摘要：為確定草烏（Aconitum kusnezoffii Reichb.）苗期生長發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄組特征，本研究利用Illumina測序?qū)Σ轂鯊姆N子萌發(fā)到幼苗建成涉及到的四個(gè)時(shí)期（T1，T2，T3，T4）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，挖掘草烏幼苗形成期葉綠體發(fā)育關(guān)鍵基因。結(jié)果顯示，4個(gè)時(shí)期的6個(gè)差異分類檢測到的差異基因數(shù)量依次為：16 379，28 155，16 100，34 368，38 250和44 568個(gè)。GO富集分析顯示T3vsT4差異表達(dá)基因主要富集到對幾丁質(zhì)的反應(yīng)，光合系統(tǒng)Ⅰ等。KEGG富集分析顯示差異表達(dá)基因顯著富集的通路主要是光合生物中的碳固定，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。草烏幼苗形成期葉綠體發(fā)育過程中，19個(gè)差異表達(dá)基因注釋光信號(hào)調(diào)控葉綠體發(fā)育通路上，如GLK1/2，PIFs，HY5基因等。44個(gè)差異表達(dá)基因注釋植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上，如AUX/IAA，ARF，DELLA基因等。本研究挖掘到一部分草烏幼苗形成期葉綠體發(fā)育相關(guān)基因，為進(jìn)一步研究草烏生長發(fā)育相關(guān)分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：草烏；轉(zhuǎn)錄組；幼苗形成；葉綠體發(fā)育

中圖分類號(hào)：Q943.2""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）06-1779-10

Transcriptome Analysis of Chloroplast Development during the Formation

Stage of Aconitum kusnezoffii Seedlings

JIA Chun-he1， LYU Li-juan2， LI Xiao-jie1， ZHANG Xiao-ming1， MU Ying-tong1， FAN Dong-chang1，

LYU Yan-min3， SHI Jia-yi1， WANG Jun-jie1*

（1.Key Laboratory of Grassland Resources， College of Grassland and Resources Environment， Inner Mongolia Agricultural

University， Ministry of Education， Hohhot， Inner Mongolia 010019; 2.Hohhot Forestry and Grassland Bureau， Hohhot， Inner

Mongolia 010019; 3.Horqin Right Wing Middle Banner forestry and grassland Bureau， Horqin Right Wing Middle， Inner Mongolia 029400）

Abstract：In order to obtain the transcriptome characteristics of Aconitum kusnezoffii Reichb. during seedling growth and development in this study，Illumina sequencing was used to transcriptionally analyse key genes for chloroplast during the four periods （T1，T2，T3，T4） involved in the development of Aconitum kusnezoffii from seed germination to seedling establishment. The results showed that the number of differentially expressed genes detected in the six differential classifications of the four periods was 16 379，28 155，16 100，34 368，38 250 and 44 568，respectively. GO enrichment analysis showed that the differentially expressed genes in T3vsT4 were enriched in responses to chitin，photosynthetic system I，etc. KEGG enrichment analysis showed that the pathways significantly enriched in differentially expressed genes were mainly carbon fixation in photosynthetic organisms，plant hormone signal transduction，etc. For the development of chloroplasts during the formative stage of Aconitum kusnezoffii seedlings，nineteen differentially expressed genes，such as GLK1/2，PIFs， HY5 genes，are annotated to the light signaling pathway regulating chloroplast development. Forty-four differentially expressed genes annotated were in plant hormone signaling pathways，such as AUX/IAA，ARF，DELLA genes，etc. This study identified some genes related to chloroplast development during the formation stage of Aconitum kusnezoffii seedlings，providing a theoretical basis for further research on the molecular mechanisms related to the growth and development of Aconitum kusnezoffii.

Key words：Aconitum kusnezoffii Reichb;Transcriptome;Seedling formation;Chloroplast development

草烏（Aconitum kusnezoffii Reichb.）為毛茛科的多年生草本，別名北烏頭，廣泛分布于我國東北、華北地區(qū)。傳統(tǒng)蒙醫(yī)藥中，草烏塊根、葉、花及芽等部位分開入藥［1］。附子是北烏頭的干燥塊根，可入藥，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛之功效［2］。草烏的干燥葉、幼芽、花等用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛及麻醉止痛等［3］。

