王靜靜，廖愛美，劉瑩瑩，陳新陽，薛迎春，潘龍，黃繼紅，3，4*，侯銀臣

（1.河南工業(yè)大學 生物工程學院小麥生物加工與營養(yǎng)功能河南省重點實驗室，河南 鄭州 450001；2.中原食品實驗室，河南 漯河 462000；3.河南大學 農學院 作物逆境適應與改良國家重點實驗室，河南 開封 475004；4.許昌學院 食品與藥學院，河南 許昌 461000）

由于食品在儲存過程中含水量高，利于微生物生長和發(fā)生化學反應，容易導致食品腐敗變質[1]，而冷凍保存技術是將食品長期保存的最有效方法。受溫度波動的影響，食品中的冰晶生長或再結晶，會破壞細胞和組織結構，使食品失去原有品質[2]，并造成一定的經濟損失。因此，在食品冷凍儲存過程中，找到控制冰晶生長和再結晶的方法對提高冷凍食品的品質至關重要[3]。在冷凍食品中添加冷凍保護劑是緩解冷凍貯藏過程中發(fā)生品質惡化的最有效方法之一[4]。抗凍蛋白（antifreeze proteins，AFPs）最初是在南極海洋魚類血清中發(fā)現的，是一種可以防止魚類在冰冷的海水中結冰的蛋白質[5]。與其他蛋白質不同，AFPs 對冰有獨特的作用，它可以通過吸附到冰層表面保留水合分子，保留后的水合分子與冰晶有不同的生長方向和氫鍵結構，AFPs 可以吸附到冰晶表面來抑制冰晶的形成和冰晶的生長[6-7]。此外，它可以通過降低體液的凍結溫度來保障各種冷適應生物的存活，也可以通過抑制凍融過程中產生冰晶從而保護細胞不受傷害[8]。因此，AFPs 可以作為一種新型、無毒害的低溫保護劑應用于冷凍食品中。AFPs 可以從生物體中提取，也可以通過人工制備。然而，提取或制備得到的AFPs 粗液包含多種蛋白質，因此，需要進一步的分離純化從而獲得高濃度的AFPs溶液。本文總結了近年來國內外AFPs 的來源、特性、制備與純化的最新研究，重點論述了AFPs 在冷凍食品中的應用進展，并展望了AFPs 的制備與應用前景，以期為抗凍蛋白的制備、純化和應用提供參考。

1 AFPs 的來源

AFPs 主要存在于海洋深處、常年積雪和沙漠地區(qū)的細菌、真菌、植物、昆蟲、脊椎動物體內，是一種能夠抑制冰晶再結晶的結構多樣化的大分子蛋白質，它可以幫助許多生物體（如魚、昆蟲、植物和細菌等），能夠在0 ℃以下的溫度中生存[9]。AFPs 有熱滯活性（thermal hysteresis activity，THA）、冰重結晶抑制（ice recrystalization inhibition，IRI）和修飾冰晶形態(tài)等特性，自然界中不同生物來源的AFPs 的特征有差異[10]。例如，在IRI方面，AFPs 可以通過降低體液中的冰點來阻止魚類和昆蟲冰晶的形成；在修飾冰晶形態(tài)方面，植物和線蟲的抗凍性是通過將磷酸腺苷結合在冰的表面并防止其變成更大的冰晶來實現的；不同微生物的AFPs 可以附著在冰面上，并抑制冰晶的形成。AFPs 可以抑制冰晶的生長，這對于生活在冰冷海水中的極地魚類有重要意義[11]。Takeshita 等[12]研究發(fā)現，冬牙鲆AFPs 溶液經過預熱和超濾后提高了蛋白的純度，增強了對冰晶生長的重結晶抑制作用。昆蟲中AFPs 的抗凍活性顯著高于魚類；植物中的AFPs 具有顯著抑制冰晶形態(tài)的作用。有研究表明，將AFPs 轉入植物體內能夠減緩植物凍害[13]，但關于植物中AFPs 的研究起步較晚，文獻相對較少。表1 概括了不同生物來源的AFPs，以及它們的代表物種和同源蛋白質。

