制,也就是說一份分析物只能生成一份信號,靈敏度偏低的問題還是存在[16]。對一對一檢測方法而言,催化熒光分析法得到極大關注,極少量催化劑的引入能夠帶來較多的生成物,致使熒光信息發(fā)生擴增作用,從而較大幅度地提高檢測靈敏度[17]。廖雪鳳等[18]利用NO2-催化溴酸鉀氧化過量碘化鉀生成I3-,借助I3-的刻蝕作用導致BSA保護的納米金熒光減少原理,建立催化熒光法檢測NO2-。該法靈敏度高、選擇性好,但是熒光材料的制備與純化過程復雜,檢測費時。

近年來,基于納米材料模擬酶的催化活性成為放大檢測信號的重要手段,實現(xiàn)了痕量物質(zhì)的高靈敏測定。研究發(fā)現(xiàn),金屬及其氧化物、貴金屬納米團簇、石墨烯及金屬硫化物納米片等具有過氧化物酶催化活性,這種納米材料統(tǒng)稱為“納米酶”[19-20]。納米酶在催化活性、表面電荷、形貌和尺寸上與天然過氧化物酶極為相似,具有價廉、穩(wěn)定、易合成等優(yōu)點,在生物醫(yī)學檢測、環(huán)境監(jiān)測以及食品安全等領域應用廣泛。如Wang等[21]基于金屬有機骨架(MOF)[Cu(PDA)(DMF)]的過氧化物酶活性,實現(xiàn)人尿中多巴胺的檢測。吳亮亮等[22]通過表面修飾Ag/Pt復合納米簇,用于調(diào)控納米酶的催化活性,實現(xiàn)對環(huán)境水樣中痕量Cu2+的快速測定。因此,豐富和發(fā)展NO2-的檢測新技術,降低檢測成本、提高檢測速度和靈敏度以及在線檢測能力已成為急需解決的科學問題。

根據(jù)催化反應能夠增強檢測信號的作用[17],本工作擬將亞硝酸根的催化氧化反應和金納米酶的催化顯色反應相結合,組建“雙催化反應體系”以期提高檢測NO2-的靈敏度,探索建立一種快速、靈敏度高的、操作簡便的比色分析法。即:利用亞硝酸根催化溴酸鉀氧化過量的碘化鉀生成I3-,基于I3-對半胱胺保護的金納米粒子(cyst-AuNPs)的刻蝕作用,調(diào)控了cyst-AuNPs催化“過氧化氫與四甲基聯(lián)苯胺(TMB)反應”的催化活性,探索建立一種檢測NO2-的新型比色探針。

1 實驗部分

1.1 主要儀器

日本島津公司生產(chǎn)的2700型紫外可見分光光度計;北京格瑞恩科技發(fā)展公司生產(chǎn)的SY-1220型恒溫水浴箱;上海梅特勒-托利多儀器有限公司生產(chǎn)的ME204電子分析天平;美國Miliipore公司生產(chǎn)的Driect-55UV型純水機。

1.2 主要試劑及配制方法

亞硝酸根標準儲備液:0.16 mg·mL-1,準確稱取0.060 1 g亞硝酸鈉(優(yōu)級純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司),用超純水溶解后定容于250 mL茶色容量瓶,搖勻,冰箱保存;亞硝酸標準工作液:1.0 μg?mL-1,移取62.5 μL亞硝酸根儲備液于10 mL比色管中,加超純水至刻度,現(xiàn)配現(xiàn)用;氯金酸:2.4×10-2mol?L-1;半胱胺鹽酸鹽(cyst):213 mmol?L-1;3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)乙醇溶液:10 mmol?L-1;NaAc水溶液:0.20 mol?L-1;HAc水溶液:0.20 mol?L-1;pH值=4.0 NaAc-HAc緩沖溶液:取18.0 mL 0.20 mol?L-1NaAc水溶液和82.0 mL 0.20 mol?L-1HAc水溶液混合而得;過氧化氫儲備液:0.10 mol?L-1,現(xiàn)配現(xiàn)用;過氧化氫工作液:1.0×10-3mol?L-1,現(xiàn)配現(xiàn)用;硼氫化鈉水溶液:10 mmol?L-1,現(xiàn)配現(xiàn)用;KBrO3水溶液:0.10 mol?L-1;H2SO4水溶液:0.10 mol?L-1;KI水溶液:0.40 mol?L-1。

1.3 cyst-AuNPs的合成

參照文獻[23]合成,并做些改動。向潔凈的三角瓶中加入2.34 mL濃度為2.4×10-2mol?L-1的氯金酸,補加超純水40 mL,放入攪拌子攪拌,向燒杯中加入500 μL濃度為213 mmol?L-1的半胱胺鹽酸鹽溶液,繼續(xù)攪拌20 min后,逐滴加入90 μL濃度為10 mmol?L-1硼氫化鈉水溶液,滴加完畢繼續(xù)攪拌15 min,得酒紅色溶液,無菌密封冰箱保存。