光是影響植物生長和發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)境因子之一，光作為能量來源為植物生長發(fā)育提供營養(yǎng)，還作為信號(hào)參與植物生命周期的調(diào)控，在植物幼苗形成過程中經(jīng)歷了光形態(tài)建成及葉綠體發(fā)育。光參與調(diào)控植物細(xì)胞的生長、分化，使植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生變化，匯聚成植物組織和器官，這個(gè)過程稱為植物的光形態(tài)建成［4］。植物的光形態(tài)構(gòu)建過程可人為按照最有效的光譜范圍分成兩種：紅光反應(yīng)和藍(lán)光反應(yīng)。植物葉子的增大主要靠紅光反應(yīng)，而氣孔打開、葉綠體分化與運(yùn)動(dòng)是藍(lán)光反應(yīng)［5］。在感知紅光時(shí)，光敏色素通過觸發(fā)磷酸化和蛋白酶體降解來抑制（Phytochrome-interacting factors，PIFs）的功能，PIFs是一類可以與光敏色素相互作用的螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix）家族轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而減輕PIFs對葉綠素生物合成和光合系統(tǒng)相關(guān)基因的抑制［6］。此外，光敏色素還抑制光信號(hào)傳導(dǎo)的另一種抑制因子，即E3泛素連接酶復(fù)合物COP1-SPA1，從而驅(qū)動(dòng)PhANGs的轉(zhuǎn)錄［7-8］。葉綠體正常發(fā)育的重要條件是光，一系列能夠感受特定波長的蛋白可感知光，蛋白通過構(gòu)象變化會(huì)與下游信號(hào)分子互相作用。光敏色素（Phytochrome A/B，phyA/B）、隱花色素（Cryptochrome，cry）被認(rèn)為是調(diào)節(jié)光形態(tài)建成的兩類光受體［9］。當(dāng)幼苗從土壤覆蓋中出現(xiàn)時(shí)，光引發(fā)了從暗生長的光形態(tài)建成到光生長的光形態(tài)建成的形態(tài)和生理巨變［10-11］，包括下胚軸伸長抑制、頂端彎鉤展開、子葉張開和膨大以及黃化體到葉綠體的轉(zhuǎn)變［12-14］。在光下PhyB能夠轉(zhuǎn)到核內(nèi)并與PIF3結(jié)合，以此自身磷酸化開啟，調(diào)控光形態(tài)建成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［9，15］，PIF3負(fù)調(diào)節(jié)編碼葉綠素合成調(diào)節(jié)酶基因HEMA1、GUN5以及光合系統(tǒng)PSI中LHCA1、PsaE1基因的表達(dá)［16-17］。光形態(tài)建成受PIFs家族基因抑制，尤其是葉綠體的發(fā)育［18］。葉綠體的生物發(fā)生通過大量信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在細(xì)胞核和葉綠體之間進(jìn)行協(xié)調(diào)，以此來促進(jìn)功能葉綠體的組裝和生物合成［19］。

激素在調(diào)控葉綠體發(fā)育過程中同樣起著重要的作用。PIFs作為光信號(hào)調(diào)控葉綠體發(fā)育的重要調(diào)控因子，BZR1與PIF4的N端結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成異源二聚體，從而共同抑制GLK1、GLK2和幾個(gè)葉綠素生物合成基因的表達(dá)。HY5與去磷酸化狀態(tài)BZR1形成異源二聚體，減弱了BZR1的活性，進(jìn)而促進(jìn)了葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，使葉綠體的發(fā)育不再受到抑制。DELLA蛋白是GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制子，當(dāng)感受到GA信號(hào)時(shí)，DELLA蛋白經(jīng)26S蛋白酶體降解失活。當(dāng)DELLA蛋白不響應(yīng)GA信號(hào)時(shí)，DELLA蛋白結(jié)合PIF并通過泛素-蛋白酶體途徑誘導(dǎo)其降解，以此降低PIF活性，進(jìn)而削弱了PIF對葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄抑制［20］。

目前草烏的研究多集中在栽培技術(shù)和生物堿含量等方面，關(guān)于草烏葉綠體發(fā)育方面的研究未見報(bào)道。葉綠體不光是植物細(xì)胞的重要器官，還是維持植物生命活動(dòng)的關(guān)鍵因子，植物進(jìn)行光合作用的主要場所是葉綠體，而光合作用的進(jìn)行依賴葉綠體的正常發(fā)育，因此，葉綠體的正常發(fā)育對草烏生長發(fā)育具有重要意義。本文通過對草烏種子萌發(fā)及幼苗建成涉及到的四個(gè)時(shí)期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄測序，挖掘草烏幼苗形成期葉綠體發(fā)育相關(guān)基因，為進(jìn)一步研究草烏生長發(fā)育調(diào)控過程以及烏頭屬植物進(jìn)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

