蔡曾曉瑞　胡相卡　桂留銘　齊沐爽　代春美

摘要：目的 探討三七總皂苷（PNS）對碘酸鈉所致視網(wǎng)膜損傷的保護作用及作用機制。方法 75只C57BL/6雄性小鼠，分為正常組、模型組和PNS低（50 mg·kg-1）、中（100 mg·kg-1）、高劑量（200 mg·kg-1）組，每組15只。PNS治療組小鼠按相應的劑量預保護7 d后，模型組和PNS治療組小鼠以25 mg·kg-1劑量尾靜脈注射碘酸鈉溶液，建立小鼠視網(wǎng)膜損傷模型。PNS治療組繼續(xù)灌胃給藥28 d。采用眼底照相及OCT檢測小鼠視網(wǎng)膜損傷情況；FFA法觀察視網(wǎng)膜血管滲漏情況；HE染色觀察小鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)變化；試劑盒檢測血清中抗氧化指標水平，ELISA法檢測小鼠血清中炎性細胞因子的表達水平；Western blot法檢測各組小鼠視網(wǎng)膜組織細胞核內(nèi)Nrf2、核內(nèi)NF-κB p65、HO-1與NQO1蛋白的表達情況。結果 與正常組比較，模型組小鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)大量的黃白色類似玻璃膜疣狀沉積，視網(wǎng)膜相對厚度下降（P<0.01），視網(wǎng)膜血管出現(xiàn)大面積的滲漏；血清中SOD活力與GSH含量下降（P<0.01），MDA、IL-6、TNF-α與IL-1β含量上升（P<0.01）。與模型組相比，PNS治療組小鼠視網(wǎng)膜黃白色類似玻璃膜疣狀沉積減少，視網(wǎng)膜相對厚度增加（P<0.05）、血管滲漏面積減少；血清中SOD活力與GSH含量上升（P<0.01），MDA、IL-6、TNF-α與IL-1β的含量下降（P<0.05）；視網(wǎng)膜組織細胞核內(nèi)Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表達上升（P<0.05），核內(nèi)NF-κB p65的蛋白表達減少（P<0.05）。結論 PNS可通過抗氧化應激與抗炎作用減弱碘酸鈉誘導的視網(wǎng)膜損傷，其機制可能與PNS激活Nrf2/HO-1信號通路有關。

關鍵詞：三七總皂苷；視網(wǎng)膜損傷；核因子NF-E2相關因子；血紅素氧合酶1；醌氧化還原酶1

中圖分類號：R285.5中圖分類號文獻標志碼：A文獻標識碼

Study on protective effect and mechanism of panax notoginseng saponins on retina injury induced by sodium iodate

CAI? Zengxiaorui，HU? Xiangka，GUI? Liuming，QI? Mushuang，DAI? Chunmei*

（Jinzhou Medical University， Jinzhou，Liaoning 121000， China）

Abstract： ?Objective To explore the protective effect and mechanism of panax notoginseng saponins （PNS） on retinal injury caused by sodium iodate. Methods 75 C57BL/6 male mice were divided into normal group， model group， and PNS low （50 mg·kg-1）， middle （100 mg·kg-1）， High-dose （200 mg·kg-1） groups， 15 mice per group. After 7 days of pre-protection of the mice in the PNS groups according to the corresponding dose， the mice in the model group and the PNS treatment groups were injected with sodium iodate solution 25 mg·kg-1 through the tail vein to establish a mice model of retinal injury. The PNS treatment groups continued to intragastric administration for 28 days after modeling. Fundus photography and OCT were used to detect the retinal damage of mice; FFA was used to observe the leakage of retinal vascular; HE staining was used to observe the pathological changes of mice retinal; kits were used to detect the level of antioxidant index in serum of mice， ELISA were used to detect the serum level of inflammatory factors; Western blot was used to detect the expression of Nrf2 （nucleus）， NF-κB p65 （nucleus）， HO-1， NQO1 proteins of retinal tissues. Results Compared with the control group， a large number of yellow white drusen-like deposits appeared in the retina， the thickness of the retina was decreased （P<0.01）， and extensive leakage of retinal blood vessels， the activity of SOD and the content of GSH were decreased in the serum （P<0.01）， and the content of MDA， IL-6， TNF-α and IL-1β were increased in the model group （P<0.01）. The yellow white drusen-like deposits in the retina of the administration groups were decreased， the thickness of the retina increased （P<0.05）， and the blood vessel leakage was reduced; the SOD activity and the content of GSH in the serum increased （P<0.01）， and the content of MDA， IL-6， TNF-α and IL-1β decreased （P<0.05）; the protein expression of Nrf2 in the nucleus and HO-1 and NQO1 in the retinal tissue were increased （P<0.05）， and the protein expression of NF-κB p65 in the nucleus was decreased （P<0.05）. Conclusion PNS could attenuate sodium iodate-induced retinal damage through anti-oxidative stress and anti-inflammatory effects. The mechanism might be related to the activation of Nrf2/HO-1 signaling pathway by PNS.

