田甜，徐杰，李美洲，周穎欣，劉權(quán)震，鄧成程，劉燎原，沈斌斌

廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244

石膏性大寒，味甘、辛，生用除煩止渴、清熱瀉火力強(qiáng)；知母性寒，味苦、甘，生用滋陰潤燥、清熱瀉火力強(qiáng)[1]。石膏-知母藥對配伍最早源于《傷寒論》的白虎湯，臨床上常相須為用，兩者配伍可增強(qiáng)清熱瀉火、除煩、生津止渴的功效，是治療傷寒陽明病熱癥、氣分熱盛證的常用藥對[2-5]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，石膏和知母配伍能增強(qiáng)解熱、清胃熱的作用[6-7]。石膏主要成分為含水硫酸鈣（CaSO4·2H2O），也含有Al2O3、CaO、MgO、SiO2、Fe2O3、SO3、K2O等無機(jī)成分[8]。知母主要含有皂苷、雙苯吡酮、生物堿、氨基酸、揮發(fā)油等類成分[9]。有研究報道，石膏與知母配伍能顯著增加Ca2+濃度，促進(jìn)新芒果苷的溶出[10-11]。對中藥方劑數(shù)據(jù)庫[12]所含方劑進(jìn)行檢索，發(fā)現(xiàn)有182個處方中含有石膏-知母藥對，如白虎湯、辛夷清肺飲、化斑湯、玉女煎、清瘟敗毒飲等。藥對作為最簡單的中藥配伍組合，是連接單味藥與經(jīng)典復(fù)方的重要橋梁，在臨床療效上發(fā)揮著巨大作用。在現(xiàn)代制劑過程中，通過石膏、知母共煎提取，不僅可以減輕知母噴霧干燥過程中的粘機(jī)問題，也可使石膏中的Ca2+、Mg2+、Na+、K+等離子吸附在知母提取物上并轉(zhuǎn)移至成品中，減少物料流轉(zhuǎn)過程中固形物的損耗，保證臨床用藥劑量的準(zhǔn)確[13-16]。為探究石膏-知母藥對中無機(jī)元素及有機(jī)化合物的組成情況，本研究采用離子色譜法（IC）、超高效液相色譜-紫外檢測法（UPLC-UV）、超高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（UPLC-ELSD）對石膏-知母組合物進(jìn)行定性和定量分析，以期為石膏-知母藥對的質(zhì)量評價和物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Dionex ICS-6000型離子色譜儀[賽默飛世爾（中國）科技有限公司]；H-Class 型超高液相色譜儀、Arc 型超高液相色譜儀（美國沃特世公司）；Alltech 6000型蒸發(fā)光散射檢測器[奧泰科技（中國）有限公司]；ME203E型萬分之一分析天平、XP26型百萬分之一天平（美國Mettler-Toledo 公司）；Milli-Q 型超純水系統(tǒng)（Merck股份有限公司）。

1.2 試藥

對照品芒果苷（批號：111607-201704，純度：98.1%）、知母皂苷BⅡ（批號：111839-202107，純度：95.4%），知母對照藥材（批號：121070-201806）均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品新芒果苷（批號：DST201128-017，純度：99.01%，成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司）；對照品異芒果苷（批號：CFS202002，純度：98%，武漢天植生物技術(shù)有限公司）；硫酸鹽（批號：BWZ6783-2016）、鈣單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[批號：GBW（E）080118]、鈉單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[批號：GBW（E）080526]、鉀單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[批號：GBW（E）083296]、鎂單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[批號：GBW（E）083298]均購自北京北方偉業(yè)計量技術(shù)研究院，質(zhì)量濃度均為1000 μg·mL-1；色譜純甲酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；色譜純甲醇、乙腈（Merck 股份有限公司）；優(yōu)級純甲烷磺酸、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉[阿拉丁試劑（上海）有限公司]；水為自制超純水。

12 批石膏、知母藥材均經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定，分別為硫酸鹽類礦物石膏族石膏、百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根莖，藥材信息見表1。

表1 石膏、知母樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 組合物制備 取石膏、知母藥材，分別按照《中華人民共和國藥典》2020 年版[1]石膏、知母項下炮制方法炮制，得到石膏飲片、知母飲片。分別稱取石膏飲片、知母飲片（質(zhì)量比為1∶1）適量，加水煎煮2 次（石膏先煎），濾過，合并2 次煎液，減壓濃縮，干燥，得石膏-知母組合物（編號S1～S12）。

