韓靜靜　柴夢(mèng)娟　朱麒元　栗燕

摘要：蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于MFS家族，該家族是已知最大的轉(zhuǎn)運(yùn)體家族。本研究采用“TA”克隆技術(shù)，從‘洛陽(yáng)紅牡丹中得到牡丹蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PsSUT1，基因序列全長(zhǎng)為1 846 bp，包含1 557 bp的開放閱讀框，編碼519個(gè)氨基酸。進(jìn)化樹分析顯示該基因序列在進(jìn)化過(guò)程中是保守的。蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性試驗(yàn)表明PsSUT1的表達(dá)使SUSY7/ura3酵母菌株能夠在蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說(shuō)明 PsSUT1編碼的蛋白具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性。亞細(xì)胞定位試驗(yàn)結(jié)果表明該蛋白定位于細(xì)胞膜。將PsSUT1基因異源轉(zhuǎn)化擬南芥，結(jié)果表明 PsSUT1轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗與野生型擬南芥相比，地上部分干重平均增加了46.35%，株高增加了50.44%，種莢數(shù)增加了40.54%；擬南芥蔗糖耐受性檢測(cè)中，PsSUT1轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)正常，根系明顯比野生型擬南芥植株長(zhǎng)，葉片發(fā)育也正常，沒(méi)有花青素積累。本研究為改善盆栽牡丹生長(zhǎng)與發(fā)育狀況提供分子生物學(xué)方面的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：牡丹；蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性；亞細(xì)胞定位；異源表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：中圖分類號(hào)S685;Q785;Q786文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

Functional study of sucrose transporter gene PsSUT1 in peony

HAN? Jingjing，CHAI? Mengjuan，ZHU? Qiyuan，LI? Yan*

（College of Landscape Architecture and Art，Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan 450002，China）

Abstract： ?Sucrose transporters belong to the MFS family， which is the largest known family of transporters.In this study， TA cloning technology was used to obtain the peony sucrose transporter gene PsSUT1 from Luoyanghong peony. The full-length gene sequence is 1 846 bp， including an open reading frame of 1 557 bp， encoding 519 amino acids. Phylogenetic tree analysis showed that the gene sequence was conserved during evolution. The sucrose transport activity assay showed that the expression of PsSUT1 enabled the SUSY7/ura3 yeast strain to grow on the medium with sucrose as the sole carbon source， indicating that the protein encoded by PsSUT1 has sucrose transport activity. The results of subcellular localization assay showed that the protein was localized to the cell membrane. The PsSUT1 gene was heterologously transformed into Arabidopsis， and the results showed that compared with wild-type Arabidopsis， the PsSUT1 transgenic positive seedlings increased the average dry weight of the aerial parts by 46.35%， the plant height by 50.44%， and the number of seed pods by 40.54%; In the Arabidopsis sucrose tolerance test， PsSUT1 transgenic plants grew normally， with significantly longer root systems than wild-type Arabidopsis plants， and normal leaf development without anthocyanin accumulation. This study provides theoretical evidence and technical support in molecular biology for improving the growth and development of potted peony.

Key words： peony;sucrose transporter gene;sucrose transport activity;subcellular localization;heterologous expression analysis

牡丹（Paeonia suffruticosa）屬多年生落葉灌木，因其花型繁多、花冠碩大、花色艷麗，故具有較高的觀賞價(jià)值，受到群眾的喜愛(ài)，這使得盆栽牡丹在國(guó)內(nèi)外花卉市場(chǎng)的需求量逐年上升。然而，牡丹盆栽種植后常常出現(xiàn)植株矮小、花蕾敗育的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了其觀賞價(jià)值，這已成為盆栽牡丹產(chǎn)業(yè)化發(fā)展中的瓶頸問(wèn)題［1］。已有研究［2］表明，牡丹盆栽種植后，由于根域受到限制，葉片光合速率降低，蔗糖供應(yīng)不足，從而導(dǎo)致盆栽植株生長(zhǎng)發(fā)育不良。通過(guò)對(duì)牡丹葉片、莖、花瓣、生長(zhǎng)根進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，這些部位胞間連絲較少，而且篩管伴胞復(fù)合體細(xì)胞壁內(nèi)突生長(zhǎng)，薄壁細(xì)胞胞間隙大，由此推測(cè)蔗糖在牡丹植株的裝載、運(yùn)輸、卸載過(guò)程可以通過(guò)質(zhì)外體途徑進(jìn)行，因此蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在這個(gè)過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用［3-4］。

