董佳琪 房濤 偶勇 危靖怡 胡龍泉 李媛媛 晁旭，6

作者單位：712046 咸陽1陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院；727031 銅川2銅川職業(yè)技術(shù)學(xué)院孫思邈醫(yī)學(xué)院；

712046 咸陽3陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院；710038 西安4空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院介入疼痛科；

712046 咸陽 陜西中醫(yī)藥大學(xué)5第二附屬醫(yī)院科研科，6基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，具有惡性程度高、死亡率高、預(yù)后不良、缺乏早期診斷的生物標(biāo)志物等特點，其主要的病理類型是肝細(xì)胞癌，占肝癌患者的75%～85%，其次是肝內(nèi)膽管癌（10%～15%）以及其他罕見類型［1］。肝癌的治療策略主要包括手術(shù)切除、介入治療和放療等，然而大多數(shù)肝癌患者診斷時通常已為中晚期，因此錯過手術(shù)切除的最佳時間［2］。近年來，分子靶向藥物雖然大幅度提高了肝癌患者的生存率，但是依舊無法避免耐藥性［3］。因此，迫切需要探索新的肝癌治療策略。

在20 世紀(jì)20 年代，奧托·沃伯格首次觀察到“Warburg效應(yīng)”，其發(fā)現(xiàn)即使在氧氣供應(yīng)充足的條件下，腫瘤細(xì)胞也傾向于將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸，同時指出腫瘤細(xì)胞中糖酵解增強(qiáng)是由于腫瘤細(xì)胞線粒體功能損傷所導(dǎo)致［4］。目前，通過有氧糖酵解的高水平碳通量已被確定為腫瘤疾病的新特征，而有氧糖酵解的典型特征是增強(qiáng)葡萄糖攝取和乳酸的產(chǎn)生［5］。研究表明，肝癌的有氧糖酵解功能增強(qiáng)會促進(jìn)癌細(xì)胞生長和侵襲［6］。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，部分天然中草藥及其活性成分可能通過作用于糖酵解而抑制腫瘤細(xì)胞生長，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［7］。蔓荊子黃素（Vitexicarpin）是從單葉蔓荊果實中分離出的類黃酮［8］，具有抗炎［9］、護(hù)肝［10］和抗癌［11-12］的活性。在肝癌中，已有研究報道蔓荊子黃素可通過誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡抑制肝癌細(xì)胞生長［13］。然而，目前還沒有報道顯示蔓荊子黃素對肝癌細(xì)胞生長的抑制是否與糖代謝重編程有關(guān)。本研究旨在探討蔓荊子黃素對肝癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞糖代謝重編程的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人肝癌細(xì)胞SNU-368（CBP60213）和SNU-739（CBP60219）購自南京科佰生物科技有限公司，人肝永生化細(xì)胞THLE-2 購自美國ATCC 細(xì)胞庫（CRL-2706TM）。蔓荊子黃素（純度＞98%）購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；RPMI-1640 和DMEM 培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司；胎牛血清購自生工生物工程（上海）股份有限公司；過表達(dá)HIF-1α 慢病毒及其陰性對照慢病毒均購自上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司；MTS 試劑（G3581）購自美國Promega 公司；RNA 提取試劑盒（9112）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR036A）、qPCR 定量試劑盒（RR820A）購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；葡萄糖檢測試劑盒購自美國Molecular Probes公司；乳酸檢測試劑盒購自美國BioVision公司；細(xì)胞氧耗儀（782 Oxygen Meter 氧電極）購自美國Strathkelvin 公司；pH 計（PB-11 Basic Meter）購自德國Sartorius公司；蛋白定量檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司；5-氟尿嘧啶（5-FU）、嘌呤霉素（P8230）購自北京索萊寶科技有限公司；聚偏二氟乙烯膜、鼠單抗C-MYC 抗體購自美國Invitrogen 公司；鼠單抗P53 抗體購自美國Dako公司；兔單抗HIF-1α抗體購自英國Abcam 公司；兔多抗β-actin 抗體購自天德悅（北京）生物科技有限責(zé)任公司；羊抗兔二抗、超敏電化學(xué)發(fā)光法（ECL）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。PCR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及慢病毒感染