2.1.2 單煎混合樣品 取石膏飲片適量，加水煎煮2 次，濾過，合并煎液，減壓濃縮，干燥，得石膏提取物。取知母飲片適量，加水煎煮2 次，濾過，合并煎液，減壓濃縮，干燥，得知母提取物。按公式（1）計算石膏、知母出膏率。根據(jù)出膏率情況，按石膏-知母（1∶1）稱取石膏、知母單煎提取物適量，混勻，得石膏-知母藥對單煎混合樣品。

2.2 指紋圖譜

2.2.1 IC指紋圖譜

2.2.1.1 色譜條件 IonPac CG12A保護(hù)柱（50 mm×4 mm，8 μm）、IonPac CS12A 分析柱（250 mm×4 mm，8 μm）；CSRS 4 mm 抑制器，抑制電流為47 mA；淋洗液為20 mmol·L-1甲烷磺酸水溶液，流速為0.8 mL·min-1；電導(dǎo)檢測器，檢測池溫度為35 ℃，檢測器靈敏度為5 μs·cm-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

2.2.1.2 對照品溶液的制備 分別取鈉、鉀、鎂、鈣單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.15、1.20、0.15、0.30 mg，精密稱定，加入純水30 mL，制成Na+、K+、Mg2+、Ca2+質(zhì)量濃度為分別5、40、5、10 μg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.2.1.3 供試品溶液的制備 取石膏-知母組合物，研細(xì)，精密稱取約0.15 g，置于塑料量瓶中，精密量取0.54%甲烷磺酸水溶液30 mL 加入量瓶中，用渦旋振蕩儀充分振搖使溶解，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.1.4 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)：分別精密吸取2.2.1.3 項下S7 供試品溶液，按2.2.1.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)行6 次樣品測定，選擇K+為參照峰，結(jié)果顯示，IC 指紋圖譜中各共有色譜峰相對保留時間的RSD 為0.01%～0.05%，相對峰面積RSD 為0.58%～0.72%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取S7供試品6份，分別按2.2.1.3項下制備方法平行制備供試品溶液，按照2.2.1.1項下色譜條件進(jìn)行樣品檢測，選擇K+作為參照峰，結(jié)果顯示，IC 指紋圖譜中各共有色譜峰的相對保留時間的RSD 為0.04%～0.05%，相對峰面積的RSD為0.99%～2.72%，表明該供試品溶液的制備方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取S7供試品溶液，分別按2.2.1.1項下色譜條件，在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)行供試品檢測，選擇K+作為參照峰，結(jié)果顯示，IC指紋圖譜中各共有色譜峰的相對保留時間的RSD為0.02%～0.04%，相對峰面積的RSD 為0.42%～2.57%，表明按照上述方法制得的供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.1.5 指紋圖譜的建立 取12 批石膏-知母組合物樣品，按2.2.1.3 項下方法制備供試品溶液，按照2.2.1.1 項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄得到IC 色譜圖。運(yùn)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版），以S1 供試品色譜圖為參照圖譜，選擇中位數(shù)法分別生成對照圖譜，時間窗寬度設(shè)置為0.1 min，采用多點(diǎn)校正法進(jìn)行Mark 峰匹配，建立12 批石膏-知母組合物的IC 疊加指紋圖譜，生成對應(yīng)的IC 對照指紋圖譜R1（圖1）。IC 指紋圖譜中共標(biāo)定5 個共有峰（圖2），經(jīng)與對照品溶液比對，確定1 號峰為Na+、3 號峰為K+、4 號峰為Mg2+、5 號峰為Ca2+。以K+為指紋圖譜參照峰，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表2、表3。結(jié)果顯示，12 批石膏-知母組合物樣品IC 指紋圖譜各色譜峰相對保留時間RSD 為0～0.56%，表明各色譜峰出峰時間穩(wěn)定，IC 指紋圖譜重復(fù)性好，但各色譜峰相對峰面積RSD 存在較大差異，表明不同批次石膏-知母組合物所含離子含量存在一定差異。

圖1 12 批石膏-知母組合物樣品IC 指紋圖譜及對照指紋圖譜

圖2 石膏-知母組合物樣品IC指紋圖譜

表2 石膏-知母組合物樣品IC 指紋圖譜色譜峰相對保留時間

表3 石膏-知母組合物樣品IC指紋圖譜各色譜峰相對峰面積

2.2.1.6 指紋圖譜相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版），以對照指紋圖譜R1 為參照，對12 批石膏-知母組合物指紋圖譜進(jìn)行整體相似度評價。結(jié)果顯示，12批石膏-知母組合物供試品的IC 指紋圖譜相似度均為1.000，大于0.963，與對照圖譜具有較好的一致性，表明石膏-知母組合物各批間質(zhì)量均一穩(wěn)定。

