哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系(150081) 馬宇杰 田 偉 張 薇 劉美娜

【提 要】 目的 篩選鐵死亡相關(guān)長鏈非編碼RNA(ferLncRNA)構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型,并進(jìn)行肺腺癌患者的生存預(yù)測。方法 通過相關(guān)性分析、癌組織-癌旁組織差異分析,獲得差異表達(dá)的鐵死亡相關(guān)LncRNA(DEferlncRNA),使用配對(duì)算法獲得DEferlncRNA pairs。利用LASSO Cox篩選與生存相關(guān)DEferlncRNA pairs,多因素Cox回歸分析并構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型;計(jì)算ROC曲線的AUC值評(píng)估模型。利用單因素和多因素Cox回歸分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是否具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值;分析生存時(shí)間、臨床病理特征和化療療效等在高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間的差別。結(jié)果 相關(guān)性分析獲取512個(gè)ferlncRNA,差異分析獲得53個(gè)DEferlncRNA,配對(duì)算法獲得1243個(gè)DEferlncRNA pairs。LASSO Cox分析獲得40個(gè)與生存相關(guān)DEferlncRNA pairs,多因素分析得到17個(gè)DEferlncRNA pairs構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型;模型的AUC為0.776。單因素和多因素分析提示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可作為肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)的獨(dú)立預(yù)后因素?；颊呋熕幬锩舾行?、TNM分期、臨床分期、生存時(shí)間和生存狀態(tài)在高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 利用DEferlncRNA構(gòu)建的肺腺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型,可為預(yù)測肺腺癌患者預(yù)后提供依據(jù)。此外,低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者對(duì)化療藥物敏感,將為肺腺癌患者臨床治療提供參考。

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一,根據(jù)組織病理學(xué),分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC,85%)和小細(xì)胞肺癌(15%),其中肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是NSCLC的主要病理類型[1]。早期通過手術(shù)治療肺腺癌可以獲得較好地治療效果,但其總體生存率仍然很低,5年生存率僅為18%;免疫抑制、細(xì)胞增殖、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、藥物抵抗等因素與肺腺癌患者低生存率緊密關(guān)聯(lián)[2-3]。鐵死亡是一種鐵依賴性新型的程序性死亡方式;鐵代謝異常會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長,是癌癥發(fā)生的危險(xiǎn)因素;與正常細(xì)胞相比,癌細(xì)胞在增殖過程中過度依賴鐵離子;激活鐵死亡通路有望改善癌癥化療藥物耐藥的困境,為癌癥治療提供新的治療方向[4-5]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)為大于200bps的RNA分子,其不直接編碼蛋白質(zhì),但能調(diào)節(jié)蛋白編碼基因的表達(dá)與蛋白質(zhì)的合成[6],更重要的是,LncRNA與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移等癌癥相關(guān)事件高度相關(guān)[7]。鐵死亡相關(guān)LncRNA作為一類特殊的LncRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮極為重要的作用,影響癌癥患者的預(yù)后,有望成為腫瘤治療新靶點(diǎn),如LncRNA LINC00336通過與ELAVL1相互作用降低癌細(xì)胞內(nèi)鐵離子和脂類ROS含量,發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。LUAD患者ferlncRNA相關(guān)特征與其預(yù)后價(jià)值的關(guān)系研究甚少,因此,本研究利用DEferlncRNA pairs構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型,可以評(píng)估LUAD患者預(yù)后,并為肺腺癌患者臨床治療提供相關(guān)依據(jù)。

方 法

1.肺腺癌患者 LncRNA 和臨床數(shù)據(jù)的收集

在UCSC Xena網(wǎng)站(https://xenabrowser.net/)下載肺腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),包括526例癌組織和59例正常肺組織,根據(jù)Ensembl(http://asia.ense.ensembl.org)GTF文件對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行注釋,區(qū)分mRNA和LncRNA。通過UCSC Xena網(wǎng)站獲取肺腺癌患者臨床信息,提取性別、年齡、TNM分期、臨床分期、生存時(shí)間和生存狀態(tài)等臨床特征,剔除生存時(shí)間不足30天的樣本以及重復(fù)樣本,共納入489例腫瘤樣本和59例正常樣本,其中腫瘤樣本中生存時(shí)間為1年、3年、5年的病例分別有393例、132例、51例。

2.肺腺癌鐵死亡相關(guān)LncRNA的獲取

從FerrDb數(shù)據(jù)庫[9]提取259個(gè)鐵死亡相關(guān)基因,通過相關(guān)性分析提取并篩選肺腺癌ferlncRNA。篩選標(biāo)準(zhǔn):相關(guān)系數(shù)大于0.4,P小于0.001。利用R軟件“l(fā)imma”包篩選癌組織和正常肺組織差異鐵死亡相關(guān)LncRNA(DEferlncRNA);以FDR<0.05及|log(FC)| >1.5為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