Key words： panax notoginseng saponins;retinal damage;nuclear factor erythroid 2-related factor 2;heme oxygenase 1;quinoneoxido-reductase-1

年齡相關性黃斑變性（age-related macular degeneration， AMD）是導致老年人視力下降和致盲的主要原因［1-2］，包括濕性和干性兩種類型。濕性AMD的治療目前主要使用靶向血管內(nèi)皮生長因子受體的藥物［3］；干性AMD早期發(fā)病機制與氧化應激和炎癥引起的視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium， RPE）細胞生理功能受損有關，病理表現(xiàn)主要為布魯赫氏膜和RPE細胞之間有玻璃膜疣沉積，光感受器細胞及RPE細胞地圖樣萎縮［4］。干性AMD的早期可使用抗氧化劑營養(yǎng)補充劑進行干預，如PreserVision AREDS 2（葉黃素10mg：玉米黃質2mg：維生素E 400IU：維生素C 500mg：鋅80mg：銅2mg），在某些干性AMD患者中，可降低AMD進展的風險，但療效欠佳［5-6］，對于干性AMD臨床上目前并無明確的治療方法［7-8］。碘酸鈉作為一種強氧化毒性劑，會使機體ROS增多，可特異性損傷RPE細胞，繼而引起感光細胞損傷，這種病理變化與人干性AMD相似，以碘酸鈉誘導的干性AMD小鼠模型已較為經(jīng)典［9-10］。三七總皂苷（panax notoginseng saponins， PNS）是從傳統(tǒng)中藥三七中提取的主要有效成分，其藥理作用包括抗炎、抗氧化和清除自由基等［11］，PNS通過其抗氧化功能對高糖誘導的視網(wǎng)膜毛細血管內(nèi)皮細胞的損傷產(chǎn)生保護作用［12］。PNS還可通過抑制視網(wǎng)膜的氧化應激與炎癥反應，對光損傷小鼠的光感受器細胞發(fā)揮保護作用［13］。PNS中主要成分人參皂苷Rb1與人參皂苷Rd在人視網(wǎng)膜色素上皮細胞中抑制脂多糖誘導的促炎基因表達［14］。目前，PNS對碘酸鈉誘導的小鼠視網(wǎng)膜損傷是否具有保護作用尚未見報道。本文將探討PNS對碘酸鈉誘導的小鼠視網(wǎng)膜損傷是否具有保護作用及可能的作用機制，為治療干性AMD提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

75只SPF級C57BL/6雄性小鼠，體重20～22 g，購自遼寧長生生物科技有限公司，許可證號：SCXK（遼）（2019-0003）。實驗動物的喂養(yǎng)及實驗相關操作于錦州醫(yī)科大學心腦血管重點實驗室內(nèi)進行，已經(jīng)取得錦州醫(yī)科大學動物倫理委員會的批準（IACUC-2019038），實驗期間小鼠自由攝食飲水。

1.2 主要試劑與儀器

三七總皂苷，純度：≥98%，批號：GR-19070601，購自上海廣銳生物科技有限公司；熒光素鈉，貨號：F809553；碘酸鈉，純度：99%，貨號：S817792，購自上海麥克林生化科技有限公司；戊巴比妥鈉，貨號：P3761，購于美國Sigma公司。Nrf2抗體（貨號：12721S）、HO-1抗體（貨號：43966S）購于美國Cell Signaling Technology生物公司；NQO1抗體（貨號：DF6437）購于Affinity Biosciences公司；NF-κB p65（貨號：A2547）、β-actin抗體（貨號：AC026）、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG抗體（二抗）（貨號：AS014）均購于ABclonal Technology公司；LaminB抗體（貨號：WL01775）購于沈陽萬類生物公司。Mouse TNF-α ELISA KIT（貨號：YX-201407M）、Mouse IL-6 ELISA KIT（貨號：YX-091206M），Mouse IL-1β ELISA KIT（貨號：YX-091203M）購于美國R&D公司；SOD試劑盒（貨號：A001-3），GSH試劑盒（A006-2-1），MDA試劑盒（貨號：A003-1）購于南京建成生物工程研究所有限公司。小動物眼底成像系統(tǒng)（美國Phoenix）；光學相干斷層掃描儀和血管造影儀（加拿大Optoprobe公司）；光學顯微鏡（德國Leica）；Multiskan Mk3型酶標儀（上海賽默飛世爾儀器有限公司產(chǎn)品）；蛋白電泳與轉膜系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及給藥