肝癌細(xì)胞SNU-368、SNU-739 應(yīng)用含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基，人肝永生化細(xì)胞THLE-2 應(yīng)用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

將對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞SNU-368、SNU-739 分別鋪種于6 孔板，每孔約為5×105個細(xì)胞。待細(xì)胞培養(yǎng)24 h，細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%時，棄去上清液，用過表達(dá)HIF-1α 慢病毒液和陰性對照慢病毒液分別感染SNU-368 和SNU-739 細(xì)胞。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，在培養(yǎng)基中加入0.5 μg/mL 的嘌呤霉素，每2 d 更換1次培養(yǎng)基。用0.5μg/mL嘌呤霉素篩選14 d后，通過qRT-PCR 和Western blot 實驗檢測慢病毒感染效果，收集慢病毒感染成功的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 MTS實驗測定細(xì)胞活力

1.3.1 不同濃度蔓荊子黃素對肝癌細(xì)胞活力的影響將對數(shù)生長期的SNU-368、SNU-739和THLE-2細(xì)胞分別接種于96 孔板中，每孔約1×104個細(xì)胞，向每孔加入100μL培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。預(yù)先用RPMI-1640 和DMEM 培養(yǎng)基將DMSO 溶解的蔓荊子黃素母液分別稀釋到0.5、1.0、2.0μmol/L。待細(xì)胞貼壁后，分別加入100 μL 不同濃度（0.5、1.0、2.0μmol/L）的蔓荊子黃素溶液；另以0 h不加蔓荊子黃素溶液的細(xì)胞為對照，以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基為空白對照。各組分別于培養(yǎng)0、12、24、48、72 h 時，向每孔添加20 μL MTS-PMS 溶液，于37 ℃繼續(xù)孵育2 h 后，用酶標(biāo)儀測定490 nm波長處的光密度（OD）值。相對細(xì)胞活力=（加藥細(xì)胞組OD 值-空白對照組OD 值）/（對照組OD值-空白對照組OD值）。

1.3.2 蔓荊子黃素對過表達(dá)HIF-1α 肝癌細(xì)胞活力的影響 將HIF-1α過表達(dá)慢病毒感染前后的SNU-368、SNU-739 細(xì)胞分別接種于96 孔板中，每孔約1×104個細(xì)胞，向每孔加入100 μL 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，每個樣品設(shè)3 個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，按照Control 組、Vitexicarpin組、LV-Control組、HIF-1α組和LV-HIF-1α+Vitexicarpin 組的分組每孔分別加入共100μL 的加藥（1.0μmol/L 蔓荊子黃素）或不加藥培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，按照“1.3.1”的操作步驟用酶標(biāo)儀測定OD 值，并計算相對細(xì)胞活力。

1.4 克隆形成實驗檢測細(xì)胞克隆形成能力

1.4.1 不同濃度蔓荊子黃素對肝癌細(xì)胞克隆形成能力的影響 將SNU-368、SNU-739、THLE-2 細(xì)胞分別按每孔1×103個細(xì)胞的密度接種到6 孔平板上培養(yǎng)24 h，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，分別加入3 mL 含相應(yīng)種類及濃度藥物（0.5、1.0、2.0 μmol/L 蔓荊子黃素或10 μmol/L 5-FU）的培養(yǎng)基，并以只加等量培養(yǎng)基的細(xì)胞為對照；繼續(xù)培養(yǎng)各組細(xì)胞，3 d 換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)10 d 后，用4%多聚甲醛固定及結(jié)晶紫染色后，使用Image J 軟件計算每孔的菌落數(shù)。

1.4.2 蔓荊子黃素對過表達(dá)HIF-1α 的肝癌細(xì)胞克隆形成能力的影響 將HIF-1α 過表達(dá)慢病毒感染前后的SNU-368、SNU-739細(xì)胞分別按每孔1×103個細(xì)胞的密度接種到6 孔平板上培養(yǎng)24 h，每個樣品設(shè)3 個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，按照Control 組、Vitexicarpin 組、LV-Control組、HIF-1α組和LV-HIF-1α+Vitexicarpin 組的分組每孔分別加入共3 mL 的加藥（1.0 μmol/L 蔓荊子黃素）或不加藥培養(yǎng)基，然后按照“1.4.1”的操作步驟處理各組細(xì)胞后，用Image J 軟件計算每孔的菌落數(shù)。