3.DEferlncRNA配對(duì)規(guī)則[10]

首先,構(gòu)建DEferlncRNA pairs 0或1表達(dá)矩陣,將DEferlncRNA進(jìn)行兩次循環(huán)配對(duì)。假設(shè)C為lncRNA A加lncRNA B所構(gòu)成DEferlncRNA pairs;如果LncRNA A表達(dá)量高于LncRNA B,則C標(biāo)記為1,否則C標(biāo)記為0;然后,得到每個(gè)樣本C的表達(dá)情況,在所有的樣本中計(jì)算C為0或1的比例。由于沒有一定等級(jí)的DEferlncRNA pairs無法正確預(yù)測患者的預(yù)后,因此當(dāng)DEferlncRNA pairs的表達(dá)量為0或1的比例介于20%與80%之間時(shí),可以認(rèn)為DEferlncRNA pairs與預(yù)后有關(guān)。

4.建立風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型

5.模型的評(píng)價(jià)

使用“survivalROC”包繪制多個(gè)時(shí)間點(diǎn)ROC曲線,分別計(jì)算1年、3年和5年AUC值評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型,繪制ROC曲線計(jì)算約登指數(shù),確定模型的最佳臨界值;根據(jù)臨界值,將肺腺癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組,加載“survminer”包繪制Kaplan-Meier曲線分析高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存差異;對(duì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分進(jìn)行單因素和多因素Cox回歸分析,確定風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是否具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值。

6.統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析由R 4.1.0版軟件完成。利用χ2檢驗(yàn)分析各個(gè)臨床特征的高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間的差異。采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)分析各臨床特征不同組之間的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分差異。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較化療藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)在高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間的差異。

結(jié) 果

1.DEferlncRNAs的篩選

鐵死亡相關(guān)基因與肺腺癌患者LncRNA進(jìn)行相關(guān)性分析,獲得512個(gè)ferlncRNA;在腫瘤樣本和正常樣本之間進(jìn)行差異分析獲得53個(gè)DEferlncRNAs,見圖1A;其中43個(gè)表達(dá)上調(diào),10個(gè)表達(dá)下調(diào),見圖1B。本研究納入489例肺腺癌患者的臨床基線資料,見表1。

2.DEferlncRNApairs的篩選

53個(gè)DEferlncRNAs通過配對(duì)算法獲得1243個(gè)有意義的DEferlncRNA pairs。單因素分析篩選出147個(gè)與預(yù)后相關(guān)的DEferlncRNA pairs,LASSO Cox回歸分析獲得40個(gè)DeferlncRNA pairs。

3.肺腺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的建立

將上述40個(gè)DEferlncRNA pairs進(jìn)行多因素Cox回歸分析,篩選出17個(gè)DEferlncRNA pairs構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型,見表2和圖2;其中HR值均大于1的DEferlncRNA pairs為TYMSOS|AC145343.1、AC010789.1|AC111149.2、LINC00511|AC145343.1、Z98257.1|AP004608.1、LINC01614|DRAIC、AL033397.1|AC010719.1、LINC00973|AC027288.3、LINC01977|AC010719.1。

4.肺腺癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的評(píng)價(jià)

圖3B顯示繪制多個(gè)時(shí)間點(diǎn)ROC曲線,1年、3年、5年AUC分別為0.776、0.760、0.726;將1年ROC曲線與其他的臨床特征比較,見圖3C;利用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式計(jì)算每位患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分;根據(jù)ROC曲線得到風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分cut-off值為2.035,見圖3D;以此為臨界值,100例患者被納入高風(fēng)險(xiǎn)組,389例患者被納入低風(fēng)險(xiǎn)組。圖4A顯示每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)值分布;圖4B提示高風(fēng)險(xiǎn)組患者有更差的生存狀況。Kaplan-Meier分析表明生存時(shí)間在高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間有差異,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖4C。

5.風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分具有獨(dú)立預(yù)后價(jià)值

剔除臨床特征信息不完整的肺腺癌樣本后,共有469例樣本納入分析。通過單因素Cox回歸分析,臨床分期[P<0.001,HR=1.591,95%CI(1.358,1.864)],T期[P<0.001,HR=2.135,95%CI(1.361,3.350)],N分期[P<0.001,HR=2.581,95%CI(1.832,3.638)和riskScore(P<0.001,HR=1.321,95%CI(1.254,1.392)]顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖5A;通過多因素Cox回歸分析只有riskScore(P<0.001,HR=1.280,95%CI(1.212,1.353)]顯示為獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測因子,見圖5B。