草烏（Aconitum kusnezoffii Reichb.）種子于2020年在內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市巴林右旗賽罕烏拉自然保護(hù)區(qū)采集。選取顆粒飽滿、大小一致的種子用清水浸泡48 h，種子與砂土按1∶3拌勻，置于容器中封好，砂土濕度（15%～20%），置于-5℃/4℃變溫環(huán)境下每 7 d交替一次，相對濕度 50%低溫培養(yǎng)箱中層積。第0 d（CK）、14 d（種子吸脹）、42 d（種子露白）取樣，待種子露白后，放置于15℃光照培養(yǎng)箱中催芽處理，14 d后取樣（種子子葉露出，并且變?yōu)榫G色），各時(shí)期稱取0.5 g新鮮樣品，3次重復(fù)，分別用T1，T2，T3和T4表示。

1.2 RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測序

采用Trizol法提取樣品總RNA［21］，得到草烏總RNA后用Agilent 2100檢測RNA的質(zhì)量，質(zhì)量合格后一部分-70℃保存用于qRT-PCR，一部分送往上海歐易生物科技有限公司進(jìn)行上機(jī)測序。原始數(shù)據(jù)（raw data）用Fastqc質(zhì)量評(píng)估后用trim-galore對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行剪切得到clean data。使用Trinity［22］軟件采用paired-end方法對clean data進(jìn)行無參轉(zhuǎn)錄組從頭組裝（de novo）得到轉(zhuǎn)錄本，選擇最長的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene，用CD-HIT［23］軟件去冗余得到最終的Unigene，作為后續(xù)分析的參考序列。

1.3 草烏的unigenes的功能注釋和葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的鑒定

為獲得草烏的unigene功能信息，將測序得到的Unigene比對Nr、Nt、KOG/COG、Swiss-Prot、KO和GO數(shù)據(jù)庫［24］，使用HMMER［25］軟件對Pfam數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Unigene的功能分析。利用FPKM法計(jì)算基因的表達(dá)水平，利用DESeq2軟件分析T3vsT4時(shí)期差異表達(dá)，篩選條件為qlt;0.05 且差異倍數(shù)（foldChange）gt; 2為差異表達(dá)基因。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR驗(yàn)證

在本研究所有差異表達(dá)基因中隨機(jī)選取9個(gè)與草烏葉綠體發(fā)育相關(guān)基因進(jìn)行驗(yàn)證，使用Primer3plus網(wǎng)站設(shè)計(jì)PCR引物（表1），以草烏中actin為內(nèi)參基因，采用Trizol法提取樣品總RNA，使用PrimeScript TM 1 st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR分析。qRT-PCR反應(yīng)體系見表2，試驗(yàn)技術(shù)設(shè)置3次重復(fù)，基因表達(dá)量采用2-ΔΔCT法計(jì)算［26］。

2 結(jié)果與分析

2.1 草烏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝與功能注釋

通過用Trinity軟件對所有reads進(jìn)行組裝，我們在草烏中發(fā)現(xiàn)了79 251個(gè)unigene，平均長度為881.74 bp，組裝的unigene的N50長度為1 221 bp，平均GC含量為46.72%。為了獲得本研究中草烏葉綠體的基因功能信息，我們采用diamon軟件將Unigene與6大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，選擇具有最高序列相似性的蛋白，獲得功能注釋信息（表3）。

2.2 葉綠體發(fā)育過程差異表達(dá)基因及其功能富集分析

2.2.1 差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)分析 以qlt;0.05 且差異倍數(shù)（fold Change）gt; 2作為篩選條件，將4個(gè)不同時(shí)期草烏兩兩比對，即T1vsT2、T1vsT3、T1vsT4、T2vsT3、T2vsT4、T3vsT4篩選差異表達(dá)基因（DEGs），結(jié)果表明，在T1vsT2中獲得16 100個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)基因數(shù)13 119個(gè)，下調(diào)基因數(shù)2 981個(gè)。在T1vsT3中獲得 38 250個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)基因數(shù)20 985個(gè)，下調(diào)基因數(shù)17 265個(gè)。在T1vsT4中獲得44 568個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)基因數(shù)23 594個(gè)，下調(diào)基因數(shù)20 974個(gè)。在T2vsT3中獲得28 155個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)基因數(shù)11 728個(gè)，下調(diào)基因數(shù)16 427個(gè)。在T2vsT4中獲得34 268個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)基因數(shù)13 491個(gè)，下調(diào)基因數(shù)20 877個(gè)。在T3vsT4中獲得16 379個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)基因數(shù)6 433個(gè)，下調(diào)基因數(shù)9 946個(gè)（圖1）。