SUT（Sucrose transporters protein）屬于主要易化子超家族（Major Facilitator Superfamily， MFS），是高度疏水性的蛋白質(zhì)，有12個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，擁有大約500～600個(gè)氨基酸［5］，是碳從源到“庫(kù)”器官分配的關(guān)鍵組成部分，并作為H+/蔗糖同向轉(zhuǎn)運(yùn)體，利用質(zhì)膜上的質(zhì)子梯度將蔗糖逆濃度梯度運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中［6］。根據(jù)其序列和結(jié)構(gòu)的相似性，SUTs可以分為五個(gè)亞族：SUT1、SUT2、SUT3、SUT4和SUT5。其中SUT1為雙子葉植物特有的基因，SUT3和SUT5為單子葉植物特有基因，SUT2和SUT4為單子葉植物和雙子葉植物共有的基因［7］。SUT1亞家族定位于篩管伴胞細(xì)胞質(zhì)膜，對(duì)蔗糖有適度的親和力，并能催化蔗糖被吸收到“庫(kù)”器官中［8］。水稻 OsSUT1 在沿運(yùn)輸途徑從質(zhì)外體獲取的蔗糖的韌皮部裝載中起作用［9］。大豆 GmSUT1 定位于質(zhì)膜，在根瘤菌共生過(guò)程中有助于蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)至根瘤，從而起到固定N2的作用［10］。SUT2亞家族蛋白通常定位于篩管細(xì)胞的質(zhì)膜上，參與“庫(kù)”器官韌皮部蔗糖的卸載［11］。SUT4亞家族蛋白定位于液泡膜或者細(xì)胞質(zhì)膜，參與植物韌皮部的蔗糖裝載［12］。

本研究在已獲得 PsSUT1基因全長(zhǎng)序列并初步分析其生物信息學(xué)特征的基礎(chǔ)上［13］，為了進(jìn)一步了解它的功能，本研究采用“TA”克隆法獲得了 PsSUT1基因，并對(duì)該蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，測(cè)定了PsSUT1蛋白的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性和亞細(xì)胞定位分析，并遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥，觀察并測(cè)定了轉(zhuǎn)基因擬南芥的形態(tài)特征、蔗糖含量和它對(duì)外源蔗糖的利用情況。為探尋盆栽牡丹生長(zhǎng)發(fā)育不良機(jī)理，改善盆栽牡丹生長(zhǎng)與發(fā)育狀況提供分子生物學(xué)方面的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料取自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)第三生活區(qū)7年生盆栽嫁接苗‘洛陽(yáng)紅牡丹（根砧為鳳丹），采集盛花期生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的植株上中輪花瓣，用錫箔紙包好，放入液氮中快速冷凍，然后在-80℃冰箱保存。煙草（Nicotiana tabacum）培養(yǎng)條件：25℃，濕度60%，16h光照，8h黑暗培養(yǎng)。哥倫比亞型擬南芥（Arabidopsis thaliana）培養(yǎng)條件：23℃，濕度60%，16h光照，8h黑暗培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 PsSUT1 的克隆

采用李永華改良版CTAB法分別提取牡丹‘洛陽(yáng)紅盛花期的花瓣的總RNA［14］，之后使用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Takara，中國(guó)大連）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第1條鏈。