1.5 葡萄糖攝取水平、細(xì)胞外乳酸含量及pH、細(xì)胞氧耗的檢測

將對數(shù)生長期的各組肝癌細(xì)胞分別接種至6 孔板，用含4 500 mg/L 葡萄糖的DMEM 培養(yǎng)基100 μL培養(yǎng)12 h，分別加入含有蔓荊子黃素（1.0 μmol/L）和不含蔓荊子黃素（control）的培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，待用。以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基孔為空白對照。在細(xì)胞培養(yǎng)液收集后的2 min內(nèi)檢測細(xì)胞外pH；應(yīng)用葡萄糖檢測試劑盒、乳酸試劑盒及GENiosPlus 多功能酶標(biāo)儀檢測OD 值，計算葡萄糖攝取水平和細(xì)胞培養(yǎng)基中的乳酸含量。相對葡萄糖攝取量=（加藥細(xì)胞組OD 值-空白對照組OD 值）/（對照組OD 值-空白對照組OD 值），相對乳酸生成量=（加藥細(xì)胞組OD 值-空白對照組OD 值）/（對照組OD 值-空白對照組OD值）。葡萄糖攝取水平、細(xì)胞外乳酸含量和pH 的檢測結(jié)果均先采用細(xì)胞蛋白總量（BCA 法測定）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正后，再進(jìn)行各組之間的比較。應(yīng)用細(xì)胞氧耗儀檢測細(xì)胞氧耗。待細(xì)胞氧耗檢測實驗完成后，選取一段約3～5 min 較平直穩(wěn)定的線段計算細(xì)胞氧耗率（OCR）。OCR 的計算公式：OCR=選定線段的斜率/細(xì)胞數(shù)。

1.6 Western blot 檢測HIF-1α、P53 和C-MYC 蛋白的表達(dá)

各組肝癌細(xì)胞經(jīng)胰酶常規(guī)消化并離心后，用含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解，提取細(xì)胞中的總蛋白并利用BCA 蛋白定量測定細(xì)胞蛋白濃度。使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，在恒定電壓100 V 下轉(zhuǎn)膜，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗，于4 ℃下孵育過夜；用TBST 緩沖液洗膜后，加入二抗，于37 ℃下孵育1 h，再用TBST緩沖液洗膜。采用ECL 檢測試劑盒檢測蛋白的表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

1.7 qRT-PCR 檢測HIF-1α、P53、C-MYC mRNA 的表達(dá)水平

各組肝癌細(xì)胞經(jīng)胰酶常規(guī)消化后，用RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)的總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后，通過qPCR 定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 檢測。PCR反應(yīng)條件：95 ℃30 s，95 ℃10 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 引物序列：HIF-1α 的正向引物為5'-GTCGGACAGCCTCACCAAACAGAGC-3'，反向引物為5'-GTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAG-3'；P53 的正向引物為5'-GAGGATTCACAGTCGGATA-3' ，反向引物為5'-ATCATCTGGAGGAAGAAGTT-3'；C-MYC 的正向引物為5'-GTTTGCTGTGGCCTCCAGCAGAAG-3'，反向引物為5'-CTTCCCCTACCCTCTCAACGACAG-3'；β-actin的正向引物為5'-CCCA-GB-CCATGTACGTTGCAT-3'，反向引物為5'-TCACC-GGAGTCCATCACGAT-3'。每個樣品均設(shè)置3 個復(fù)孔。選擇β-actin 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算HIF-1α、P53 和C-MYC mRNA的相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，先進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗，滿足正態(tài)分布和方差齊性后，多組間采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Bonferroni 檢驗等進(jìn)行多重比較，兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蔓荊子黃素抑制肝癌細(xì)胞增殖