2.2.2 UPLC指紋圖譜

2.2.2.1 色譜條件 Waters HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈∶甲醇（3∶1，B）；梯度洗脫（0～3 min，0%B；3～7 min，0%～4%B；7～14 min，4%～7%B；14～20 min，7%～13%B；20～27 min，13%～16%B；27～28 min，16%～20%B；28～34 min，20%～25%B；34～42 min，25%～32%B；42～44 min，32%～60%B；44～54 min，60%～70%B；54～57 min，70%～90%B；57～59 min，90%～0%B；59～65 min，0%B）；柱溫為30 ℃；流速為0.25 mL·min-1；檢測波長為275 nm；進(jìn)樣量為1 μL。

2.2.2.2 對照品溶液的制備 分別稱取新芒果苷、芒果苷、異芒果苷對照品約5、10、1 mg，精密稱定，精密加入70%甲醇25 mL，制成質(zhì)量濃度為199.010、392.989、41.895 μg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.2.2.3 供試品溶液的制備 取石膏-知母組合物，研細(xì)，精密稱取約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密量取70%甲醇50 mL 置于錐形瓶中，稱定質(zhì)量，密塞，超聲處理60 min，取出，放涼至室溫，再稱定質(zhì)量，用溶解溶劑補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.4 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)：分別精密吸取2.2.2.3 項下S7 供試品溶液，按2.2.2.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)行6 次樣品測定，選擇芒果苷作為參照峰，結(jié)果顯示，UPLC指紋圖譜中各共有色譜峰的相對保留時間RSD為0.02%～0.14%，相對峰面積RSD為0.16%～3.17%，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取S7供試品6份，分別按2.2.2.3項下方法平行制備供試品溶液，按照2.2.2.1項下色譜條件進(jìn)行樣品檢測，選擇芒果苷作為參照峰，結(jié)果顯示，UPLC指紋圖譜中共有色譜峰的相對保留時間的RSD 為0.01%～0.17%，相對峰面積的RSD 為1.02%～3.41%，表明該供試品溶液的制備方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取S7供試品溶液，分別按2.2.2.1項下色譜條件在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)行供試品檢測，選擇芒果苷作為UPLC 指紋圖譜的參照峰，結(jié)果顯示，UPLC指紋圖譜中各共有色譜峰的相對保留時間的RSD為0.01%～0.11%，相對峰面積的RSD為0.59%～2.46%，表明按照上述方法制得的供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.2.5 UPLC指紋圖譜的建立 取12批石膏-知母組合物樣品，分別按2.2.2.3項下方法制備供試品溶液，按2.2.2.1項下色譜條件進(jìn)行供試品測定，得到UPLC 色譜圖。運(yùn)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版），以S1 供試品色譜圖為參照圖譜，選擇中位數(shù)法分別生成對照圖譜，時間窗寬度設(shè)置為0.1 min，采用多點(diǎn)校正法進(jìn)行Mark 峰匹配，建立12 批石膏-知母組合物的UPLC 疊加指紋圖譜，生成對應(yīng)的UPLC對照指紋圖譜R2（圖3）。UPLC指紋圖譜中共標(biāo)定15個共有峰（圖4），經(jīng)與對照品溶液比對，確定7 號峰為新芒果苷、10號峰為芒果苷、11號峰為異芒果苷。以芒果苷為指紋圖譜參照峰，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果見表4、表5。結(jié)果顯示，12批石膏-知母組合物樣品各色譜峰相對保留時間RSD 為0～1.54%，表明各色譜峰出峰時間穩(wěn)定，UPLC指紋圖譜重復(fù)性好，但各色譜峰相對峰面積RSD 存在較大差異，表明不同批次石膏-知母組合物所含化學(xué)成分存在一定差異。

圖3 12批石膏-知母組合物樣品UPLC指紋圖譜及對照指紋圖譜

圖4 石膏-知母組合物樣品UPLC指紋圖譜

表4 石膏-知母組合物樣品UPLC指紋圖譜各色譜峰相對保留時間

表5 石膏-知母組合物樣品UPLC指紋圖譜各色譜峰相對峰面積

2.2.2.6 指紋圖譜相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 版），分別以對照指紋圖譜R2為參照，對12批石膏-知母組合物指紋圖譜進(jìn)行整體相似度評價。結(jié)果顯示，12批石膏-知母組合物供試品UPLC 指紋圖譜相似度依次為0.997、0.998、0.997、0.999、0.999、0.963、0.974、0.995、0.999、0.999、0.986、0.999，均大于0.963，與對照圖譜具有較好的一致性，表明石膏-知母組合物各批間質(zhì)量均一穩(wěn)定。