根據(jù)NCBI PsSUT1的CDS區(qū)域序列，使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性克隆引物（表1）。用PrimeSTAR Max DNA Polymerase（Takara，中國(guó)大連）以提取的 cDNA 為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系共50 μL：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10 μL；dNTP Mixture 4 μL；上下游引物各2 μL；Template（cDNA）5 μL；PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1 μL；ddH2O 26 μL；反應(yīng)體系共50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，預(yù)變性1 min；98 ℃，變性10 s；60 ℃，退火10 s；68℃，延伸2 min；72℃，延伸10 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物使用1% 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，切膠回收并與T 載體進(jìn)行連接，而后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行LB平板藍(lán)白斑篩選并搖菌，送鄭州尚亞生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 PsSUT1 保守基序分析及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線軟件MEME （Multiple Expectation Max-imization for Motif Elicitation）工具（http：//meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi）進(jìn)行牡丹 PsSUT1 氨基酸保守基序（motif）分析。使用pfam32.0（http：//pfam.xfam.org/）對(duì)MEME分析得到的保守基序序列進(jìn)行在線分析。使用在線軟件SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）同源建模，對(duì)牡丹SUT1蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。

1.2.3 PsSUT1 蛋白蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性鑒定

使用引物 PsSUT1-Fb和 PsSUT1-Rb（表1）擴(kuò)增含有Spe I和Pst I限制性位點(diǎn)的全長(zhǎng) PsSUT1基因序列，然后構(gòu)建酵母表達(dá)載體pDR196-PsSUT1，轉(zhuǎn)化SUSY7/ura3酵母突變體。以空載體PDR196作為空白對(duì)照，將轉(zhuǎn)化成功的pDR196-PsSUT1和pDR196的酵母菌液，在2%蔗糖和2%葡萄糖為唯一碳源的SD篩選培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)。觀察其生長(zhǎng)情況，并拍照記錄。

1.2.4 亞細(xì)胞定位

使用Gateway技術(shù)構(gòu)建載體。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物 PsSUT1-Fc和 PsSUT1-Rc（表1），以1.2.1克隆得到的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過(guò)BP反應(yīng)獲得 pDONR207-PsSUT1入門載體，然后通過(guò)LR反應(yīng)將該入門載體與目的載體PK7WGF2.0 GFP進(jìn)行重組反應(yīng)，獲得PK7WGF2.0 GFP-PsSUT1超表達(dá)載體。將重組質(zhì)粒GFP-PsSUT1轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌AGL0中，用注射器將攜帶目標(biāo)基因的菌液注入煙草葉片中［15］。然后在23℃下對(duì)煙草進(jìn)行48h的培養(yǎng)。用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)煙草葉片的GFP熒光信號(hào)。

1.2.5 牡丹 PsSUT1在擬南芥的異源表達(dá)

1.2.5.1 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

參照1.2.4方法通過(guò)Gateway方法構(gòu)建 PsSUT1基因過(guò)表達(dá)載體。將1.2.4得到的PsSUT1的入門載體通過(guò)LR反應(yīng)連接得到PsSUT1基因的超表達(dá)載體。將構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至AGL0農(nóng)桿菌體中。通過(guò)浸花法進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，篩選后獲得轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株，培養(yǎng)至T3代并獲得純合株系，用于形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.5.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥形態(tài)學(xué)特征和蔗糖含量的測(cè)定

（1）T3 代 PsSUT1轉(zhuǎn)基因株系形態(tài)觀測(cè)

選取生長(zhǎng)周期為30 d的野生型擬南芥 WT 與 T3 代轉(zhuǎn) PsSUT1基因陽(yáng)性苗測(cè)定其形態(tài)學(xué)指標(biāo)如株高、種莢，并觀察其生長(zhǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)的情況。

（2）T3 代 PsSUT1轉(zhuǎn)基因株系地上部分干重測(cè)定

測(cè)量生長(zhǎng)30 d的野生型擬南芥和T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥的地上部分干重。隨機(jī)取3株擬南芥，去掉根部，放在65℃的烘箱中12 h至恒重，稱取總重量。地上部分干重=總重量/3，3次重復(fù)。

（3）T3 代 PsSUT1轉(zhuǎn)基因株系蔗糖含量測(cè)定

測(cè)定野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片和花瓣的蔗糖含量，參照張志良［16］的方法分別取干樣0.05g，3次重復(fù)。用SPSS 20.0分析不同組別間數(shù)值的差異。