MTS 實驗結(jié)果（圖1A）顯示，肝癌細(xì)胞SNU-368、SNU-739 和人肝永生化細(xì)胞THLE-2 經(jīng)不同濃度蔓荊子黃素（0.5、1.0、2.0 μmol/L）分別處理12、24、48、72 h 后，同一濃度組SNU-368 和SNU-739 細(xì)胞的活力均隨時間的增加而降低，而THLE-2細(xì)胞在2.0μmol/L蔓荊子黃素處理48 h 時才被明顯抑制（P＜0.05）。進(jìn)一步比較48 h時蔓荊子黃素各濃度組間的細(xì)胞活力，MTS 實驗結(jié)果（圖1B）顯示，SNU-368 和SNU-739 細(xì)胞活力隨蔓荊子黃素濃度增加而降低；而THLE-2 細(xì)胞各濃度組與對照組相比，僅2.0μmol/L蔓荊子黃素組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果（圖1C）顯示，與相應(yīng)Control組比較，0.5μmol/L蔓荊子黃素能顯著抑制SNU-739 細(xì)胞的集落形成能力（P＜0.05），但不能顯著抑制SNU-368細(xì)胞的集落形成能力（P＞0.05）；10μmol/L 5-FU 和1.0μmol/L、2.0μmol/L 蔓荊子黃素均可明顯抑制SNU-368和SNU-739細(xì)胞的集落形成能力（均P＜0.01），且2.0 μmol/L 蔓荊子黃素還可抑制THLE-2 細(xì)胞的集落形成能力（P＜0.05）。以上研究結(jié)果表明蔓荊子黃素呈時間及劑量依賴性抑制SNU-368和SNU-739細(xì)胞的增殖。

圖1 蔓荊子黃素對肝癌細(xì)胞SNU-368和SNU-739增殖的影響Fig.1 Effects of Vitexicarpin on the proliferation of liver cancer cells SNU-368 and SNU-739 cells

本研究進(jìn)一步選擇1.0 μmol/L 蔓荊子黃素處理SNU-368、SNU-739 和THLE-2 細(xì)胞，并以10 μmol/L 5-FU 作為陽性對照，比較各組細(xì)胞的集落形成能力，MTS 實驗結(jié)果（圖1D）顯示，1.0μmol/L 蔓荊子黃素組和10 μmol/L 5-FU 組細(xì)胞的集落形成能力差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。綜上，蔓荊子黃素處理肝癌細(xì)胞的最適濃度為1.0μmol/L，故選擇該濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 蔓荊子黃素對肝癌細(xì)胞糖代謝的影響

1.0μmol/L 的蔓荊子黃素分別作用于SNU-739 和SNU-368 細(xì)胞48 h 后，檢測各組細(xì)胞的葡萄糖攝取水平、乳酸生成水平、細(xì)胞外培養(yǎng)液pH值和氧耗率，結(jié)果（圖2）顯示，與Control組相比，蔓荊子黃素組SNU-739和SNU-368 細(xì)胞的葡萄糖攝取水平和乳酸生成水平均明顯降低（均P＜0.01），細(xì)胞外培養(yǎng)液的pH 值明顯升高（均P＜0.01），細(xì)胞氧耗率也明顯增加（均P＜0.01）。

圖2 蔓荊子黃素對肝癌細(xì)胞SNU-368和SNU-739糖代謝的影響Fig.2 Effects of Vitexicarpin on glucose metabolism in liver cancer cells SNU-368 and SNU-739

2.3 蔓荊子黃素抑制轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α的表達(dá)

qRT-PCR（圖3A）和Western blot 檢測結(jié)果（圖3B）顯示，與Control 組比較，蔓荊子黃素組SNU-368 和SNU-739細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá)均降低（均P＜0.05），而P53和C-MYC的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

圖3 蔓荊子黃素對HIF-1α、p53 和C-MYC 表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Vitexicarpin on the expression of HIF-1α, p53 and C-MYC

2.4 蔓荊子黃素通過HIF-1α調(diào)控糖代謝重編程而減弱肝癌細(xì)胞的生長能力

qRT-PCR（圖4A）和Western blot（圖4B）檢測結(jié)果顯示，與LV-Control組相比，HIF-1α 組肝癌細(xì)胞SNU-739 和SNU-368 中HIF-1α 的表達(dá)均明顯升高（均P＜0.05）；與Control 組相比，Vitexicarpin 組肝癌細(xì)胞中HIF-1α 的表達(dá)明顯降低（均P＜0.05），而LV-Control 組則無明顯變化（均P＞0.05）；過表達(dá)HIF-1α 的肝癌細(xì)胞進(jìn)一步加入蔓荊子黃素治療后，肝癌細(xì)胞中HIF-1α 的表達(dá)較HIF-1α 組明顯降低（均P＜0.05），表明蔓荊子黃素可負(fù)向調(diào)控HIF-1α的表達(dá)。