1.4 實驗方法

在5.0 mL離心管中依次加入NO2-標準工作液、0.10 mol?L-1H2SO4水溶液120 μL、0.10 mol?L-1KBrO3水溶液50 μL、0.40 mol?L-1KI水溶液200 μL,用超純水稀釋至1.0 mL,并做空白試液(A0)。室溫下孵育時間(t1)30 min后,加入100 μL cyst-AuNPs溶液,預孵育時間(t2)15 min,再依次加入550 μL NaAc-HAc緩沖溶液(pH值4.0,0.20 mol?L-1)、300 μL 10 mmol?L-1TMB、200 μL 1.0×10-3mol?L-1過氧化氫,定容至3.0 mL,于30 ℃水浴中反應時間(t3)30 min,測定655 nm處吸光度值A,計算ΔA=A0-A。

2 結果與討論

2.1 cyst-AuNPs的吸收光譜及催化活性

圖1是cyst-AuNPs吸收光譜圖。制得的cyst-AuNPs呈現(xiàn)酒紅色,在521 nm處有強吸收,吸收峰的半峰寬較窄,初步說明合成的cyst-AuNPs顆粒均勻,穩(wěn)定性好。

圖1 cyst-AuNPs的吸收光譜圖

圖2是不同體系的吸收光譜圖。TMB獨立存在時無明顯吸收峰(見圖2曲線1),TMB與過氧化氫反應后體系在655 nm處有TMB氧化態(tài)的特征吸收峰,但是強度弱(見圖2曲線2),這是因為TMB與過氧化氫反應極為緩慢。加入cyst-AuNPs后,體系在655 nm處的吸收值明顯增大(見圖2曲線5),溶液微深藍色,說明cyst-AuNPs能夠有效催化過氧化氫氧化TMB。當體系存在不同質(zhì)量濃度NO2-時,體系在655 nm處的吸收降低,并且隨著NO2-質(zhì)量濃度的增加體系吸收值減小(見圖2曲線3與4)。這是因為隨著NO2-質(zhì)量濃度的增加,體系生成的I3-增多,導致有更多的cyst-AuNPs被刻蝕,引起cyst-AuNPs催化活性降低。

1.TMB;2.H2SO4+KBrO3+KI+NaAc-HAc+TMB+H2O2;3.H2SO4+KBrO3+KI+cyst-AuNPs+NaAc-HAc+TMB+H2O2+0.108 μg?mL-1 NO2-;4.H2SO4+KBrO3+KI+cyst-AuNPs+NaAc-HAc+TMB+H2O2+0.033 3 μg?mL-1 NO2-;5.H2SO4+KBrO3+KI+cyst-AuNPs+NaAc-HAc+TMB+H2O2+0.00 μg?mL-1 NO2-;cyst-AuNPs:100 μL+TMB:1.0 mmol?L-1 +H2O2:0.066 7 mmol?L-1 +pH值4.0

cyst-AuNPs:100 μL+TMB:1.0 mmol?L-1 +H2O2:0.066 7 mmol?L-1 +pH值4.0+NO2-(a到i:0,0.008 33,0.016 7,0.025 0,0.033 3,0.041 7,0.075 0,0.108,0.142 μg?mL-1)

圖3是有不同NO2-質(zhì)量濃度時體系的吸收光譜圖。由圖3可見,隨著NO2-質(zhì)量濃度增加,體系產(chǎn)生的I3-越多,有更多的金納米粒子被刻蝕,金納米粒子模擬酶催化活性被抑制,TMB被氧化的數(shù)量減少,體系在655 nm處的吸收值減小,體系的吸收值線性下降。實驗選擇655 nm為測定波長。

2.2 測定條件優(yōu)化

研究表明,痕量的NO2-對溴酸鉀氧化碘化鉀有強烈的催化作用[24],當有過量碘化鉀存在時,體系形成I3-,I3-對cyst-AuNPs有刻蝕作用,引起cyst-AuNPs模擬酶的催化活性被抑制。本工作主要對cyst-AuNPs模擬酶的催化反應條件進行優(yōu)化。

2.2.1 cyst-AuNPs溶液用量影響

固定其他條件,通過改變cyst-AuNPs溶液用量以考察cyst-AuNPs溶液用量對測定體系影響,結果見圖4。

圖4 cyst-AuNPs溶液用量影響

由圖4可見,隨著cyst-AuNPs溶液用量增加,體系的吸光度差值逐漸增大,當用量為100 μL時,吸光度差值達到最大值,此時測定靈敏度最高;隨后吸光度差值增長比較緩慢,因此實驗選擇cyst-AuNPs溶液用量為100 μL。