1.2.5.3 PsSUT1基因?qū)ν庠凑崽堑睦?/p>

將野生型擬南芥和 PsSUT1基因的T3代轉(zhuǎn)基因株系和種子分別播種在蔗糖濃度為3%、6%、9%的MS培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)20 d，觀察其生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因PsSUT1的克隆

以盛花期‘洛陽(yáng)紅花瓣的cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到大約為1 600 bp的條帶（圖1）。經(jīng)測(cè)序鑒定，序列信息與NCBI登錄序列信息一致。PsSUT1基因（基因登錄號(hào)：KC542395）序列全長(zhǎng)為1 846 bp，包含1 557 bp的開放閱讀框，編碼519個(gè)氨基酸。

2.2 牡丹 PsSUT1 蛋白保守基序分析及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)在線軟件MEME對(duì)牡丹SUT1蛋白進(jìn)行保守基序分析（圖2），從中鑒定出6個(gè)保守基序，它們屬于MFS家族中MFS_2成員，該家族可以將蔗糖通過(guò)質(zhì)子/陽(yáng)離子同向轉(zhuǎn)運(yùn)，這6個(gè)保守基序排列順序一致，這表明SUT1亞家族的基因在進(jìn)化過(guò)程中是極其保守的。

使用SWISS-MODEL在線軟件對(duì)它的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析（圖3），結(jié)果表明，該蛋白含有一個(gè)保守的MFS結(jié)構(gòu)域，與 PsSUT1 蛋白最相近的模板為5a2n.1.A，序列相似度為27%，GMQE值為0.41，QMENA值為0.45，說(shuō)明匹配度適中。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)為同型二聚體，沒(méi)有檢測(cè)到蛋白-配體相互作用且蛋白氨基酸折疊相似度高。

2.3 牡丹 SUT1基因蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性分析

2.3.1 酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)SUSY7/ura3酵母突變體的轉(zhuǎn)化

以pMD18-T-PsSUT1質(zhì)粒為模板，使用 PsSUT1-Fb和 PsSUT1-Rb引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得用于酵母異源表達(dá)的 PsSUT1基因片段。將重組質(zhì)粒pMD18-T-PsSUT1和pDR196質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將酶切膠回收產(chǎn)物通過(guò)T4連接酶整合成酵母表達(dá)載體pDR196-PsSUT1。將構(gòu)建好的載體使用Spe I和Pst I酶進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示，凝膠電泳檢測(cè)出現(xiàn)兩條條帶，長(zhǎng)度與預(yù)期大小一致，說(shuō)明成功構(gòu)建了酵母重組表達(dá)載體pDR196-PsSUT1。

2.3.2 PsSUT1 蛋白蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性分析

將構(gòu)建的重組酵母表達(dá)載體pDR196-PsSUT1、pDR196質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至SUSY7/ura3酵母突變體之后，培養(yǎng)結(jié)果顯示（圖5），當(dāng)培養(yǎng)基的唯一碳源為蔗糖時(shí)，含pDR196-PsSUT1重組質(zhì)粒的酵母突變體可以正常生長(zhǎng)，而對(duì)照組含空載體pDR196的酵母突變體則不能良好生長(zhǎng)。

當(dāng)培養(yǎng)基的唯一碳源為葡萄糖時(shí)，含pDR196-PsSUT1重組質(zhì)粒的酵母突變體與對(duì)照組含空載體 pDR196 的酵母突變體生長(zhǎng)狀況一致，均能良好地生長(zhǎng)。這說(shuō)明牡丹PsSUT1基因能夠表達(dá)具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白。

2.4 牡丹 PsSUT1 蛋白亞細(xì)胞定位分析

2.4.1 亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建

使用Gateway反應(yīng)體系構(gòu)建載體，將目的基因與中間克隆載體 pDNOR207連接，形成入門克隆載體，再經(jīng)過(guò) LR 反應(yīng)獲得亞細(xì)胞定位載體PK7WGF2.0 GFP-PsSUT1。LR反應(yīng)菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖6所示，PCR產(chǎn)物大小與目的基因大小一致，菌液送尚亞公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與目的基因序列一致，說(shuō)明亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建成功。

