徐國(guó)佳,蔣欣,夏濱,斯陸勤,黃建耿,李丹,張永軍

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院,石河子 832003;2.石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,石河子 832008;3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,武漢 430030;4.武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部,武漢 430022;5.北京大學(xué)深圳醫(yī)院藥學(xué)部,深圳 518000;6.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院,石河子 832099)

托伐普坦(tolvaptan,TVP)是由大冢制藥株式會(huì)社研發(fā)的首個(gè)新型口服非肽類選擇性抗利尿激素V2受體拮抗劑,2009年美國(guó)食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)用于高容性和等容性低鈉血癥的治療,包括充血性心力衰竭、肝硬化和不適當(dāng)抗利尿激素綜合征等引起的過量水潴留[1,2]。與傳統(tǒng)利尿劑不同,托伐普坦通過競(jìng)爭(zhēng)性阻斷精氨酸抗利尿激素與腎臟集合管上的抗利尿激素V2受體結(jié)合,抑制水通道蛋白2的激活,從而使V2受體介導(dǎo)的腎臟水重吸收降低,增加游離水的排泄而不損失電解質(zhì)或腎功能惡化,從而達(dá)到降低容量負(fù)荷且有效糾正低鈉血癥[3]。此外,美國(guó)、日本等國(guó)家除了上述適應(yīng)證外還被批準(zhǔn)用于常染色體顯性遺傳性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)的治療。然而,美國(guó)FDA發(fā)布托伐普坦在治療ADPKD患者過程中存在潛在的致命肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)[4]。

托伐普坦在體內(nèi)主要通過肝臟中CYP3A4代謝酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化,可降解形成多種結(jié)構(gòu)相似的代謝物,如氧化、羥基化和羧基化等代謝產(chǎn)物。托伐普坦口服后可迅速?gòu)哪c道吸收,絕對(duì)生物利用度約56%,與血漿蛋白結(jié)合率高達(dá)98%,其清除主要發(fā)生在糞便中,僅<1%以原型從腎臟排泄[5]。目前,關(guān)于托伐普坦的研究主要集中在托伐普坦在血漿中含量測(cè)定方面,例如HOSHIKAWA等[6]和JIANG等[7]采用LC-MS/MS法測(cè)定了人血漿中的托伐普坦及2或5種代謝物的含量;FURUKAWA等[8]也通過LC-MS/MS測(cè)定了大鼠血清中托伐普坦及其9種I相代謝物的藥動(dòng)學(xué)。然而,關(guān)于托伐普坦代謝物的定性分析幾乎沒有報(bào)道,僅MAZZARINO等[9]通過構(gòu)建人肝微粒體與各種代謝酶共孵育模型從體外闡述托伐普坦的I相和II相代謝譜,分離和鑒定出20種托伐普坦代謝物。筆者未檢索到體內(nèi)托伐普坦代謝物譜研究報(bào)道,托伐普坦的體內(nèi)代謝過程亟需進(jìn)一步研究。

近年來,高分辨質(zhì)譜由于具有快速、靈敏、專屬的特點(diǎn),可廣泛篩查出預(yù)期和未預(yù)期的微量代謝物,極大地提升了代謝產(chǎn)物鑒定效率,已成為藥物化學(xué)成分及其體內(nèi)代謝過程研究的利器[10]。例如,超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatograph-quadrupole-exactive orbitrap high-resolution mass spectrometry,UFLC-Q-exactive orbitrap MS)技術(shù),具有高分辨率、高選擇性、高準(zhǔn)確度和精確的結(jié)構(gòu)表征,即使在沒有對(duì)照品的情況下,對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的微量代謝產(chǎn)物和非目標(biāo)物的分析和鑒定均有良好效果[11]。因此,本研究作者采用UFLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術(shù),系統(tǒng)分析大鼠血漿、尿液和糞便中托伐普坦的代謝產(chǎn)物,探究托伐普坦在大鼠體內(nèi)的代謝途徑,以期為探究托伐普坦的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 托伐普坦原料藥(含量≥99%)由武漢友聯(lián)述康醫(yī)藥技術(shù)有限公司提供;聚維酮K29/32和羥丙甲基纖維素分別購(gòu)于美國(guó)國(guó)際特品公司和上海振興化工有限公司;甲醇和乙腈(色譜級(jí))購(gòu)于美國(guó)Fisher Scientific公司;其他常用分析純規(guī)格試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UFLC超快速液相色譜(日本Shimadzu公司);Q-Exactive Orbitrap質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);MDF-U53V低溫保存箱(日本SANYO公司);MS105DU 型電子天平(美國(guó)Mettler Toledo公司,感量:0.01 mg);SPD1010真空旋轉(zhuǎn)濃縮儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2方法