2.2.3 聚類分析 將12 批石膏-知母組合物IC、UPLC指紋圖譜共有峰面積作為變量，導(dǎo)入SPSS 20.0軟件，進(jìn)行Z得分標(biāo)準(zhǔn)化處理。以標(biāo)準(zhǔn)處理后的數(shù)據(jù)作為變量，選擇組間連接法，以平方歐氏距離為測量區(qū)間，對樣品進(jìn)行聚類分析（圖5）。當(dāng)平方歐氏距離為22.5時，12批石膏-知母組合物大致可分為2類，S1～S6、S8～S12聚為第1類，S7聚為第2類。當(dāng)平方歐氏距離為15 時，大致可分為3 類，S1～S5、S8～S12聚為第1類，S6聚為第2類，S7聚為第3類。

圖5 石膏-知母組合物樣品聚類分析

2.2.4 主成分分析 將IC、UPLC 指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)化處理后得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 20.0 軟件進(jìn)行主成分分析，以特征值>1為指標(biāo)，從20個變量成分中提取得到5 個變量成分，累積方差貢獻(xiàn)率>89.052%，見表6。同時將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件中，以提取得到的5 個主成分繪制主成分得分圖，見圖6。結(jié)果表明，S6、S7 與其余批次樣品差異較大，這與聚類分析結(jié)果基本一致。

圖6 石膏-知母組合物樣品主成分分析

表6 石膏-知母藥對主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 Ca2+色譜條件：同2.2.1.1 項下IC指紋圖譜色譜條件。

SO42-色譜條件：色譜柱選擇IonPac AG14 保護(hù)柱（50 mm×4 mm，9 μm）、IonPac AS14 分析柱（250 mm×4 mm，9 μm）；ASRS 4 mm 抑制器，抑制電流為31 mA；淋洗液為4.5 mmol·L-1碳酸鈉與1.4 mmol·L-1碳酸氫鈉均勻混合的溶液，流速為1.2 mL·min-1；電導(dǎo)檢測器，檢測池溫度為35 ℃，檢測器靈敏度為5 μs·cm-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

芒果苷、新芒果苷、異芒果苷色譜條件：同2.2.2.1項下UPLC 指紋圖譜色譜條件，檢測波長為258 nm。

知母皂苷BⅡ色譜條件：選擇Agilent ZORBAX StableBond C8色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈-水（25∶75）為流動相；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；蒸發(fā)光散射檢測器檢測，漂移管溫度104 ℃；載氣流速為2.9 mL·min-1；進(jìn)樣量為5～10 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 Ca2+、SO42-對照品溶液的制備：分別稱取鈣單元素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、硫酸鹽溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)約3、5 mg，精密稱定質(zhì)量，精密加入純水30 mL，分別制成Ca2+、SO42-質(zhì)量濃度為100.055、166.682 μg·mL-1的溶液，即得。

芒果苷、新芒果苷、異芒果苷對照品溶液的制備：同2.2.2.2 項下UPLC 指紋圖譜對照品溶液。

知母皂苷BⅡ?qū)φ掌啡芤旱闹苽洌悍Q取知母皂苷BⅡ?qū)φ掌芳s23 mg，精密稱定，精密加入30%丙酮水溶液25 mL，制成質(zhì)量濃度為889.471 μg·mL-1的對照品溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 Ca2+、SO42-供試品溶液的制備：精密吸取2.2.1.3 項下IC 指紋圖譜供試品溶液0.6 mL，加水稀釋至30 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

芒果苷、新芒果苷、異芒果苷供試品溶液的制備：同2.2.2.3 項下UPLC 指紋圖譜供試品溶液制備方法。

知母皂苷BⅡ供試品溶液的制備：取石膏-知母組合物樣品，研細(xì)，精密稱取樣品約0.2 g，置于具塞錐形瓶中，精密量取30%丙酮水溶液25 mL置于錐形瓶中，稱定質(zhì)量，密塞，超聲溶解30 min，取出，放涼至室溫，再稱定質(zhì)量，用溶解溶劑補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 方法學(xué)考察 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密吸取2.3.2 項下各成分對照品溶液，分別制成各成分的系列對照品溶液，分別按照2.3.1 項下色譜條件進(jìn)行對照品測定，以各成分對照品溶液的質(zhì)量濃度（或質(zhì)量濃度對數(shù)值）為橫坐標(biāo)（X），對應(yīng)的峰面積（或峰面積對數(shù)值）為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程，見表7。