2.2.2 差異表達(dá)基因的GO富集分析 為了研究草烏幼苗形成期葉綠體發(fā)育過程中差異表達(dá)基因的主要生物學(xué)功能，對T3vsT4差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析。圖2展示了T3vsT4對比組合在生物過程、細(xì)胞組分、分子功能中顯著性前10的GO條目，從圖中可以看出差異基因富集在生物過程和細(xì)胞組分較多。T3vsT4差異基因在生物過程中多富集在對幾丁質(zhì)的反應(yīng)、防御反應(yīng)過程等；在細(xì)胞組分中差異基因主要富集在光合系統(tǒng)Ⅰ、細(xì)胞壁等；在分子功能多富集在脂肪酶活性、鄰苯二酚氧化酶活性等。對所有差異基因進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果顯示草烏在光形態(tài)建成和葉綠體發(fā)育過程中在生物過程富集到參與光合作用（GO：0015979）、防御反應(yīng)（GO：0006952）。在分子功能富集到DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（GO：0003700）。在細(xì)胞組分富集到葉綠體類囊體膜（GO：0009535）、葉綠體（GO：0009507）、類囊體（GO：0009579）、葉綠體基質(zhì)（GO：0009570）、葉綠體類囊體（GO：0009534）、植物型細(xì)胞壁（GO：0009505）、質(zhì)外體（GO：004804）。以上結(jié)果表明這些差異表達(dá)基因主要參與光合作用和葉綠體發(fā)育相關(guān)代謝途徑，參與調(diào)控葉綠體的發(fā)育，影響光合作用（表4）。

2.2.3 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析 通過對T3，T4實(shí)驗(yàn)組間比較的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG代謝通路顯著性分析，選擇前20條（篩選對應(yīng)差異基因數(shù)目大于 2的Pathway條目，按照每個(gè)條目對應(yīng)的-lgPvalue由大到小排序）通路做氣泡圖進(jìn)行分析（圖3），T3vsT4時(shí)期差異表達(dá)基因顯著富集的通路主要是核糖體、植物-病原體相互作用、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合生物中的碳固定、苯丙類生物合成等。核糖體、植物-病原體相互作用、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合生物中的碳固定等代謝通路可能在草烏幼苗形成期葉綠體發(fā)育過程中起到一定作用。

2.3 光信號(hào)調(diào)控草烏葉綠體發(fā)育過程中相關(guān)基因表達(dá)模式分析

在光對葉綠體發(fā)育的影響途徑中，本研究鑒定出了1個(gè)編碼GOLDEN2-LIKE（GLK）蛋白的DEGs，是促進(jìn)葉綠體發(fā)育和葉綠素合成的核心轉(zhuǎn)錄因子，常以GLK1/GLK2基因?qū)Φ男问酱嬖?，該基因在植物中的功能是保守的，葉綠體發(fā)育受它正調(diào)控，GLKs調(diào)節(jié)一些-Cp和PhANGs（葉綠體和光合作用相關(guān)的核基因）的表達(dá)［20］。在草烏葉綠體發(fā)育過程中，（GLK）在幼苗形成階段上調(diào)表達(dá)，說明其調(diào)控葉綠體生物發(fā)生和葉綠體分裂過程（圖4）。

在草烏葉綠體發(fā)育過程中的光調(diào)控模型中共鑒定出了18個(gè)顯著差異表達(dá)的基因；在T4時(shí)期，2個(gè)DEGs（Phy）上調(diào)表達(dá)，1個(gè)DEGs（Phy）下調(diào)表達(dá)，2個(gè)DEGs（Cry）下調(diào)表達(dá)，2個(gè)DEGs（SPA1）下調(diào)表達(dá)，2個(gè)DEGs（COP1）上調(diào)表達(dá)，1個(gè)DEGs（COP1）下調(diào)表達(dá)，4個(gè)DEGs（PIFs）下調(diào)表達(dá)，2個(gè)DEGs（HY5）上調(diào)表達(dá)；在T3時(shí)期，1個(gè)DEGs（Phy）上調(diào)表達(dá)；在T2時(shí)期，1個(gè)DEGs（SPA1）上調(diào)表達(dá)（圖5）。

2.4 激素調(diào)控草烏葉綠體發(fā)育過程中相關(guān)基因表達(dá)模式分析

BR對光形態(tài)發(fā)生和葉綠體發(fā)育的調(diào)控主要由BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心轉(zhuǎn)錄因子（BR-activated transcription factor 1，BZR1）及其同源物BES1介導(dǎo)的。BZR1是BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中必不可少的轉(zhuǎn)錄因子，許多靶基因的表達(dá)都受它直接調(diào)控［27］，在BR調(diào)控葉綠體發(fā)育途徑中共鑒定出了5個(gè)DGEs，2個(gè)DEGs（TCH4）在T4時(shí)期上調(diào)表達(dá)，1個(gè)DEGs（TCH4）在T4時(shí)期下調(diào)表達(dá)，2個(gè)DEGs（CYCD3）在T3時(shí)期上調(diào)表達(dá)（圖6）。