1.2.1托伐普坦對(duì)照品溶液 精密稱取托伐普坦原料藥,用甲醇溶解得到1 mg·mL-1托伐普坦儲(chǔ)備液后,再用50%甲醇逐級(jí)稀釋為100 ng·mL-1的對(duì)照品溶液,用于UFLC-Q-Exactive Orbitrap分析。

1.2.2托伐普坦固體分散體溶液 以1：2比例精密稱取托伐普坦原料藥和聚維酮K29/32,用無(wú)水乙醇充分溶解,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到托伐普坦固體分散體。精密稱取托伐普坦固體分散體粉末溶于羥丙甲纖維素溶液(1%)配成6 mg·mL-1托伐普坦固體分散體溶液。

1.2.3動(dòng)物給藥及樣本處理 6～8周齡成年Sprague Dawley大鼠,體質(zhì)量(200±20 g),6只,購(gòu)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心。將大鼠置于代謝籠中,控制溫度為(25±2) ℃、光照(12 h光/暗周期)飼養(yǎng)1周,自由飲水,給藥前禁食12 h。按60 mg·kg-1灌胃給藥托伐普坦固體分散體溶液后,分別收集0、1、3、6 h的血液及0～24 h的尿液和糞便。

糞便自然干燥研磨成粉末,用乙腈超聲溶解,然后分別合并各時(shí)間點(diǎn)的血液、尿液和均質(zhì)化后的糞便,加入乙腈(1：5)沉淀蛋白,4 ℃,15 000 r·min-1離心10 min后,取上清液于45 ℃條件下?lián)]干,然后再加入50%甲醇復(fù)溶100 μL,離心后上清液用于檢測(cè)。

1.2.4檢測(cè)條件 色譜條件:色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18Column(2.1 mm×100 mm,1.7 μm,Waters Co.,Milford,MA,USA);流動(dòng)相A:水(含0.1% 甲酸),流動(dòng)相B:乙腈(含0.1%甲酸);柱溫:40 ℃;梯度洗脫程序如下:0.01～12.00 min 30%→40% B;12.00～18.00 min 40%→70% B;18.00～18.01 min 70%→95% B;18.01～20.00 min 95% B;20.00～20.01 min 90%→30% B;20.01～22.00 min 30% B;流速:0.3 mL·min-1;進(jìn)樣體積:10 μL。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI);正離子掃描模式監(jiān)測(cè);毛細(xì)管溫度:320 ℃;電噴霧電壓:4 500 V;輔助氣流速:10 arb;掃尾氣流速:3 arb;鞘氣流速:35 arb;碰撞能量:10/15/25 V;掃描范圍:m/z50～1 000 Da(全掃)。

1.2.5數(shù)據(jù)處理 采用Xcalibur 2.0版軟件(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)采集和處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。根據(jù)精確分子質(zhì)量、元素組成、二級(jí)碎片離子、保留時(shí)間和可能發(fā)生反應(yīng)信息篩選出潛在代謝物,用Chemdraw 19.0中的Clog P值對(duì)異構(gòu)體進(jìn)行了表征,Clog P較高的代謝物通常保留時(shí)間較長(zhǎng)[12]。然后,與之前發(fā)表的文獻(xiàn)[9]進(jìn)行比較,分析鑒定出以前未檢測(cè)到的新代謝物。