2.2.2 緩沖溶液pH值影響

固定其他條件,改變緩沖溶液pH值以考察緩沖溶液pH值的影響,結果見圖5。

圖5 緩沖溶液pH值影響

由圖5可見,隨著pH值增大,體系的吸光度差值快速增大,但當pH值=4時,體系的吸光度差值開始迅速下降。這是因為酸性環(huán)境能夠保持cyst-AuNPs表面形成大量的正電荷而維持其穩(wěn)定性,pH值增大,cyst-AuNPs表面電荷減少,穩(wěn)定性降低,影響cyst-AuNPs催化活性。所以實驗取緩沖溶液pH值=4比較合適。

2.2.3 緩沖溶液用量影響

固定其他條件,改變緩沖溶液用量以考察緩沖溶液用量的影響,結果見圖6。

圖6 緩沖溶液用量影響

由圖6可見,用量400～550 μL時,吸光度差值逐漸上升。當緩沖溶液的用量大于550 μL時,吸光度差值開始降低,所以緩沖溶液用量取550 μL比較合適。

2.2.4 TMB用量影響

固定其他條件,改變TMB用量以考察其對體系的影響,結果見圖7。

圖7 TMB用量影響

由圖7可見,TMB的用量為150～270 μL時,吸光度差值增長的比較的快,300 μL以后,吸光度差值增加的比較緩慢。所以TMB用量取300 μL比較合適。

2.2.5 H2O2用量影響

固定其他條件,改變H2O2用量以考察其對體系的影響,結果見圖8。

圖8 過氧化氫用量影響

由圖8可見,過氧化氫的用量為200 μL之前時,吸光度差值逐漸增長,到200 μL以后,吸光度差值逐漸減小。所以過氧化氫用量200 μL比較合適。

2.2.6 溫度的影響

固定其他條件,通過改變納米酶催化反應溫度以考察其對體系的影響,結果見圖9。

圖9 納米酶催化反應溫度的影響

由圖9可見,納米酶催化反應溫度為20～30 ℃時,吸光度差值逐漸遞增,到30 ℃以后,吸光度差值開始減小。這是因為較高溫度下會加快過氧化氫分解,cyst-AuNPs活性降低。所以實驗取30 ℃比較合適。

2.2.7 時間(t3)影響

固定其他條件,通過改變納米酶催化反應時間(t3)以考察其對體系的影響,結果見圖10。

圖10 納米酶催化反應時間(t3)影響

由圖10可見,反應時間(t3)30 min之前,吸收光差值逐漸遞增,當30 min之后,吸收光差值趨于平緩。隨著反應時間的進行,體系生成的I3-增多,導致有更多的cyst-AuNPs被刻蝕,引起cyst-AuNPs催化活性降低。當30 min時,反應基本完成了。

2.3 線性方程及檢出限

參照實驗方法,分別測定不同質(zhì)量濃度NO2-(0,0.008 33,0.016 7,0.025 0,0.033 3,0.041 7,0.075 0,0.108,0.142 μg?mL-1),測定不同質(zhì)量濃度NO2-的吸收值A,計算ΔA,結果發(fā)現(xiàn)ΔA值與體系不同質(zhì)量濃度NO2-有較好線性關系,檢測方法的線性方程為ΔA= 0.024 9 + 3.474ρ,相關系數(shù)R2為0.987 7,線性范圍為0.008 33～0.142 μg?mL-1,檢出限(3S/K)為0.005 8 μg?mL-1。

2.4 干擾實驗

實驗對常見共存物質(zhì)進行干擾實驗。當NO2-含量為0.075 μg?mL-1,相對誤差在10%以內(nèi)時,1 000倍的K+、Na+、Ca2+、Mg2+、F-、Cl-、Br-、NO3-、CO32-、HPO42-、H2PO4-、Ac-;500倍的Zn2+、Pb2+;300倍的Mn2+、Al3+、Ni2+;100倍的Cd2+;50倍的V(Ⅴ);25倍的Fe3+;10倍的Cu2+;5倍的Hg2+、Ag+不干擾NO2-檢測。

2.5 樣品測定

水樣品經(jīng)過濾后,取適量樣品用本法進行測定,并做加標試驗,結果見表1。

表1 樣品測定及加標試驗結果

本法測定結果與國標法[25]基本一致。

3 結論

基于cyst-AuNPs納米酶催化活性、NO2-的催化氧化反應以及I3-刻蝕作用原理,將納米酶催化反應與NO2-的催化氧化反應相結合,構建高靈敏檢測NO2-的“雙催化反應”體系。在優(yōu)化測試條件下,NO2-的質(zhì)量濃度與體系吸收變化量ΔA有線性關系,據(jù)此建立了靈敏檢測0.008 33～0.142 μg?mL-1NO2-的光度分析法。本法用于測定環(huán)境水樣品中NO2-的含量,結果滿足NO2-含量測定要求。