表1 不同生物來源的AFPsTable 1 Different biological sources of antifreeze proteins

2 AFPs 的特性

AFPs 與冰晶結合，能夠通過非依數的形式降低溶液的冰點，并保持其熔點不發(fā)生變化；同時，表現出IRI 活性，可以阻止微小冰晶在冷凍、低溫保存過程中生長為大晶體，并具有改變冰晶形態(tài)的能力[18]。

2.1 THA

AFPs 能夠非依數性地降低溶液的冰點而保持其熔點不變，這樣冰點與熔點間產生的差值就稱為THA，其根據AFPs 和晶體表面之間的相互作用而變化[19]。根據THA，AFPs 可分為中度活性抗凍蛋白和過度活性抗凍蛋白。在魚類和植物中發(fā)現了中度活性的AFPs，在高濃度蛋白質下，其THA 值約為2 ℃，而在高濃度蛋白下，來自細菌和昆蟲的THA 值高達5 ℃[20]。在含有AFPs 的溶液中，冰晶不可逆地結合到AFPs上，阻止冰晶生長，直到溫度降低到非平衡冰點，從而形成溫度差，使冰晶破裂[21]，這種特殊的性質在食品工業(yè)及低溫保存技術方面存在巨大的應用潛力。

2.2 IRI

AFPs 可以防止水在冰晶和溶液之間的再分配，即IRI。根據這一特性，AFPs 在食品工業(yè)中具有潛在的應用價值，例如在制冷系統(tǒng)的冰漿和食品儲存中的應用。植物的IRI 活性高于魚類和昆蟲。對于一些耐寒生物體，當空氣溫度降至冰點以下時，它們的細胞外會形成許多冰晶，AFPs 可以減緩胞內致命冰的形成[22]。冰的重結晶過程分為冰晶邊界遷移、大冰晶增大、小冰晶消失。AFPs 可以增加冰晶的數量，減小冰晶的尺寸。一般來說，AFP 的IRI 率越大，形成的冰晶就越小[23]。AFPs 通過阻止冰晶在邊界處生長和融化來抑制冰晶邊界遷移的過程。即使是在亞微摩爾的濃度中，IRI 也很顯著，這遠低于THA 所需的濃度。冰晶在冷凍溶液中較小，降低了細胞的損傷，防止冷凍食品在儲存過程中營養(yǎng)的流失，因此對于冷凍食品和其他冷凍水合材料的保存有至關重要的作用[24]。Shi 等[25]采用3 種浸漬方法，研究了AFPs 對凍融循環(huán)下扇貝內收肌持水能力和質地特性的影響。結果表明，在超聲輔助浸漬中AFPs 通過氫鍵吸附在冰晶表面，可以顯著改變冰晶的形態(tài)，顯著提高扇貝收肌的持水能力和質地特性，為研究超聲輔助浸漬及其在冷凍水產品中的作用機制提供一定的參考。

2.3 修飾冰晶形態(tài)的能力

AFPs 可以結合到特定冰晶的基面上，從而形成獨特的冰晶形態(tài)。例如，冬比目魚和黃顙魚中的I 型AFPs分別結合在冰錐和副棱柱基面上，來自南極的黃桿菌中超活性AFPs 結合在基面上，形成檸檬的形狀，而超活性AFPs 可以同時結合在冰晶的基面和棱柱上[26]。