75只小鼠適應性喂養(yǎng)一周后，按體重隨機分為正常組、模型組、PNS低（50 mg·kg-1）、中（100 mg·kg-1）、高劑量組（200 mg·kg-1）［15］，每組15只。PNS溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，分別按上述劑量灌胃給藥預保護7 d，正常組與模型組小鼠灌胃等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。除正常組外，其余各組小鼠一次性鼠尾靜脈注射1%碘酸鈉溶液25 mg·kg-1［16-17］（碘酸鈉溶解于生理鹽水中，終濃度為1%），建立小鼠視網(wǎng)膜損傷模型；正常組注射等量的生理鹽水。繼續(xù)灌胃給藥28 d，各組小鼠給藥體積均為10 mL·kg-1。

1.3.2 眼底照相及光學相干斷層掃描（optical coherence tomography， OCT）

給藥結束后，以戊巴比妥鈉將小鼠麻醉后，使用復方托吡卡胺滴眼液散瞳，涂一層眼用凝膠于角膜。使用Retina Imaging System進行眼底照相，調整OCT鏡頭與參數(shù)進行觀察并拍照，利用Image J軟件分析視網(wǎng)膜相對厚度。

1.3.3 眼底熒光素鈉血管造影（fluorescein fundus angiography， FFA）

給藥結束后，將小鼠麻醉、散瞳，涂一層眼用凝膠于角膜，立即腹腔注射熒光素鈉（6mg·kg-1）溶液進行視網(wǎng)膜血管造影，然后采用Retina Imaging System檢測。

1.3.4 樣本的收集

實驗結束后，摘除小鼠左眼球取血，3000 r·min-1離心20min，分離血清，置于-80℃保存；左側眼球取出后用生理鹽水清洗眼球表面殘留血液，固定于改良的FFA固定液（冰醋酸∶甲醛∶生理鹽水∶75%乙醇=1∶2∶7∶10）［18］。將小鼠右側眼球取出，用生理鹽水清洗干凈，剝離視網(wǎng)膜，凍存于-80℃，備用。

1.3.5 蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin， HE）染色

小鼠左側眼球于改良的FFA固定液中固定24h，用石蠟包埋，以視神經(jīng)與角膜中心為軸向切片，厚度為5 μm，進行常規(guī)HE染色，使用光學顯微鏡觀察視網(wǎng)膜結構。

1.3.6 小鼠血清中SOD、GSH、MDA含量檢測

取出凍存于-80 ℃冰箱中的血清，按照南京建成生物工程研究所有限公司說明書要求分別進行測定。

1.3.7 小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量測定

取出凍存于-80 ℃冰箱中的血清，采用ELISA法分別對TNF-α、IL-6、IL-1β的含量進行檢測。

1.3.8 Western blot檢測小鼠視網(wǎng)膜組織蛋白表達

按照BCA蛋白定量法測定視網(wǎng)膜組織中的蛋白含量并繪制標準曲線。每組取40 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉膜封閉后分別加入相應的一抗孵育過夜，洗膜后加入二抗，通過化學發(fā)光試劑盒進行顯影成像。用Image J軟件計算目的條帶的相對蛋白表達量。

1.4 統(tǒng)計學分析

用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)結果以均數(shù)±標準差（±S）表示，多組間比較采用單因方差分析，方差齊則采用LSD法檢驗，方差不齊則采用Games-Howell法檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PNS對小鼠眼底的影響

與正常組相比，模型組小鼠眼底損傷嚴重，出現(xiàn)大量黃白色類似玻璃膜疣物質；經(jīng)PNS治療后各組小鼠眼底損傷減輕，黃白色類似玻璃膜疣物質有不同程度的減少，高劑量組減少最明顯，結果見圖1。