2 結(jié)果

2.1托伐普坦質(zhì)譜裂解規(guī)律分析 在ESI正離子模式下,托伐普坦的碎片離子和裂解模式信息,如圖1所示。托伐普坦保留時(shí)間為14.49 min,母離子[M+H]+為m/z449.1621(C26H25ClN2O3),二級(jí)質(zhì)譜碎片中m/z252處有最高響應(yīng)豐度,這是苯并氮雜環(huán)和其余部位之間的酰胺鍵斷裂,導(dǎo)致形成豐度最高的碎片離子m/z252。在更高碰撞能下,m/z119處也檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于甲基苯甲酰胺部位裂解的碎片離子。

圖1 托伐普坦的碎片離子和裂解模式信息Fig.1 Fragmentation ion and fragmentation pattern information of tolvaptan

2.2托伐普坦體內(nèi)代謝物分析 對(duì)大鼠給藥前后的血漿、尿液和糞便進(jìn)行正離子模式下分析,結(jié)合精確分子質(zhì)量、保留時(shí)間、二級(jí)碎片離子、Clog P值等參數(shù),共初步鑒定出35種代謝物,代謝產(chǎn)物提取離子流色譜圖見圖2,具體質(zhì)譜信息見表1。

表1 托伐普坦在大鼠血漿、尿液、糞便中的代謝產(chǎn)物Tab.1 Metabolites of tolvaptan in plasma,urine and feces of rat

圖2 托伐普坦代謝產(chǎn)物提取離子流色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatograms of tolvaptan metabolites

M1(tR=1.63 min)和M2(tR=2.06 min)準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z347.115 9和m/z347.115 2,推測(cè)其分子式為C18H19ClN2O3。二級(jí)質(zhì)譜碎片中m/z252處沒有代表性的碎片離子,而m/z134處有最高響應(yīng)豐度,可能是由二級(jí)碎片m/z252中甲基苯甲酰胺部位水解所得;根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰推測(cè)苯并氮雜環(huán)還可能發(fā)生羥基化,可推測(cè)其為托伐普坦的酰胺鍵水解及羥基化產(chǎn)物。

M3(tR=2.14 min),M4(tR=2.66 min)準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z389.125 9和m/z389.126 0,推測(cè)其分子式為C20H21ClN2O4。比酰胺鍵水解羥基化代謝物(M1和M2)高出42 Da,在m/z176、196、347處存在碎片離子,m/z176可能是在特征碎片離子m/z134上發(fā)生乙?；?推測(cè)兩者均為托伐普坦的酰胺鍵水解羥基化乙酰化代謝物。

M5(tR=2.73 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z363.110 2,推測(cè)其分子式為C18H19ClN2O4。比托伐普坦酰胺鍵水解代謝物(M8)高32 Da。m/z134、212處存在碎片離子,表示甲基苯甲酰胺部位的水解和苯并氮雜環(huán)上有修飾。32 Da的差異可能是由于兩個(gè)羥基的存在或苯并氮雜環(huán)的水解羧基化所致,由于保留時(shí)間和文獻(xiàn)中報(bào)告的數(shù)據(jù),第二種解釋似乎更有可能[8,13],推測(cè)其為托伐普坦的酰胺鍵水解及苯并氮雜環(huán)水解羧基化代謝物。

M6(tR=2.74 min)和M7(tR=3.32 min)準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z345.099 5和m/z345.099 9,推測(cè)其分子式為C18H17ClN2O3。比酰胺鍵水解及羥基化代謝物(M1和M2)少2 Da,且在m/z134處存在碎片離子,推測(cè)兩者均為托伐普坦的酰胺鍵水解羥基化脫氫代謝物。