3 AFPs 的制備

AFPs 可以從天然來源（植物、昆蟲、動物和魚類）中提取，也可以通過常見的基因重組技術制備。對化學法、分子生物學表達、基因工程表達的制備方法進行總結。

3.1 化學法

化學法一般采用的是堿溶酸沉法，依據蛋白質等電點的不同，通過調節(jié)溶液的pH 值，使得目的蛋白質沉淀。陳振家[27]采用堿溶酸沉的方法從大豆中制備分離蛋白，通過改性后制成凝膠，在凍藏條件下對蛋白的抗凍特性進行研究，結果表明，隨凍藏時間的延長，凝膠特性下降，蛋白降解。丁香麗[28]則以Na2HPO4-NaH2PO4溶液為緩沖液，采用真空滲透法提取大麥籽粒中AFPs，經過超濾、一系列柱層析純化，得到的大麥籽粒AFPs 相對分子質量為13 370 Da，THA為1.04 ℃，與禾本科小麥族12 個屬中的蛋白具有較高同源性。

3.2 分子生物學表達

分子生物學表達技術是指以模式生物（細菌、真菌、動物細胞或者植物細胞）為宿主，對外源基因進行表達的一種方法。張莉等[29]通過構建重組乳酸乳球菌進行誘導表達抗凍肽，比較冷凍脅迫前后乳酸乳球菌的生長曲線、發(fā)酵活力和細胞內鈉、鉀離子含量的變化，研究重組菌在冷凍脅迫作用下的生理功能特性。結果表明，抗凍肽具有顯著的抗冷凍脅迫保護作用。Zhao 等[30]將4 種云杉品種的基因轉入大腸桿菌宿主中表達，經過誘導、提取、純化后的可溶性基因蛋白進行差示掃描量熱儀測試，其特征THA 分別為0.77 ℃（PicW1）、0.78 ℃（PicW2）、0.72 ℃（PicM）和0.86 ℃（PicK），顯著高于對照組（牛血清蛋白）的0.05 ℃。

3.3 基因工程表達

基因工程表達蛋白，是先設計目的基因并在體外構建DNA 分子，然后將基因導入細胞內來表達蛋白質，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品的遺傳技術。董小云[31]從白菜型冬油菜中分離鑒定出白菜型冬油菜抗凍蛋白（BrAFP1），其分子量為38.130 kDa。讓冬油菜幼苗在低溫脅迫下生長，結果顯示BrAFP1 基因表達上調，表明該基因在白菜型冬油菜低溫響應中起著重要作用。Yu 等[32]從沙冬青中克隆出AnAFP 基因，通過實時熒光定量，發(fā)現高溫對AnAFP、AnICE1 和AnCBF 基因的表達有顯著的誘導作用，表明AnAFP 可能受冷脅迫信號調節(jié)通路調控。表2 歸納了3 種方法制備AFPs 的優(yōu)點與缺點。

表2 AFPs 的制備方法比較Table 2 Comparison on the preparation methods of antifreeze proteins

4 AFPs 的分離純化

通過化學法、分子生物學表達、基因工程表達制備得到的AFPs 粗液是一種復雜的蛋白質體系，包含多種蛋白質，因此，需要進一步的分離純化從而獲得高濃度的AFPs 溶液。冰親和層析、色譜層析、Ni 柱親和層析為常見的純化方法。

4.1 冰親和層析

冰親和層析是純化AFPs 的傳統(tǒng)方法。純化的原理是如果冰晶生長得足夠慢，過冷就會被最小化，雜質很難進入晶體，可以通過混合溶液來排除冰中的溶質。冰親和層析有兩種方法可以實現，第一種方法是冰親和純化技術，即用黃銅冷指浸入蛋白質溶液中，純化后的蛋白質在黃銅冷指上緩慢生長，不斷攪拌溶液防止雜蛋白結冰；第二種方法是冰殼純化，即圓底燒瓶浸泡在冷水浴里，低溫使燒瓶表面形成薄冰，抗凍蛋白通過吸附到冰的表面以達到純化的效果[33]。這兩種方法都是在容器中混合AFPs 溶液，同時通過程序，利用水浴降低溫度，通過融化冰提取純化的蛋白質。Tomalty 等[34]從實驗室冷馴化后的黃粉蟲幼蟲勻漿中制備出AFPs，經過5 次旋轉冰親和純化蛋白，測得其熱值活性最高為3.5 ℃，幼蟲勻漿的上清部分具有大量不同的蛋白質，最高相對分子質量可達175 kDa。與傳統(tǒng)的分離純化AFPs 方法相比，冰親和層析法更適用于AFPs 較大規(guī)模的粗分離純化，而且電泳條帶切割法適用于高精度和高純度樣品地分離[35]。