在細(xì)胞分裂素調(diào)控葉綠體發(fā)育過程中，1個(gè)細(xì)胞分裂素受體的His激酶（Arabidopsis His Kinase2）（AHK2）、AHK3和CRE1/AHK4在T4時(shí)期上調(diào)表達(dá)。與細(xì)胞分裂素結(jié)合后，這些受體通過組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移蛋白（AHPs）將信號(hào)傳遞至B型應(yīng)答調(diào)節(jié)劑B-ARR，ARR（Arabidopsis Response Regulator）激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄［28］，在T4時(shí)期，1個(gè)DEGs（B-ARR）下調(diào)表達(dá)，1個(gè)DEGs（GLK1/2）上調(diào)表達(dá)，以調(diào)節(jié)葉綠體的發(fā)育（圖6）。

暗形態(tài)建成到光形態(tài)建成期間，DELLA蛋白介導(dǎo)赤霉素信號(hào)與光信號(hào)之間的互作。本研究中，在T3時(shí)期，4個(gè)DEGs（DELLA）上調(diào)表達(dá)；在T4時(shí)期，4個(gè)DEGs（PIF4）上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)了葉綠體的發(fā)育和下胚軸伸長。本研究中，2個(gè)POR酶的DEGs在T4時(shí)期上調(diào)表達(dá)（圖6）。

在細(xì)胞水平上，ARF （Auxin Response Factor） 和AUX/IAA （Auxin/indole-3-Acetic Acid Inducible）蛋白因子調(diào)控生長素，如圖6（D）中的a過程所示，本研究中鑒定到1個(gè)DEGs（Aux/IAA）在T3時(shí)期上調(diào)表達(dá)，7個(gè)DEGs（ARF）在T4時(shí)期上調(diào)表達(dá)，2個(gè)DEGs（ARF）在T4時(shí)期下調(diào)表達(dá)，1個(gè)DEGs （GLK1/2）在T4時(shí)期上調(diào)表達(dá)。如圖6（D）中的b過程所示，本研究中，在T4時(shí)期鑒定到9個(gè)DEGs（Aux）上調(diào)表達(dá)，6個(gè)DEGs（ARF）下調(diào)表達(dá)，1個(gè)DEGs（GLK1/2）上調(diào)表達(dá)，因此，GNC和GNL的表達(dá)受生長素和赤霉素在轉(zhuǎn)錄水平上的交叉調(diào)控，進(jìn)而影響葉綠體發(fā)育和葉綠素合成［29］ （圖6）。

2.5 關(guān)鍵基因相對表達(dá)量分析

草烏幼苗形成期葉綠體發(fā)育過程中關(guān)鍵基因表達(dá)情況如圖7所示，結(jié)果表明，除了PHY、ARF外，DELLA、POR、HY5、AUX/IAA、COPA、CYCD3和CRY的轉(zhuǎn)錄組分析與qRT-PCR分析結(jié)果基本一致。PHY在轉(zhuǎn)錄組分析T4時(shí)期表達(dá)量下調(diào)，qRT-PCR分析結(jié)果中表達(dá)量也下調(diào)，但表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)量有差異。ARF在轉(zhuǎn)錄組分析T3時(shí)期表達(dá)量上調(diào)，qRT-PCR分析結(jié)果中表達(dá)量也上調(diào)，但表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)量間差異較大。

3 討論

葉綠體的發(fā)育在植物萌發(fā)到成苗這一階段至關(guān)重要，影響著植物的整個(gè)生命周期。黑暗中，光敏色素相互作用因子（PIF）抑制與光合作用相關(guān)的核編碼（PhANG）轉(zhuǎn)錄，包括編碼葉綠素生物合成酶的基因和（GLK1）轉(zhuǎn)錄因子等。同時(shí)，E3泛素連接酶復(fù)合物也會(huì)降解大量的轉(zhuǎn)錄因子和活化的光敏色素，特別是（HY5）轉(zhuǎn)錄因子［30］。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，植物的子葉和真葉這兩種葉片里葉綠體的發(fā)育是不同的，二者有自己的發(fā)育通路，但任何一個(gè)部位受到影響，都會(huì)影響植物的生長［31］。了解葉綠體發(fā)育的調(diào)控機(jī)制意義重大。前人研究發(fā)現(xiàn)，在黑暗條件下，GNC和GNL（GATA家族轉(zhuǎn)錄因子）的過表達(dá)促進(jìn)了原質(zhì)體向黃化質(zhì)體的分化；在光照下，促進(jìn)葉綠體發(fā)育［32］。本研究中光信號(hào)調(diào)控葉綠體發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)1個(gè)DEGs（GLK1/2）在T4時(shí)期顯著下調(diào)，2個(gè)DEGs（CRY）在T4時(shí)期顯著下調(diào)，4個(gè)DEGs（PIFs）和2個(gè)DEGs（HY5）在T4時(shí)期顯著上調(diào)，激活下游轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)葉綠體發(fā)育。