M8(tR=3.33 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z331.120 3,推測(cè)其分子式為C18H19ClN2O2。在m/z134(而不是m/z252)處存在碎片離子,表示甲基苯甲酰胺部位發(fā)生水解,推測(cè)其為托伐普坦的酰胺鍵水解代謝物。M9(tR=3.85 min)、M12(tR=4.59 min)、M15(tR=4.85 min)和M28(tR=10.76 min)準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z481.153 2、m/z481.152 7、m/z481.152 2和m/z481.151 5,推測(cè)其分子式為C26H25ClN2O5。比托伐普坦高32 Da,可能發(fā)生二羥基化。M9,M12和M15在m/z178、196、268處存在碎片離子信息,表明苯并氮雜環(huán)和甲基苯甲酰胺部位都有可能發(fā)生羥基化;而M28在m/z119、252處存在碎片離子,表明僅在苯并氮雜環(huán)上發(fā)生修飾,由于該代謝物的保留時(shí)間高于羥基化代謝物,因此推測(cè)其可能在苯并氮雜環(huán)上發(fā)生水解和羧化。

M10(tR=3.96 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z343.084 4,推測(cè)其分子式為C18H15ClN2O3,比酰胺鍵水解羥基化脫氫代謝物(M6、M7)低2 Da,推測(cè)其為托伐普坦的酰胺鍵水解羥基化二脫氫代謝物。

M11(tR=4.05 min)、M16(tR=4.99 min)、M20(tR=6.02 min)和M34(tR=16.49 min)準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z479.137 1,m/z479.1363,m/z479.138 9和m/z479.136 7,推測(cè)其分子式為C26H23ClN2O5。M11、M16在m/z178、266、461處有碎片信息,推測(cè)在甲基苯甲酰胺部位發(fā)生羥基化脫氫且苯并氮雜環(huán)上也可能發(fā)生羥基化;M20中的碎片離子m/z268可能是在甲基苯甲酰胺部位發(fā)生羥基化,而碎片離子m/z345可能是甲基苯甲酰胺部位發(fā)生水解后且苯并氮雜環(huán)上發(fā)生羥基化脫氫,因此推測(cè)M20為二羥基化二脫氫代謝物;M34有m/z119、252特征碎片離子,推測(cè)僅在苯并氮雜環(huán)上發(fā)生修飾,可能為羥基取代或發(fā)生羧化脫氫,結(jié)合保留時(shí)間考慮,M34可能是苯并氮雜環(huán)水解且發(fā)生羧化脫氫代謝物。

M13(tR=4.62 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z641.188 9,推測(cè)其分子式為C32H33ClN2O10。在m/z180、268、444、465處存在碎片離子,m/z465比母離子少176 Da,推測(cè)是母離子丟失一份葡萄糖醛酸基,綜合m/z268、444碎片離子信息,可能在m/z252特征結(jié)構(gòu)上發(fā)生羥基化和葡萄糖醛酸化。因此,推測(cè)其為托伐普坦的羥基化脫氫葡萄糖醛酸化代謝物。

M14(tR=4.67 min)、M19(tR=6.02 min)、M21(tR=8.29 min)、M23(tR=6.72 min)和M25(tR=7.32 min)準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z477.121 3、m/z477.120 9、m/z477.121 0、m/z477.121 1和m/z477.120 7,推測(cè)其分子式為C26H21ClN2O5,這些代謝物在m/z133、210、266處都有碎片信息,表明在甲基苯甲酰胺部位發(fā)生羥基化脫氫且苯并氮雜環(huán)上也可能發(fā)生羥基化脫氫,推測(cè)它們?yōu)橥蟹テ仗苟u基化二脫氫代謝物。

M17(tR=5.06 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z329.104 8,推測(cè)其分子式為C18H17ClN2O2,M17比酰胺鍵水解代謝物(M8)低2 Da,推測(cè)其為托伐普坦酰胺鍵水解及苯并氮雜環(huán)上羥基脫氫代謝物。

M18(tR=5.34 min)、M29(tR=10.85 min)和M30(tR=12.54 min)準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z463.141 7、m/z463.141 4和m/z463.141 4,推測(cè)其分子式為C26H23ClN2O4。M18在m/z135、266處有碎片離子,表明僅在甲基苯甲酰胺部位上發(fā)生羥基化脫氫;M29和M30在m/z119、252、445處收集到較強(qiáng)信號(hào),表明甲基苯甲酰胺部位上沒有發(fā)生取代,可能在苯并氮雜環(huán)上發(fā)生羥基化脫氫。