馬慶保[36]以特異性親和吸附法制備南極磷蝦AFPs，優(yōu)化的提取南極磷蝦AFPs 最佳條件為樣品濃度1.0 mg/mL、吸附溫度-1.70 ℃、吸附時間11 h、吸附次數為2，在此條件下，南極磷蝦AFPs 的預測得率為30.12%，THA 為0.079 ℃。

4.2 色譜層析

色譜層析作為一種物理化學分離純化方法，是從混合物中分離組分的最重要的方法之一。凝膠過濾層析是根據流體分子的體積或分子量不同來達到對蛋白質分離的目的，離子交換色譜層析的固定相為陰離子或者陽離子交換劑，流動相為粗蛋白溶液，根據組分離子與交換劑上的平衡離子的結合力大小而進行分離的一種色譜層析方法。目前，分離純化AFPs 最常用的方法是凝膠過濾色譜法和離子交換色譜層析法。通常，AFPs 的分離純化需要這些色譜方法的組合應用。

Ding 等[37]從冷馴化的大麥中提取AFPs，通過超濾濃縮樣品至五分之一，硫酸銨梯度沉淀，然后再通過高配基密度-羥色藻糖快速流動層析和凝膠過濾色譜層析兩種色譜層析的方法純化大麥籽粒AFPs，然后采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜進行蛋白鑒定。結果表明，滲透離心提取的蛋白比傳統(tǒng)方法更有針對性。Wu等[38]用細胞外蛋白酶對三文魚皮中的膠原蛋白進行水解，通過超濾和尺寸排阻層析后，得出其水解產物具有良好的抗凍性（>3 kDa）和抗氧化活性（< 3 kDa）。

4.3 Ni 柱親和層析

Ni 柱親和層析依據金屬Ni 通過與電子供體配基上能與Ni2+相互作用的羧基或氨基的電負性元素（O，N）形成較穩(wěn)定的金屬螯合物，使得AFPs 可以選擇性地結合在填料上，而其他的雜質蛋白則不能結合或僅能微弱結合。用不同濃度的咪唑緩沖液將結合在介質上的His 標簽蛋白洗脫下來，由于純化的重組蛋白粗提取液中含有His-Tag 標簽，Ni2+與His-Tag 標簽結合，通過Ni 柱親和層析純化出需要的蛋白質，可以得到較高純度的His 標簽蛋白。Mao 等[39]在大腸桿菌中異源表達GmAFPIV 蛋白，將蛋白上清粗提取液負載在Ni-NTA 柱上，用不同濃度咪唑緩沖液把目的蛋白洗脫下來，經過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，其分子量約為30 kDa，通過蛋白質免疫印跡驗證其活性。金泉等[40]通過在大腸桿菌中表達絲膠抗凍肽并用鎳瓊脂糖親和層析對其蛋白粗提取液進行純化，測得其蛋白分子量為25～35 kDa，并證明了提取到的融合蛋白具有抗冷凍脅迫保護作用。表3 總結了3 種AFPs 分離純化方法的優(yōu)點與缺點。

表3 AFPs 的分離純化方法對比Table 3 Comparison on the separation and purification methods of antifreeze proteins

5 AFPs 在食品中的應用

近年來，隨著對AFPs 性質和機理的深入研究，其應用領域也越來越廣泛。在食品工業(yè)中，AFPs 被認為是天然的冰晶生長抑制劑，即使在較低的濃度下，它依然能夠在食品的冷凍、儲存、運輸和解凍過程中抑制冰晶再結晶和降低化合物的冰點，從而通過減少細胞損傷來保留食物原有風味，減少營養(yǎng)物質的損失，延長產品的貨架壽命。