葉綠體的生物發(fā)生由核和葉綠體編碼的基因產(chǎn)物共同決定。除了光以外，一些激素如生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素等都參與調(diào)節(jié)葉綠體發(fā)育。植物激素可以通過控制細(xì)胞分裂和擴(kuò)張之間的平衡，或通過影響光合作用相關(guān)基因的表達(dá)、葉綠體的生物合成和分裂來影響細(xì)胞中葉綠體的大小，從而影響其發(fā)育。在光形態(tài)建成過程中BR信號(hào)被植物接收后，BRZ1受體會(huì)結(jié)合GATA2的啟動(dòng)子，因此GATA2的表達(dá)被抑制；光形態(tài)建成相關(guān)因子COP1的水解被光抑制，GATA2被激活跟光響應(yīng)基因的啟動(dòng)子元件結(jié)合，光和BR響應(yīng)基因的表達(dá)被調(diào)控，因此植物幼苗生長被影響，在光形態(tài)建成過程中，GATA2起正調(diào)節(jié)因子的作用［33］。HY5是連接光信號(hào)與激素信號(hào)的重要節(jié)點(diǎn)，通過整合光信號(hào)以此來影響激素含量來促進(jìn)光形態(tài)建成。例如，HY5可以與BZR1相互作用拮抗BZR1來調(diào)控子葉開放相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性［34］，本研究在BR調(diào)控葉綠體發(fā)育途徑中發(fā)現(xiàn)2個(gè)DEGs（TCH4）在T4時(shí)期上調(diào)表達(dá)，1個(gè)DEGs（TCH4）在T4時(shí)期下調(diào)表達(dá)，2個(gè)DEGs（CYCD3）在T3時(shí)期上調(diào)表達(dá)，在草烏葉綠體發(fā)育過程中起調(diào)控作用。

番茄（Solanum lycopersicum L.）中AtBZR1-1D與SlGLK2協(xié)同上調(diào)促進(jìn)葉綠素合成與葉綠體發(fā)育［35］，與本研究的結(jié)果一致。CRF2作為細(xì)胞分裂素反應(yīng)因子家族的成員，屬于AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子。CRF2過表達(dá)導(dǎo)致了PDV2蛋白水平的升高和葉綠體分裂的增加。作為參與葉綠體發(fā)育和分裂的重要調(diào)控因子CGA1和CRF2被發(fā)現(xiàn)在調(diào)控細(xì)胞分裂素信號(hào)上起著極其重要的作用［15］。本研究在CK調(diào)控葉綠體發(fā)育途徑中發(fā)現(xiàn)3個(gè)DGEs影響其發(fā)育，1個(gè)DEGs（AHK2/3/4）和1個(gè)DEGs（GLK1/2）在T4時(shí)期顯著上調(diào)，1個(gè)DEGs（B-ARR）在T4時(shí)期顯著下調(diào)。GA能抑制CGA1和GNC這兩個(gè)葉綠體發(fā)育促進(jìn)因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制CGA1和GUC下游相關(guān)葉綠體發(fā)育基因的表達(dá)［20］。光可以誘導(dǎo)POR基因表達(dá)，POR酶可以促進(jìn)葉綠素合成［30］，在GA調(diào)控葉綠體發(fā)育途徑中發(fā)現(xiàn)10個(gè)DGEs調(diào)控其發(fā)育，4個(gè)DEGs（PIF4）、2個(gè)DEGs（POR）在T4時(shí)期顯著上調(diào)，其余基因既有上調(diào)也有下調(diào)。原葉綠素酸酯氧化還原酶（POR）是編碼光合體中的一個(gè)關(guān)鍵酶，參與葉綠素a的合成過程［36］，本研究也證明POR對草烏葉綠體發(fā)育起到了一定的調(diào)控作用。Auxin調(diào)控葉綠體發(fā)育途徑中發(fā)現(xiàn)26個(gè)DGEs調(diào)控其發(fā)育，10個(gè)DEGs（AUX/IAA）和2個(gè)DEGs（GLK1/2）在T4時(shí)期顯著上調(diào)，9個(gè)DEGs（ARF）在T4時(shí)期顯著下調(diào)，5個(gè)DEGs（ARF）在T4時(shí)期顯著上調(diào)。綜上所述，光與其他刺激如激素有交叉作用，共同調(diào)節(jié)植物發(fā)育，我們應(yīng)把焦點(diǎn)聚集在將復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)與功能基因組的信息整合起來，以此來正確認(rèn)識(shí)植株水平上的光調(diào)控發(fā)育機(jī)理，有助于明晰環(huán)境因素如何調(diào)控植物的生長發(fā)育［37］。