M22(tR=7.29 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z361.094 9,推測(cè)其分子式為C18H17ClN2O4,比酰胺鍵水解裂解苯并氮雜環(huán)羧化代謝物(M5)低2 Da,推測(cè)其為托伐普坦的酰胺鍵水解裂解苯丙氮雜環(huán)羧化脫氫代謝物。

M24(tR=7.77 min)、M26(tR=9.14 min)、M27(tR=9.46 min)和M35(tR=16.57 min)準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z465.157 5、m/z465.157 1、m/z465.157 2和m/z465.157 5,推測(cè)其分子式為C26H25ClN2O4,比托伐普坦多16 Da,推測(cè)這些化合物可能是托伐普坦發(fā)生羥基化。M24、M26和M35在m/z178、196、252處存在特征性碎片離子,表明苯并氮雜環(huán)上發(fā)生羥基化;而M27在m/z211、252、447處存在碎片離子,表明僅在苯并氮雜環(huán)上發(fā)生修飾,根據(jù)文獻(xiàn)和保留時(shí)間,推測(cè)其為托伐普坦苯并氮雜環(huán)發(fā)生水解及脫氫代謝物。

M31(tR=14.25 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z461.125 9,推測(cè)其分子式為C26H21ClN2O4,比托伐普坦羥基化代謝物少4 Da,在m/z119、252處存在特征碎片離子,推測(cè)其為托伐普坦的苯并氮雜環(huán)上發(fā)生羥基化二脫氫代謝物。

M32(tR=14.43 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z431.151 8,推測(cè)其分子式為C26H23ClN2O2,碎片離子m/z119、252為特征碎片離子,m/z178(非m/z180)可能是苯并氮雜環(huán)上的羥基脫水,推測(cè)其為托伐普坦脫水代謝物。

M33(tR=16.00 min)準(zhǔn)分子離子峰為m/z447.146 9,推測(cè)其分子式為C26H23ClN2O3,比托伐普坦少2 Da,沒有m/z135、268碎片信息,只檢測(cè)到m/z119、178、252碎片信息,表明僅苯丙氮雜環(huán)上的羥基發(fā)生了氧化,推測(cè)其為托伐普坦羥基氧化代謝物。

2.3托伐普坦的體內(nèi)代謝途徑分析 從大鼠血漿、尿液和糞便中共鑒定出35個(gè)代謝物,推測(cè)其相關(guān)的代謝途徑見圖3。通過與前期研究結(jié)果比對(duì)[9],代謝物M1、M2、M5、M8、M17、M22、M24、M26、M27、M28、M33、M34、M35為已發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物,另外22種化合物為本研究新發(fā)現(xiàn)的托伐普坦代謝物。

A.羥基化;B.羧基化;C.酰胺鍵水解;D.脫氫;E.雜環(huán)水解;F.脫水;G.乙?；?H.葡萄糖醛酸化。圖3 托伐普坦代謝途徑總結(jié) A.hydroxylation;B.carboxylation;C.amide bond hydrolysis;D.dehydrogenation;E.heterocyclic hydrolysis;F.dehydration;G.acetylation;H.glucuronidation.Fig.3 Summary of tolvaptan metabolic pathways

托伐普坦吸收入血后,在血液中檢測(cè)到23種代謝物,尿液中檢測(cè)到26種代謝物,糞便中檢測(cè)到30種代謝物。托伐普坦在血液、尿液和糞便中主要以羥基化、羧基化、水解、脫氫以及上述反應(yīng)組合的形式存在,而乙?；Y(jié)合產(chǎn)物只在尿液和糞便中檢測(cè)到,葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物只在尿液中檢測(cè)到。

3 討論

本研究采用UFLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS系統(tǒng)聯(lián)合Xcalibur 2.0版數(shù)據(jù)分析軟件,對(duì)托伐普坦在大鼠血漿、尿液和糞便中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行全面鑒定與分析,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)以及各代謝物的保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量和特征碎片離子分析,共鑒定出35種代謝物,其中在血漿中檢測(cè)到23種,尿液中檢測(cè)到26種、糞便中檢測(cè)到30種,為托伐普坦的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