2.4.2 PsSUT1 蛋白的亞細(xì)胞定位

將構(gòu)建好的GFP融合表達(dá)載體注射到煙草的下表皮組織內(nèi)，使連接了綠色熒光蛋白基因的 PsSUT1基因在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)。將注射后培養(yǎng)兩天的煙草葉片置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示（圖7）牡丹 PsSUT1 蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.5 牡丹 PsSUT1基因異源表達(dá)分析

2.5.1 轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定

構(gòu)建 PsSUT1基因過(guò)表達(dá)載體，為了檢驗(yàn)T0代轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性苗，提取PsSUT1轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖8所示。10株T0代轉(zhuǎn)PsSUT1基因擬南芥中9個(gè)有條帶，一個(gè)沒(méi)有條帶，有條帶的植株為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗。為了進(jìn)一步驗(yàn)證牡丹PsSUT1基因是否在擬南芥中穩(wěn)定表達(dá)，分別提取了3個(gè)株系的牡丹PsSUT1基因T3代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗和野生型擬南芥的總RNA進(jìn)行半定量檢測(cè)，以內(nèi)參基因Actin作為對(duì)照，結(jié)果如圖9所示，內(nèi)參基因在野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥中均正常表達(dá)，而目的基因PsSUT1在野生型擬南芥中不表達(dá)，但在T3代陽(yáng)性幼苗中正常表達(dá)，說(shuō)明PsSUT1基因在轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗中穩(wěn)定表達(dá)。

2.5.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥形態(tài)學(xué)特征測(cè)定

通過(guò)觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥T3代植株生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)20 d的擬南芥PsSUT1轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗與野生型擬南芥相比，生長(zhǎng)情況優(yōu)于野生型擬南芥（圖10A）。生長(zhǎng)45 d的擬南芥（圖10B，表2），3個(gè)株系的PsSUT1轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗與野生型擬南芥相比，地上部分干重平均增加了46.35%，株高增加了50.44%，種莢數(shù)增加了40.54%。結(jié)果表明牡丹PsSUT1基因可能促進(jìn)了植物體內(nèi)蔗糖的運(yùn)輸，從而促進(jìn)了植物的生長(zhǎng)發(fā)育。

2.5.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥蔗糖含量測(cè)定

以30 d的野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥（3個(gè)株系）的葉片和花瓣為試驗(yàn)材料進(jìn)行蔗糖含量的測(cè)定，結(jié)果顯示（圖11），野生型擬南芥葉片的蔗糖含量1.84 mg·g-1，3個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系葉片的平均蔗糖含量為1.25 mg·g-1，顯著下降32.06%。野生型擬南芥花瓣的蔗糖含量為1.19 mg·g-1，3個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系花瓣的平均蔗糖含量為3.43 mg·g-1，是野生型擬南芥的2.88倍。說(shuō)明PsSUT1基因在擬南芥中的過(guò)量表達(dá)可能促進(jìn)了光合產(chǎn)物在源葉韌皮部的裝載和在庫(kù)器官花瓣中的卸載，從而使轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中的蔗糖含量下降，而花瓣中的蔗糖含量增加。

2.5.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)外源蔗糖的利用

將轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥分別播種在蔗糖濃度為3%、6%和9%的培養(yǎng)基上，20 d后，擬南芥的生長(zhǎng)情況如圖12。在蔗糖濃度為3%的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥生長(zhǎng)均正常，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株明顯高于野生型擬南芥，平均根長(zhǎng)為2.6 cm，明顯高于野生型擬南芥根長(zhǎng)1.38 cm。在蔗糖濃度為6%和9%的培養(yǎng)基上，野生型擬南芥的生長(zhǎng)受到抑制，植株矮小，根系發(fā)育受阻，葉片中出現(xiàn)花青素的積累，而 PsSUT1轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)正常，根長(zhǎng)平均為2.3 cm和3 cm，葉片發(fā)育正常，沒(méi)有花青素積累。這表明PsSUT1基因可以促進(jìn)擬南芥對(duì)外源蔗糖的吸收和利用。