6.高、低風(fēng)險(xiǎn)組臨床特征差異分析

從熱圖和箱式圖可以看出,T分期、N分期、M分期、臨床分期與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分相關(guān)。圖6A和圖7顯示TNM分期、臨床分期、化療藥物(吉西他濱、紫杉醇、順鉑)在高、低風(fēng)險(xiǎn)組之間有差異,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖7顯示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與一些常用化療藥物IC50之間存在相關(guān),提示風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可能作為肺腺癌患者化療藥物敏感性的潛在預(yù)測因子。

討 論

利用相關(guān)性分析和差異分析獲取53個(gè)DEferlncRNAs,循環(huán)配對(duì)構(gòu)建0或1矩陣獲得DEferlncRNA pairs;結(jié)合臨床信息,利用LASSO回歸和多因素Cox回歸分析篩選出17個(gè)與生存相關(guān)DEferlncRNA pairs,并構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型。本研究采用的是配對(duì)算法來提取DEferlncRNA pairs,并選擇最優(yōu)的DEferlncRNA pairs構(gòu)建模型,該模型不需要做批次矯正,只需要考慮樣本內(nèi)部lncRNA的比較;不需要考慮樣本之間的比較,便于臨床應(yīng)用。

該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型表明8個(gè)DEferlncRNA pairs(TYMSOS|AC145343.1、AC010789.1|AC111149.2、LINC00511|AC145343.1等)為肺腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素,9個(gè)DEferlncRNA pairs(LUCAT1|AL365181.3、LINC02362|LINC02544、PARAL1|LINC01843等)為肺腺癌預(yù)后的保護(hù)因素。鐵死亡是一種依賴鐵的細(xì)胞死亡方式,已被證明與腫瘤發(fā)展和抗腫瘤治療有關(guān)[12-14];LncRNA參與惡性腫瘤進(jìn)展和腫瘤耐藥,并成為新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[15-17]。然而,鐵死亡相關(guān)LncRNA與肺腺癌預(yù)后關(guān)系研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)LINC00511為肺腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素,與本研究結(jié)果一致;LINC00511通過PTEN調(diào)控肺癌細(xì)胞增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;通過miR-183-5p/ZEB2軸調(diào)控TGF-β1引起的肺癌細(xì)胞的遷移以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[18]。研究發(fā)現(xiàn)LUCAT1正向影響B(tài)eclin1的表達(dá)而激活自噬維持肺腺癌A549干細(xì)胞干性[19],與本研究發(fā)現(xiàn)LUCAT1為肺腺癌預(yù)后的保護(hù)因素結(jié)果一致。在前列腺癌中,DRAIC與IKK亞基結(jié)合,阻斷基間結(jié)合并抑制NF-κB的激活,從而抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲和增殖[20];DRAIC能促進(jìn)降解通過阻斷UCHL5介導(dǎo)的NFRKB去泛素化,抑制胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[21];以上結(jié)果表明DRAIC是癌癥患者的預(yù)后因素,與本研究結(jié)果相符。AC010789.1高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)[22]。然而,本研究發(fā)現(xiàn)AL365181.2、AL391427.1、PARAL1、AC145343.1等也是肺腺癌預(yù)后因素,但是具體影響機(jī)制還不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)常用化療藥物在高、低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組之間藥物敏感性是有差異的,并提示低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)藥物敏感。盡管還沒有證據(jù)表明DEferlncRNA與肺腺癌耐藥之間有直接聯(lián)系,但部分DEferlncRNA在其他癌癥耐藥過程中發(fā)揮重要的作用。LINC0973基因下調(diào)降低p21的水平,激活癌細(xì)胞的增殖,抑制藥物作用下細(xì)胞的凋亡;LINC01977表達(dá)水平上調(diào)可促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展,增加對(duì)阿霉素的耐藥作用;ECSB通過調(diào)控LINC01843表達(dá)來逆轉(zhuǎn)大腸癌5-FU的耐藥作用[23-25]。以上研究提示,DEferlncRNA可能為研究肺腺癌耐藥機(jī)制提供一定的參考。

繼往研究主要基于LncRNA表達(dá)量構(gòu)建肺腺癌預(yù)后模型,數(shù)據(jù)以芯片數(shù)據(jù)或PCR數(shù)據(jù)為主,需要進(jìn)行批次矯正后構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)模型;而本研究基于LncRNA對(duì)構(gòu)建肺腺癌預(yù)后模型,只需考慮數(shù)據(jù)內(nèi)部LncRNA表達(dá)量的相對(duì)高低信息,不需要數(shù)據(jù)的矯正,方便臨床使用,結(jié)果更具實(shí)用性。本研究風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型樣本量較少,還缺少外部數(shù)據(jù)驗(yàn)證。因此,在以后的工作中,將增加樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證模型。綜上,利用ferlncRNA構(gòu)建,不需要確定表達(dá)量的LncRNA基因特征可評(píng)估LUAD患者預(yù)后,同時(shí)也為肺腺癌患者臨床化療提供參考。