5.1 AFPs 在冷凍肉制品中的應用

AFPs 通過不可逆地附著在冰晶表面，抑制冰晶的生長，進而改變冰晶的形態(tài)，抑制再結晶，提高冷凍食品的生物抗凍能力。Zeng 等[41]采用響應面法對羅非魚加工副產物進行酶解，制備了抗凍肽，通過掃描電鏡觀察發(fā)現，與生理鹽水組相比，抗凍肽保護下的細胞表面更規(guī)則、光滑、完整，表明其可作為一種新型菌體的冷凍保護劑，用于益生菌的保存。Chen 等[42]將不同濃度的AFPs 添加到冷凍雞肉中，觀察雞肉的持水能力、水分分布、顏色、蛋白質特性、微觀結構和組織學的變化，結果表明，AFPs 可以顯著提高冷凍雞肉的品質，減少冷凍期間雞肉的營養(yǎng)損失，是一種潛在的、安全的、高效的冷凍保護劑。Li 等[43]研究發(fā)現，添加0.2%AFPs 的速凍豬肉餅經過5 次凍融循環(huán)后，肉餅硬度和彈性均高于對照組。

5.2 AFPs 在冷凍面團中的應用

AFPs 可以改變冰晶的大小和形狀，從而抑制冰晶的再結晶，這對提高冷凍食品的品質和延長保質期有重要作用。目前，AFPs 已被應用于許多冷凍食品的加工中。例如，向預烤冷凍面包中添加小麥AFPs 和海藻糖，發(fā)現AFPs 能夠改善復烤面包的品質，與未添加相比，0.6% AFPs 與0.6%海藻糖能夠緩解凍融對復烤面包的影響[44]。Zhang 等[45]研究了添加或不添加AFPs 的情況下對冷凍面團的影響。結構特性結果顯示，添加燕麥AFPs 可以降低冷凍面團中的可凍水含量。流變學特性結果表明，與未添加燕麥AFPs 組相比，添加燕麥AFPs 組的發(fā)酵能力更強；掃描電鏡結果表明，燕麥AFPs 的加入可以保護面筋基質免受溫度波動和冷凍造成的破壞，從而使饅頭質地特性更好。AFPs 的添加可以改善饅頭的質地，但隨著存放時間的延長，這種改善作用逐漸減弱。

5.3 AFPs 在冰淇淋中的應用

在冰淇淋產品中，玻璃化轉變溫度是評價冰淇淋在儲存過程中熱力學穩(wěn)定性的一個指標。AFPs 可以提高冰淇淋的重結晶、耐融性和玻璃化轉變溫度[46]。為了開發(fā)一款質地細膩、抑制重結晶能力強的冰淇淋，Kaleda 等[47]將冬黑麥AFPs 添加到冰淇淋中，研究AFPs對冰淇淋結構和質地的影響。結果顯示，當AFPs 存在時，冰淇淋中的冰晶明顯變小，再結晶受到抑制，冰淇淋質地更順滑，提高冰淇淋對溫度波動的耐受性。Zhang 等[48]從燕麥中提取燕麥抗凍蛋白（Avena sativa L.AFPs，AsAFP），在濃度15.0 mg/mL時，其THA 為1.24 ℃，經過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS） 和串聯(lián)質譜（tandem massspectrometry，MS/MS）質譜分析結果表明，AsAFP與幾丁質內質酶同源。隨后，將0.1%的AsAFP 添加到冰淇淋中，使得玻璃化轉變溫度從-29.14 ℃增加到-27.74 ℃，有效提高了冰淇淋的抑制重結晶和耐融化性。