圖4 蔓荊子黃素通過HIF-1α調(diào)控糖代謝重編程而減弱肝癌細(xì)胞的生長能力Fig.4 Vitexicarpin weaked the growth ability of liver cancer cells by regulating glucose metabolism reprogramming through HIF-1α

本研究進(jìn)一步比較各組細(xì)胞的葡萄糖攝取水平、乳酸生成水平、細(xì)胞外培養(yǎng)液pH 值及氧耗率，結(jié)果（圖4C）顯示，LV-Control 組與Control 組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；與Control 組相比，Vitexicarpin 組的葡萄糖攝取水平和乳酸生成水平減少（均P＜0.01），細(xì)胞外培養(yǎng)液的pH 值升高（均P＜0.01），細(xì)胞氧耗率增加（均P＜0.01）；與LV-Control 組相比，HIF-1α 組的葡萄糖攝取水平和乳酸生成水平增加（均P＜0.01），細(xì)胞外培養(yǎng)液的pH值降低（均P＜0.01），細(xì)胞氧耗率降低（均P＜0.01）；與HIF-1α組相比，LV-HIF-1α+Vitexicarpin組葡萄糖攝取水平和乳酸生成水平減少（均P＜0.01），細(xì)胞外培養(yǎng)液的pH 值升高（均P＜0.01），細(xì)胞氧耗率增加（均P＜0.01）。

MTS實驗結(jié)果（圖4D）和克隆形成實驗結(jié)果（圖4E）顯示，LV-Control 組肝癌細(xì)胞的活力和集落形成能力與Control 組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；與Control組相比，Vitexicarpin組肝癌細(xì)胞的活力和集落形成能力明顯降低（均P＜0.01）；與LV-Control 比較，HIF-1α 組肝癌細(xì)胞的活力和集落形成能力均明顯增強(qiáng)（均P＜0.05）；與HIF-1α 組相比，LV-HIF-1α+Vitexicarpin 組肝癌細(xì)胞的活力和集落形成能力均明顯降低（均P＜0.05）。以上研究結(jié)果表明，蔓荊子黃素可通過HIF-1α 調(diào)控糖代謝重編程而減弱肝癌細(xì)胞的生長能力。

3 討論

大量研究表明，來自天然產(chǎn)物的化合物可在體內(nèi)外降低多種人類癌細(xì)胞的活力［14-15］。蔓荊子黃素作為蔓荊子的主要化學(xué)成分，已有大量研究表明其可抑制肝癌［16］、黑色素瘤［17］、口腔鱗狀細(xì)胞癌［18］等腫瘤細(xì)胞增殖，并呈一定的時間及劑量依賴性；還可誘導(dǎo)子宮頸癌［19］、肝癌［13］及胃癌［20］等腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯和凋亡進(jìn)而降低癌細(xì)胞的生存能力。本研究采用不同濃度蔓荊子黃素處理肝癌細(xì)胞SNU-368 和SNU-739，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)蔓荊子黃素可呈時間及劑量依賴性抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并且在適宜濃度（1.0 μmol/L）及合適時間（48 h）下不會對正常肝細(xì)胞的增殖造成影響。