表7 石膏-知母組合物各指標(biāo)線性關(guān)系考察結(jié)果

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.3.2 項下各成分對照品溶液少許，分別按照2.3.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)行樣品測定6 次，得到各成分的色譜峰面積。結(jié)果表明，Ca2+、SO42-、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷BⅡ 6 個指標(biāo)色譜峰面積的RSD 為0.73%、1.54%、0.22%、0.23%、0.95%、0.83%，表明該儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取S7 供試品，分別按2.3.3 項下方法制備3 份供試品溶液，分別按2.3.1 項下色譜條件，在0、2、4、8、12、24 h 內(nèi)進(jìn)行樣品檢測，得到各成分的色譜峰面積。結(jié)果表明，Ca2+、SO42-、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷BⅡ 6個指標(biāo)峰面積的RSD分別為1.36%、3.02%、0.46%、0.48%、0.52%、2.61%，表明按照上述方法制得的供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取S7 供試品6 份，按2.3.3 項下方法平行制備各成分供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件進(jìn)行樣品檢測，得到各成分的色譜峰面積，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算各成分含量。結(jié)果表明，Ca2+、SO42-、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷B Ⅱ 6 個指標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為2.94%、2.72%、2.62%、2.92%、3.28%、1.08%，表明該供試品溶液的制備方法重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)：按2.3.3 項下各成分制備方法，分別平行精密稱取已知成分含量的石膏-知母組合物樣品（S7）9 份，按供試品中待測成分含量的50%、100%、150%原則，精密加入上述6 個待測指標(biāo)的對照品，按2.3.3 項下制備方法分別制備各儀器的供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件進(jìn)行樣品檢測，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算各指標(biāo)的含量，得到Ca2+、SO42-、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷BⅡ的加樣回收率均值分別為102.06%、97.59%、101.13%、102.01%、91.29%、100.08%，RSD 分別為1.57%、0.93%、1.33%、1.53%、1.32%、1.68%，均在限度要求范圍內(nèi)，表明本方法回收率良好。

2.3.5 樣品含量測定 取12 批石膏-知母組合物樣品，分別按2.3.3項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進(jìn)行樣品檢測，見表8。結(jié)果表明，Ca2+和SO42-質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為58.35～100.56、127.85～223.13 mg·g-1；新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、知母皂苷B Ⅱ質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.52～5.91、5.10～8.20、0.51～0.78、21.14～38.35 mg·g-1。

表8 石膏-知母組合物各指標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù) mg·g-1

2.4 石膏-知母合煎樣品與單煎合用樣品指紋圖譜及含量測定

取石膏-知母合煎組合物、石膏-知母單煎混合樣品，分別按照指紋圖譜方法、含量測定方法，平行測定3份。將測定數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對樣品進(jìn)行分析，見表9、表10。結(jié)果表明，與單煎合用樣品比較，合煎樣品中Na+，K+，Mg2+，UPLC 峰1、峰2、峰3、峰6、峰9、峰12、峰13、新芒果苷、芒果苷峰面積與稱樣量的比值，以及新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；Na+，IC 峰2，K+，Mg2+，新芒果苷，UPLC峰4、峰14、峰15 峰面積與稱樣量的比值，以及新芒果苷、知母皂苷BⅡ含量明顯增大，表明石膏與知母合煎可有效促進(jìn)化學(xué)成分的溶出。

表9 石膏-知母合煎組合物與單煎混合樣品指紋圖譜檢測數(shù)據(jù)（,n=3）

表9 石膏-知母合煎組合物與單煎混合樣品指紋圖譜檢測數(shù)據(jù)（,n=3）

注：與單煎合用樣品比較，*P<0.05；表10同。

表10 石膏-知母合煎組合物與單煎混合樣品指標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=3） mg·g-1

表10 石膏-知母合煎組合物與單煎混合樣品指標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=3） mg·g-1