5.4 AFPs 在低溫果蔬中的應用

無論是植物細胞還是動物細胞，在冷凍時的細胞損傷都是由再結晶時晶體尺寸的增加導致。此外，AFPs 通過抑制冰晶的生長來防止再結晶，進而阻礙冰的融化[49]。在低溫保存過程中，融化或解凍是導致細胞損傷的主要過程。Kashyap 等[16]用沙棘抗凍蛋白（hippophae rhamnoides chitinase class IV，HrCHI4）預處理青豆，然后將其冷凍保存，并對HrCHI4 作為冷凍保護劑的作用進行了分析。通過掃描電鏡、氣相色譜-質譜等檢測青豆的結構和組成成分，結果表明，用HrCHI4 預處理后能夠降低冷凍青豆的滴水損失和電解質泄漏，保持了青豆細胞膜的完整性，保護外層細胞并促進凍融后揮發(fā)成分的保留。此研究通過自然方法來保持低溫蔬菜的質地和新鮮度，開辟了AFPs 在果蔬產品保存中的應用途徑。Kashyap 等[50]對豌豆冷凍前進行預處理，測定了冷凍豌豆解凍后的滴水損失，采用高效液相色譜法檢測豌豆在冷凍前后維生素的流失情況。結果表明，使用大麥AFPs 處理后的豌豆水分和維生素（硫胺素、吡哆醇、核黃素和抗壞血酸含量）損失減少。

6 展望

目前，由于AFPs 制備成本高昂，因此在食品領域還未得到廣泛的應用。

6.1 制備前景展望

除了通過化學法、分子生物學表達、基因工程表達方法制備AFPs，還可以用體外無細胞蛋白合成系統(tǒng)（cell-free translation system，CFPS）來制備AFPs。CFPS是以外源DNA 或者mRNA 為模板，在無細胞蛋白表達體系內補充底物和能源物質[腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）等]，利用細胞抽提物提供的細胞器在T7/SP6 RNA聚合酶的組合下體外表達目的蛋白質的系統(tǒng)。

在CFPS 中，細胞膜的缺失有助于蛋白質折疊，進而更好地合成AFPs 以達到高通量生產，并且CFPS 制備出的雜蛋白少，利于純化蛋白，從而避免了純化過程中靶蛋白的減少，可以獲得更高的蛋白產量[51]。由于不含有活細胞，因此，CFPS 自然地克服了維持細胞活性的通用限制，在人工和預定義的環(huán)境中工程化和控制基本和必要的細胞過程方面具有巨大潛力[52]。

6.2 應用前景展望

生物體的抗寒能力是生物體適應惡劣自然環(huán)境的一種能力，AFPs 的出現揭示了這種自我保護能力的本質。隨著AFPs 的研究逐年增多，不僅發(fā)現了越來越多的耐寒生物體中含有AFPs，而且AFPs 的防凍作用機制也越來越清晰。低溫醫(yī)學是開發(fā)安全、高效、適用于重大疾病治療的醫(yī)用防凍劑的新興領域。血液、胚胎、器官，甚至身體等各種相關生物材料都需要冷凍保存，保存后的生物材料可用來幫助患者治療和恢復身體健康。雖然昆蟲AFPs 的抗凍活性高于其他種類的活性，但是無法從昆蟲中大量提取AFPs。因此，大多數應用的AFPs 都來自魚類AFPs，其中III 型AFPs 更容易通過基因重組產生，最常用于低溫保存。

7 小結

從AFPs 的特性和應用來看，它不僅與人們的生活息息相關，而且也滲透到各個領域。本文介紹了AFPs 的來源，諸多研究表明，自然界中不同生物來源AFPs 的特征有差異；總結了AFPs 的特性，其具有降低溶液的冰點，保持溶液熔點不發(fā)生變化，阻止微小冰晶在冷凍、低溫保存過程中生長為大晶體的特性，并具有改變冰晶形態(tài)的能力；此外詳細描述了目前常用的AFPs 制備與純化方法，并對這些方法的優(yōu)缺點進行分析；最后介紹了AFPs 在食品中的應用現狀并展望其制備和應用前景。盡管AFPs 作為未來生物技術的重要性在不同領域得到了認可，但對其在低溫下的作用和調節(jié)抗凍活性機制仍需進一步研究。