代謝重編程是腫瘤的十大特征之一，在促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，其中糖代謝異常是多種類型癌癥最具代表性的代謝特征［5］。研究［21］表明，肝癌的糖代謝變化主要包括以下方面：⑴有氧糖酵解增強(qiáng)，從而導(dǎo)致葡萄糖生成乳酸和核苷酸；⑵增強(qiáng)氨基酸和脂類的合成代謝，破壞三羧酸（TCA）循環(huán)和增加使用谷氨酰胺作為碳源；⑶腫瘤誘導(dǎo)的磷酸戊糖途徑上調(diào)，增加減少輔酶Ⅱ循環(huán)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷；⑷增加葡萄糖攝取和消耗。與正常細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞在有氧糖酵解增強(qiáng)的同時，線粒體氧化磷酸化功能顯著降低?？紤]到線粒體氧化磷酸化功能抑制與糖酵解速率異常升高同為“Warburg效應(yīng)”的重要組成部分，因此本研究同時探討了蔓荊子黃素對肝癌細(xì)胞中有氧糖酵解（葡萄糖攝取水平、乳酸生成水平、細(xì)胞外培養(yǎng)液pH 值）和氧化磷酸化（細(xì)胞氧耗率［22］）的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蔓荊子黃素處理肝癌細(xì)胞SNU-368 和SNU-739 后，細(xì)胞葡萄糖攝取水平和乳酸生成水平顯著降低，同時細(xì)胞外培養(yǎng)液pH 值和細(xì)胞氧耗率也顯著提高，提示蔓荊子黃素可抑制肝癌細(xì)胞糖代謝重編程、促進(jìn)有氧磷酸化。

有研究表明，代謝重編程可由癌基因和腫瘤抑制因子對關(guān)鍵代謝酶效應(yīng)物的調(diào)節(jié)而實現(xiàn)［23］，其中有氧糖酵解中的關(guān)鍵限速酶，如HK、PFK 和PKs等已被報道在肝癌的進(jìn)展過程中增加［24］。糖酵解的第一步是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)葡萄糖在質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)，而葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）可被癌基因C-MYC、KRas和HIF-1α激活而被腫瘤抑制因子P53 抑制。還有研究表明，轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α、C-MYC 和P53 在有氧糖酵解和氧化磷酸化的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［3，25］。其中，HIF-1α 作為關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，可通過激活大量參與糖酵解的基因轉(zhuǎn)錄，從而在腫瘤有氧糖酵解中發(fā)揮重要作用［26-28］。近年來，還有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的代謝重編程受缺氧和腫瘤微環(huán)境等多種不同因素的調(diào)控，在缺氧或炎癥微環(huán)境下，HIF-1α誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞顯著增加其葡萄糖攝取和乳酸產(chǎn)生水平［3，29］。此外，HIF-1α還可通過轉(zhuǎn)錄激活丙酮酸脫氫酶激酶1（PHK1）的表達(dá)而抑制丙酮酸脫氫酶（PDH）的活性，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的氧化磷酸化［30］。目前已有大量研究證明HIF-1α 的激活是包括肝細(xì)胞癌在內(nèi)的多種癌癥的共同特征［27-28，31］。本研究檢測蔓荊子黃素對肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α、C-MYC 和P53表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蔓荊子黃素對C-MYC和P53表達(dá)無明顯影響，但可顯著抑制HIF-1α 的表達(dá)，提示蔓荊子黃素可能通過HIF-1α 調(diào)控肝癌細(xì)胞糖代謝重編程。進(jìn)一步構(gòu)建HIF-1α 過表達(dá)的肝癌細(xì)胞SNU-368和SNU-739 的穩(wěn)定細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α 過表達(dá)后肝癌細(xì)胞中HIF-1α 表達(dá)上調(diào)，葡萄糖攝取水平和細(xì)胞外乳酸含量增加，細(xì)胞外培養(yǎng)液的pH 值和氧耗率增加，細(xì)胞增殖能力也增強(qiáng)，而進(jìn)一步用蔓荊子黃素處理后，上述增強(qiáng)作用均被逆轉(zhuǎn)，說明蔓荊子黃素可能通過HIF-1α 調(diào)控肝癌細(xì)胞糖代謝重編程而減弱肝癌細(xì)胞的生長能力。

綜上所述，本研究結(jié)果表明蔓荊子黃素可抑制肝癌細(xì)胞的生長，而這種作用可能是通過調(diào)控HIF-1α而抑制細(xì)胞糖酵解實現(xiàn)的。該研究結(jié)果為蔓荊子黃素在肝癌防治中的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。然而，蔓荊子黃素在體內(nèi)對肝癌的活性以及蔓荊子黃素調(diào)控HIF-1α 及糖代謝重編程的具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。