2.2 PNS對小鼠視網(wǎng)膜厚度的影響

正常組的視網(wǎng)膜各層結構排列整齊，密度均勻；與正常組相比，模型組小鼠視網(wǎng)膜結構排列紊亂，RPE層出現(xiàn)高反射點，光感受器層與外核層受損，視網(wǎng)膜相對厚度減?。≒<0.01）。

與模型組比較，中和高劑量治療組小鼠視網(wǎng)膜RPE層結構排列紊亂程度均有不同程度的減輕，RPE層高反射點減少，光感受器層與外核層受損程度減輕，且視網(wǎng)膜相對厚度增加（P<0.05，P<0.01），結果見表1和圖2。

2.3 PNS對小鼠眼底血管完整性的影響

正常組小鼠視網(wǎng)膜中血管充盈明顯，可清晰的看到各級血管分布情況；與正常組相比，模型組小鼠視網(wǎng)膜中次級血管分布不明顯，視網(wǎng)膜血管出現(xiàn)大面積滲漏；與模型組比較，經(jīng)PNS治療后，各組小鼠視網(wǎng)膜血管滲漏面積減少，高劑量組減少最明顯，結果見圖3。

2.4 PNS對小鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)學的影響

正常組小鼠視網(wǎng)膜各層細胞排列整齊且密度均勻，結構完整；與正常組相比，模型組小鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞層和RPE層的結構被破壞，并可見大量的棕褐色玻璃膜疣沉積；與模型組相比，經(jīng)PNS治療后各組小鼠視網(wǎng)膜光感受器細胞層和RPE層的結構損傷好轉，棕褐色玻璃膜疣數(shù)量減少，高劑量組減少最為明顯，結果見圖4。

2.5 PNS對小鼠血清中SOD、GSH、MDA水平的影響

與正常組相比，模型組小鼠血清中SOD活力、GSH含量下降，MDA含量上升（P<0.01）；與模型組 相比，PNS低、中和高劑量治療組小鼠血清中SOD活力上升（P<0.01），PNS中、高劑量治療組小鼠血清中GSH含量上升，MDA含量下降（P<0.05，P<0.01），結果見表2。

2.6 PNS對小鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影響

與正常組相比，模型組小鼠血清中IL-6、TNF-α與IL-1β含量升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組相比，PNS低、中與高劑量治療組小鼠血清中TNF-α、IL-6含量降低（P<0.05，P<0.01），PNS高劑量治療組IL-1β含量降低（P<0.05），結果見表3。

2.7 PNS對小鼠視網(wǎng)膜中Nrf2、HO-1、NQO1、NF-κB p65蛋白表達的影響

與正常組相比，模型組小鼠視網(wǎng)膜中細胞核內(nèi)Nrf2，HO-1、NQO1表達升高但無統(tǒng)計學意義，細胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白表達升高（P<0.05）；與模型組相比，PNS中、高劑量治療組小鼠視網(wǎng)膜中細胞核內(nèi)Nrf2，HO-1蛋白表達升高（P<0.05，P<0.01），核內(nèi)NF-κB p65表達減少（P<0.05，P<0.01）；PNS低、中和高劑量治療組小鼠視網(wǎng)膜中NQO1蛋白表達升高（P<0.05，P<0.01），結果見圖5和表4。

3 討論

AMD是一種病因不明的多因素誘發(fā)的眼底疾病，干性AMD發(fā)病機制與氧化應激、慢性炎癥等因素密切相關［19-20］。視網(wǎng)膜作為人體中耗氧量較多的組織之一。長期及持續(xù)的光線照射，豐富的多不飽和脂肪酸以及大量的光敏劑均增加了視網(wǎng)膜組織中ROS的生成，當ROS產(chǎn)生的增多并且超過機體的抗氧化應激能力時，會引起細胞蛋白質、脂質和DNA被修飾并進一步造成損傷［21］。長期的氧化應激狀態(tài)會使RPE細胞受損，RPE細胞的功能障礙，會進一步引起AMD的慢性炎癥過程，玻璃膜疣作為早期AMD病變的主要特點，是局部炎性反應的表現(xiàn)［22］，因此目前，降低機體氧化應激狀態(tài)和抑制炎癥反應，是防治干性AMD的重要措施。