4 結(jié)論

對草烏4個(gè)生長發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，共篩選出79 251個(gè)基因，T3vsT4時(shí)期差異表達(dá)基因在GO富集分析中主要富集到參與對幾丁質(zhì)的反應(yīng)、光合系統(tǒng)Ⅰ、脂肪酶活性等過程中。在KEGG富集分析中主要富集到植物-病原體相互作用、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合生物中的碳固定。同時(shí)，草烏的4個(gè)不同時(shí)期在光和激素調(diào)節(jié)葉綠體發(fā)育的不同階段其表達(dá)量不同，19個(gè)差異表達(dá)基因注釋光信號(hào)調(diào)控葉綠體發(fā)育通路上。44個(gè)差異表達(dá)基因注釋植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上。本研究挖掘到一部分草烏幼苗形成期葉綠體發(fā)育相關(guān)基因，為進(jìn)一步研究草烏生長發(fā)育相關(guān)分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

［1］ 張躍華. 草烏頭種子休眠及繁殖特性研究［D］. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016：1

［2］ 彭劭.草烏中生物堿類化學(xué)成分的研究［D］. 長春：吉林大學(xué)，2014：1

［3］ 山丹. 不同種源草烏生物學(xué)特性及入藥部位生物堿含量的研究［D］. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020：1

［4］ 王小菁. 植物生理學(xué)［M］. 第8版.北京：高等教育出版社，2019：236285

［5］ 鄭素玲. 談植物的光形態(tài)建成［J］. 唐山師專學(xué)報(bào)，1999（5）：75-76

［6］ MOON J，ZHU L，SHEN H，et al. PIF1 directly and indirectly regulates chlorophyll biosynthesis to optimize the greening process in Arabidopsis［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，2008，105（27）：9433-9438

［7］ LU X D，ZHOU C M，XU P B，et al. Red-light-dependent interaction of phyB with SPA1 promotes COP1-SPA1 dissociation and photomorphogenic development in Arabidopsis［J］. Molecular Plant，2015，8（3）：467-78

［8］ SHEERIN D J，MENON C，ZUR OVEN-KROCKHAUS S，et al. Light-activated phytochrome A and B interact with members of the SPA family to promote photomorphogenesis in Arabidopsis by reorganizing the COP1/SPA complex［J］. Plant Cell，2015，27（1）：189-201

［9］ BAUER D，VICZIN A，KIRCHER S，et al. Constitutive photomorphogenesis 1 and multiple photoreceptors control degradation of phytochrome interacting factor 3，a transcription factor required for light signaling in Arabidopsis［J］. Plant Cell，2004，16：1433-1445

［10］ZHONG S，ZHAO M，SHI T，et al. EIN3/EIL1 cooperate with PIF1 to prevent photo-oxidation and to promote greening of Arabidopsis seedlings［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，USA，2009，106（50）：21431-21436

［11］LEIVAR P，MONTE E，OKA Y，et al. Multiple phytochrome-interacting bHLH transcription factors repress premature seedling photomorphogenesis in darkness［J］. Current Biology， 2008，18（23）：1815-1823

［12］SHI H，SHEN X，LIU R，et al. The Red Light Receptor Phytochrome B Directly Enhances Substrate-E3 Ligase Interactions to Attenuate Ethylene Responses［J］. Developmental Cell， 2016，39（5）：597-610

［13］LIU X，LIU R，LI Y，et al. EIN3 and PIF3 Form an Interdependent Module That Represses Chloroplast Development in Buried Seedlings［J］. Plant Cell， 2017，29（12）：3051-3067

［14］JIAO Y，LAU OS，DENG XW. Light-regulated transcriptional networks in higher plants［J］. Nature Reviews Geneticst，2007（8）：217-230

［15］HUQ E，AL-SADY B，HUDSON M，et al. Phytochrome-interacting factor 1 is a critical bHLH regulator of chlorophyll biosynthesis［J］. Science，2004，305：1937-1941