3 討論

3.1 色譜條件選擇

IC 指紋圖譜考察了0.8、1.0、1.2 mL·min-13個流速，發(fā)現(xiàn)三者色譜峰信息完整、分離度較好，但流速為0.8 mL·min-1時各色譜峰的出峰時間居中，利于后期分析，最終確定流速為0.8 mL·min-1。淋洗液考察了18、20、22 mmol·L-13 種不同濃度的甲烷磺酸水溶液，發(fā)現(xiàn)3 種不同濃度淋洗液對色譜圖影響較小，僅影響各色譜峰的出峰時間，為節(jié)省時間，確定淋洗液為20 mmol·L-1甲烷磺酸水溶液。

UPLC 指紋圖譜考察了乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈∶甲醇（3∶1）-0.1%甲酸水溶液3種不同流動相，發(fā)現(xiàn)乙腈∶甲醇（3∶1）-0.1%甲酸水溶液的色譜圖基線噪音小，色譜峰峰形最佳，各峰之間分離度達(dá)到1.5 以上，出峰時間適宜，滿足指紋圖譜對色譜峰的要求。同時，考察了258、275、310 nm 3個波長，發(fā)現(xiàn)258 nm下芒果苷、新芒果苷、異芒果苷的響應(yīng)值最高，275 nm 下色譜峰數(shù)目最多，因此確定258 nm 為含量測定波長，275 nm為圖譜測定波長。

3.2 指紋圖譜結(jié)果分析

12 批石膏-知母組合物IC 指紋圖譜、UPLC 指紋圖譜與對照圖譜的相似度均大于0.9，具有較好的一致性。聚類分析和主成分分析均能將12批石膏-知母組合物分為3 類，表明產(chǎn)地、加工方式、組合方式、生產(chǎn)工藝等因素均可影響石膏-知母組合物的質(zhì)量，由此可側(cè)面突出建立IC 指紋圖譜、UPLC 指紋圖譜的重要性，可全面反映石膏-知母組合物的整體化學(xué)信息[17]。

3.3 石膏-知母合煎組合物與石膏、知母單煎混合樣品的比較分析

IC 指紋圖譜中，石膏-知母合煎組合物中峰2 明顯高于知母提取物以及單煎合用樣品。此外，石膏提取物中未檢測到峰2，說明峰2 主要來源于知母，且與石膏合煎能促進(jìn)知母中峰2 所表征化合物的溶出。離子色譜常見的無機(jī)陽離子出峰順序?yàn)長i+、Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+。峰2 的保留時間在峰1（Na+）和峰3（K+）之間。雖然本研究沒有進(jìn)行峰2的指認(rèn)，但可推測其為NH4+離子。目前，暫未見有關(guān)石膏-知母中NH4+離子作用的相關(guān)文獻(xiàn)報道，有待繼續(xù)深入研究。

石膏-知母合煎組合物中Na+、K+、Mg2+峰面積/稱樣量明顯大于單煎混合樣品（P<0.05），這存在2種可能：1）2 味藥物的煎煮出膏率并無明顯變化，則表明合煎可明顯促進(jìn)Na+、K+、Mg2+溶出；2）石膏-知母合煎時可增強(qiáng)石膏細(xì)粉的保留，實(shí)際合煎石膏出膏率有增加，并減少石膏生產(chǎn)過程固形物的損耗[18]，導(dǎo)致這3種離子的量增多。就結(jié)果而言，合煎組合物樣品確比單煎混合的樣品Na+、K+、Mg2+量高，制劑過程不可不考慮。

UPLC指紋圖譜中，石膏-知母合煎組合物中峰1、峰2、峰3、峰6、新芒果苷、峰9、芒果苷、峰12、峰13峰面積/稱樣量與單煎混合樣品的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中組合物中僅有新芒果苷峰面積/稱樣量大于單煎混合樣品。同時，新芒果苷、知母皂苷BⅡ含量明顯高于單煎混合樣品（P<0.05），說明合煎能提高新芒果苷、知母皂苷BⅡ的溶出，這與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致[11,19]。綜上所述，合煎與單煎有顯著區(qū)別的成分可考慮納入石膏-知母制劑質(zhì)量研究的重點(diǎn)關(guān)注對象，本研究建立的方法可為石膏-知母組合物的質(zhì)量研究提供有效的方法支持。

藥對通常有2 味藥組成，療效確切，具備了復(fù)方的基本主治功能和療效，是聯(lián)系眾多中藥復(fù)方的紐帶。本研究采用IC 和UPLC 探究了石膏-知母藥對組合物中無機(jī)元素及有機(jī)化合物的組成情況，可為石膏-知母藥對及白虎湯等經(jīng)典方劑的質(zhì)量評價及物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供一定理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。