3 討論與結(jié)論

本研究從牡丹中克隆得到了蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 PsSUT1，該基因包含1 557 bp的開放閱讀框，編碼519個(gè)氨基酸。氨基酸保守基序分析發(fā)現(xiàn)牡丹PsSUT1基因氨基酸有6個(gè)保守基序，且Motif 1為MFS轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域。小麥 TaSUT1A 蛋白在33-253區(qū)有SUT基因特有的保守結(jié)構(gòu)域，屬于 MFS 基因家族［17］。菜豆 PvSUT1.1 蛋白7-239區(qū)［18］中也同樣發(fā)現(xiàn)了 MFS 家族保守結(jié)構(gòu)域。因此說(shuō)明 PsSUT1 蛋白在進(jìn)化過(guò)程中較為保守。

將牡丹 PsSUT1基因轉(zhuǎn)入缺陷型酵母 SUSY7/ura3中，酵母在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，恢復(fù)了酵母吸收利用蔗糖的能力，說(shuō)明 PsSUT1 具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性，這個(gè)與蘋果 MdSUT1基因［19］、甘薯 IbSUT3基因［20］和黃瓜CsSUT1基因［21］等的研究結(jié)果一致。自Riesmeier等［22］第1次通過(guò)利用酵母突變體，證明菠菜SoSUT1基因具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力，通過(guò)酵母突變體表達(dá)體系驗(yàn)證SUT家族基因蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力的方法被人們廣泛使用。因此推測(cè)牡丹 PsSUT1參與了植物體內(nèi)蔗糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，是具有蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能的膜蛋白。

擬南芥 AtSUC2基因作為牡丹PsSUT1基因同源基因，主要負(fù)責(zé)植物韌皮部蔗糖的運(yùn)輸功能，其突變體植株會(huì)出現(xiàn)植株矮小，營(yíng)養(yǎng)組織積累淀粉和蔗糖的現(xiàn)象［23］。馬鈴薯、玉米和水稻的SUT1基因突變體均出現(xiàn)蔗糖運(yùn)輸受損，積累在葉片中導(dǎo)致植株生長(zhǎng)發(fā)育不良［24］。本研究將牡丹PsSUT1基因在擬南芥中異源表達(dá)之后，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，葉片蔗糖含量顯著性下降，而花瓣中蔗糖含量顯著性上升，此外，轉(zhuǎn)基因擬南芥的株高、種莢數(shù)、地上部分干重也明顯增加。因此推測(cè)是因?yàn)檫^(guò)表達(dá)牡丹PsSUT1基因促使源葉中蔗糖裝載和花瓣蔗糖的卸載能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)了植物的生長(zhǎng)。蔗糖不僅是植物體內(nèi)碳代謝的必須來(lái)源，還可以作為信號(hào)分子參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育［25］。研究［26］表明，蔗糖可以特異性地調(diào)節(jié)相應(yīng)的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)錄與翻譯。擬南芥AtSUC1基因［27］會(huì)受到外源蔗糖影響表達(dá)量增加。本文研究發(fā)現(xiàn)，在高濃度的外源蔗糖培養(yǎng)基上，野生型的擬南芥生長(zhǎng)受到抑制，出現(xiàn)植株矮小，根系和葉片生長(zhǎng)弱且葉片花青苷積累的現(xiàn)象，而PsSUT1轉(zhuǎn)基因植株均能有效的緩解外源的高濃度蔗糖，生長(zhǎng)正常而且根系發(fā)育增強(qiáng)。說(shuō)明牡丹PsSUT1基因可能參與了植物蔗糖信號(hào)響應(yīng)過(guò)程，而促進(jìn)了植物體內(nèi)蔗糖裝載、運(yùn)輸和卸載過(guò)程。本研究為改善盆栽牡丹生長(zhǎng)與發(fā)育狀況提供生物學(xué)方面的理論證據(jù)和技術(shù)支撐。

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（責(zé)任編輯：編輯郭蕓婕）

收稿日期：中文收稿日期2022-08-03

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（192102110062）；河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（KJCX2019A05）

作者簡(jiǎn)介：韓靜靜（1996—），女，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)閳@林植物分子生物學(xué)。

*通信作者：栗燕（1978—），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，從事園林植物栽培生理與分子生物學(xué)方向的研究，e-mail：yanli1978@163.com。