本次實驗通過小鼠尾靜脈注射碘酸鈉誘導小鼠視網(wǎng)膜損傷，模擬干性AMD病理變化。通過觀察視網(wǎng)膜層次結構、測量視網(wǎng)膜相對厚度、比較玻璃膜疣沉積的數(shù)量，進一步探討PNS在體內(nèi)對干性AMD的治療是否有效。本研究發(fā)現(xiàn)給予碘酸鈉處理后，小鼠視網(wǎng)膜RPE層和光感受器層、外核層都出現(xiàn)了不同程度的損傷，出現(xiàn)大量玻璃膜疣沉積，說明小鼠視網(wǎng)膜氧化損傷模型制備成功。在給予PNS治療后，RPE層結構排列紊亂程度減輕、高反射點減少，光感受器層與外核層紊亂程度降低，并抑制視網(wǎng)膜相對厚度變薄，保護了視網(wǎng)膜血管的完整性，減少了玻璃膜疣的數(shù)量。提示PNS可減輕由碘酸鈉誘導的小鼠視網(wǎng)膜損傷。

SOD是機體中重要的抗氧化酶，可清除氧自由基；GSH作為機體中重要的還原劑，其含量的多少也是評價機體抗氧化應激能力的重要指標之一。MDA作為一種脂質過氧化反應產(chǎn)物，是自由基損害的標志［23-24］，可間接反映機體受氧化應激損害的程度。HO-1是血紅素降解的限速酶，通過上調 HO-1，可改善氧化應激引起的損傷［25］；NQO1作為一種黃素酶，可改善由代謝引起的氧化應激損傷，維持細胞內(nèi)物質處于氧化還原平衡狀態(tài)［26］。Nrf2信號通路是機體內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化應激信號通路。當細胞處于氧化應激狀態(tài)時，在細胞質中，Nrf2與它的抑制蛋白果蠅肌動蛋白結合蛋白Kelch解偶聯(lián)、并轉位入核激活靶基因轉錄進而調節(jié)下游多種保護性蛋白如SOD、GSH、HO-1與NQO1等基因的轉錄，清除過多的ROS，提高機體對氧化應激的抵抗能力［27-28］。NF-κB是經(jīng)典的炎癥信號分子，作為重要的核轉錄因子，介導一些炎癥因子的轉錄，參與調節(jié)炎癥反應、細胞凋亡等多種病理生理過程［29］。本研究中與對照組相比，模型組小鼠血清中SOD活力、GSH含量下降，MDA含量上升，說明模型組小鼠抗氧化應激能力不足；Nrf2/HO-1通路相關蛋白的表達升高，說明在碘酸鈉作用下，視網(wǎng)膜對氧化應激作出了適應性反應。經(jīng)PNS治療后，小鼠血清中SOD活力上升，GSH含量增加，MDA含量下降，Nrf2/HO-1通路相關蛋白Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達升高，說明PNS可提高機體抗氧化應激的能力，其可能是通過增加Nrf2/HO-1通路相關蛋白Nrf2的核內(nèi)的表達量，刺激下游抗氧化蛋白 HO-1、NQO1蛋白表達，提高抗氧化酶SOD活力、GSH含量，降低MDA含量，從而發(fā)揮抗氧化應激的作用。同時在碘酸鈉作用下，模型組小鼠視網(wǎng)膜組織細胞核中NF-κB信號通路中的關鍵蛋白NF-κB p65的表達上調，其下游炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的釋放增加。經(jīng)PNS干預后視網(wǎng)膜組織細胞核中NF-κB p65蛋白的表達下降，由NF-κB調控釋放的炎癥因子IL-6、IL-1β與TNF-α的表達水平下降，表明PNS具有抗炎作用。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PNS對碘酸鈉誘導的小鼠視網(wǎng)膜損傷有改善作用，同時明確了PNS對Nrf2/HO-1信號通路具有調控作用。

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（責任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：中文收稿日期2022-07-05

基金項目：遼寧省高等學校創(chuàng)新人才支持計劃項目（LR2019028）；遼寧省教育廳服務地方項目（JYTFW201915）

作者簡介：蔡曾曉瑞（1997—），女，碩士研究生，專業(yè)方向為中藥藥效學研究。

*通信作者：代春美（1977—），女，教授，從事中藥藥理及安全性評價、中藥生物質量控制方面的研究，e-mail：lnmupharmacy@163.com。