研究表明,托伐普坦在大鼠體內(nèi)的半衰期為1.6～2.5 h[8]。為了保證在實(shí)驗(yàn)過程中收集更多的代謝產(chǎn)物,血漿樣品的收集時(shí)間點(diǎn)選定為0、1、3、6 h這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)。藥物進(jìn)入體內(nèi)后,在多種藥物代謝酶的生物轉(zhuǎn)化下,化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,由無(wú)藥理活性轉(zhuǎn)化為有藥理活性或毒性代謝物。CYP3A4和CYP3A5代謝酶為托伐普坦的主要代謝酶[9,14]。本研究發(fā)現(xiàn)托伐普坦在大鼠體內(nèi)經(jīng)過CYP3A4和CYP3A5代謝酶生成包括不同位置的羥基化、羧基化、水解、脫氫以及上述反應(yīng)組合的I相代謝物,然后通過血液循環(huán)運(yùn)輸至各個(gè)組織發(fā)揮其藥理作用。有研究發(fā)現(xiàn)單羥基代謝物具有相對(duì)較弱的V2受體拮抗活性,可能有助于托伐普坦的利尿作用[15];而代謝物M34是在人血漿中檢測(cè)到濃度最高的托伐普坦代謝物,它無(wú)利尿作用,最近有報(bào)道發(fā)現(xiàn)代謝物M28和M34通過抑制肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能導(dǎo)致肝臟疾病[7,16]。本研究發(fā)現(xiàn),托伐普坦的II相代謝產(chǎn)物乙?；Y(jié)合產(chǎn)物只在尿液和糞便中檢測(cè)到,葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物只在尿液中檢測(cè)到,主要可能與乙?；Y(jié)合產(chǎn)物和葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物的高水溶性相關(guān)[17]。此外,由于葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物通過膽汁排泄后,容易被腸道菌群水解[18],這也可能是托伐普坦葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物只在尿液中檢測(cè)到的原因之一。

與MAZZARINO等[9]的體外研究相比,本研究從大鼠體內(nèi)鑒定出22種未報(bào)道的代謝物。值得注意的是,雖在體內(nèi)鑒定出II相代謝物,但托伐普坦在體內(nèi)的代謝主要以I相不同位置的羥基化、羧基化和開環(huán)裂解為主,這可能是托伐普坦生成具有較強(qiáng)水溶性代謝物主要從糞便中消除的一個(gè)原因。另外,托伐普坦是一個(gè)具有手性季碳中心的外消旋體,它的羥基化代謝物也具有手性。本研究建立了一種簡(jiǎn)便、選擇性高的分析方法可以將同分異構(gòu)體較好地分開,但對(duì)于其確切的結(jié)構(gòu)還需借助手性柱才能確定具體結(jié)合位點(diǎn)。在分析鑒定過程中發(fā)現(xiàn)托伐普坦具有多組同分異構(gòu)體代謝產(chǎn)物,母體藥物本身結(jié)構(gòu)含有氯元素會(huì)產(chǎn)生同位素峰,在分離和鑒定過程中藥物代謝物通過高壓電離進(jìn)入真空區(qū)域時(shí)可能發(fā)生離解,產(chǎn)生與藥物母體離子相同的源內(nèi)碎片以及相似的保留時(shí)間造成假陽(yáng)性代謝物[19-20],因此,在分析鑒定過程中要特別注意利用保留時(shí)間和特征碎片離子信息來識(shí)別假陽(yáng)性峰。

本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)代謝過程的角度研究了托伐普坦在大鼠體內(nèi)的代謝情況,對(duì)托伐普坦在體內(nèi)的代謝途徑和代謝時(shí)的相互轉(zhuǎn)化進(jìn)行了初步推測(cè),為托伐普坦的藥效和毒性物質(zhì)基礎(chǔ)提供了一定的依據(jù),對(duì)保障托伐普坦臨床使用的安全性和有效性具有重要意義。