［16］GOSLINGS D，MESKAUSKIENE R，KIM C，et al. Concurrent interactions of heme and FLU with Glu tRNA reductase （HEMA1），the target of metabolic feedback inhibition of tetrapyrrole biosynthesis，in dark and light-grown Arabidopsis plants［J］. Plant Journal，2004，40：957-96

［17］SHIRR J，KIM K，KANG H，et al. Phytochromes promote seedling light responses by inhibiting four negatively-acting phytochrome-interacting factors［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences，USA，2009，106（18）：7660-7665

［18］李保珠，趙孝亮，彭雷. 植物葉綠體發(fā)育及調(diào)控研究進(jìn)展［J］. 植物學(xué)報(bào)，2014，49（3）：337-345

［19］唐鈺瑩，劉陽軒，潘婷，等. 葉綠體蛋白CV調(diào)節(jié)質(zhì)體逆向信號(hào)的研究［J］. 植物生理學(xué)報(bào)，2020，56（7）：1553-1560

［20］陳煒. 調(diào)控水稻葉綠體發(fā)育基因YGL3的圖位克隆及功能研究［D］. 南昌：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2022：5-6

［21］YOUMING Y，CHUNIAN X，BAOMIN W，et al. Effects of plant growth regulators on secondary wall thickening of cotton fibres［J］. Plant Growth Regulation，2004，35（3）：233-237

［22］ROBERTS E H. Seed dormancy and oxidation processes［J］. Symposia of the Society for Experimental Biology，1969，23：161-192

［23］GRABHERR M G，HAAS B J，YASSOUR M，et al. Trinity：reconstructing a full-length transcriptome without a genome from RNA-Seq data［J］. Nature Biotechnology，2011，29（7）：644

［24］洪森榮，劉佳凝，袁昕，等. 蘇丹草和高丹草轉(zhuǎn)錄組測序及其差異基因表達(dá)分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2024，32（3）：714-725

［25］BENIAMIN B， XIE C， HUSON D H. Fast and sensitive protein alignment using DIAMOND［J］. Nature Methods，2015，12：59-60

［26］金忠民，李春月，劉本松，等. 菌株JB12影響鉛鎘脅迫下菊苣黃酮合成的轉(zhuǎn)錄組分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2023，31（6）：1648-1655

［27］王晉，王新宇，沈淵博，等. 番茄果實(shí)葉綠體發(fā)育調(diào)控及其應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］. 園藝學(xué)報(bào)，2022，49（12）：2669-2682

［28］衛(wèi)云豐. 擬南芥PGA37轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控葉綠體發(fā)育的分子機(jī)制［D］. 晉中：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020：4

［29］SAKAMOTO W，MIYAGISHIMA S Y，JARVIS P. Chloroplast biogenesis：control of plastid development，protein import，division and inheritance ［J］. Arabidopsis Book，2008，6：e0110

［30］吳釩漳. miR319-TCP4調(diào)控葉綠體發(fā)育的分子機(jī)制研究［D］. 昆明：昆明理工大學(xué)，2022：4

［31］SAKAI A，TAKANO H，KUROIWA T. Organelle nuclei in higher plants：structure，composition，function，and evolution ［J］. International Review of Cytology，2004，238：59-118

［32］王娟，蘭海燕. GATA轉(zhuǎn)錄因子對植物發(fā)育和脅迫響應(yīng)調(diào)控的研究進(jìn)展［J］. 植物生理學(xué)報(bào)，2016，52（12）：1785-1794

［33］CHIANG Y H，ZUBO Y O，TAPKEN W，et al. Functional characterization of the GATA transcription factors GNC and CGA1 reveals their key role in chloroplast development，growth，and division in Arabidopsis［J］. Plant Physiol，2012，160（1）：332-348

［34］詹為民. 利用轉(zhuǎn)錄組和代謝組解析玉米光信號(hào)與雜種優(yōu)勢的互作機(jī)制［D］. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2023：5

［35］LIU L，JIA C，ZHANG M，et al. Ectopic expression of a BZR1-1D transcription factor in brassinosteroid signalling enhances carotenoid accumulation and fruit quality attributes in tomato［J］. Plant Biotechnology Journal，2014，12（1）：105-115

［36］LIANG M，GU D，LIE Z，et al. Regulation of chlorophyll biosynthesis by light-dependent acetylation of NADPH：protochlorophyll oxidoreductase A in Arabidopsis［J］. Plant Science，2023，330：111641

［37］王小菁. 我國光形態(tài)建成研究回顧［J］. 植物學(xué)通報(bào)，2003（4）：407-415

（責(zé)任編輯 彭露茜）