摘要：早期快速鑒定白三葉（Trifolium repens L.）F1雜交子代，獲取真雜種對(duì)白三葉優(yōu)良品系的培育和遺傳學(xué)研究具有重要的意義。本文針對(duì)兩個(gè)白三葉親本及55個(gè)雜交F1的6個(gè)表型性狀進(jìn)行分析，繪制聚類(lèi)熱圖，再選用3對(duì)特異性SSR引物鑒定雜交F1代的真實(shí)性。結(jié)果表明，在聚類(lèi)熱圖中57個(gè)株系可以根據(jù)親本的表型性狀劃分為父本型和母本型。篩選出的19對(duì)SSR引物共擴(kuò)增共得到清晰可辨條帶281條，多態(tài)性條帶137條，多態(tài)位點(diǎn)占比為48.41%，每個(gè)SSR位點(diǎn)的PIC在18.49%～43.58%之間，平均值為34.73%。其中3對(duì)特異性引物在55個(gè)雜交后代中共鑒定出53個(gè)真雜種，真雜種比率為96.36%，與UPGMA聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致。19對(duì)SSR分子標(biāo)記引物具有較高的多態(tài)性，可直接用于白三葉遺傳多樣性分析、雜種鑒定等相關(guān)研究，鑒定到的白三葉F1代真雜種為后續(xù)育種工作奠定重要基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：白三葉；雜種鑒定；SSR分子標(biāo)記；遺傳多樣性；表型分析

中圖分類(lèi)號(hào)：Q344+.4""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）06-1657-08

Phenotypic Identification and SSR Analysis of Trifolium repens

F1 Hybrid Progeny

WANG Yang， YAN San-bo， ZHANG Rui， HUANG Lin-kai， ZHANG Xin-quan， NIE Gang*

（College of Grassland Science and Technology， Sichuan Agricultural University， Chengdu， Sichuan Province 611130， China）

Abstract：Early and rapid identification of F1 hybrid progeny and acquisition of true hybrids are of great significance to the breeding and genetic research of Trifolium repens superior strains. Six phenotypic traits of 2 Trifolium repens parent materials and 55 F1 hybrids were mapped by clustering heat map，and 3 pairs of specific SSR primers were selected to identify the authenticity of F1 hybrids. The results showed that the 57 materials in the cluster heat map could be divided into 2 classes according to the phenotypic characters of their parents. A total of 281 distinct bands and 137 polymorphic bands were obtained by amplification with 19 pairs of selected primers. The polymorphic sites accounted for 48.41%. The PIC of each SSR site ranged from 18.49% to 43.58%，with an average value of 34.73%. A total of 53 true-hybrids were identified by three pairs of specific primers，and the true-hybrid ratio was 96.36%，which was basically consistent with the results of UPGMA cluster analysis. The 19 pairs of SSR molecular marker primers have high polymorphism，which can be directly used for genetic diversity analysis of Trifolium repens and hybrid identification and other related studies. The identified F1 generation true hybrids of Trifolium repens can lay a foundation for subsequent breeding work.

Key words：Trifolium repens;Identification of Hybrid;SSR molecular marker;Genetic diversity;Phenotypic analysis

白三葉（Trifolium repens L.）別名白車(chē)軸草、荷蘭翹搖，是豆科車(chē)軸草屬多年生草本植物，起源于地中海地區(qū)，現(xiàn)廣泛分布于全世界溫帶地區(qū)，因其具有蛋白質(zhì)含量高、再生能力強(qiáng)、適應(yīng)范圍廣等特點(diǎn)被作為優(yōu)質(zhì)牧草［1-2］。相關(guān)研究表明，白三葉廣泛栽培于長(zhǎng)江中下游平原和云南、貴州、四川等低山丘陵區(qū)［3］。然而，我國(guó)白三葉育種工作相對(duì)緩慢，到目前為止國(guó)審白三葉品種僅11個(gè)（全國(guó)草品種審定委員會(huì)審定8個(gè)，國(guó)家林業(yè)和草原局草品種審定委員會(huì)審定3個(gè)），且多數(shù)為引進(jìn)品種，遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足當(dāng)前畜牧業(yè)的需求。因此，培育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)白三葉新品種，對(duì)我國(guó)白三葉的發(fā)展和應(yīng)用尤為重要。

雜交育種作為國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最有效和最廣泛的育種方式，其不僅能獲得集合親本優(yōu)良性狀的新類(lèi)型，還能通過(guò)雜種的超親分離使雜交后代群體出現(xiàn)超越親本的新性狀，對(duì)創(chuàng)造新的種質(zhì)資源和培育出優(yōu)良新品種具有創(chuàng)造性的意義［4］。但在實(shí)際雜交過(guò)程中由于各種操作因素、自然因素等，雜交后代中易出現(xiàn)假雜種，很大程度上延緩了雜交育種的進(jìn)程。因此，鑒定F1代真實(shí)性是后續(xù)白三葉雜交育種的前提。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（Simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記可快速準(zhǔn)確的從DNA水平上揭示親代與子代間的遺傳差異［5］，被廣泛應(yīng)用于遺傳分析［6］、品種鑒定［7］、分子輔助育種［8］、DNA指紋圖譜構(gòu)建［9］等方面。汪陽(yáng)等［10］利用SSR分子標(biāo)記對(duì)多年生黑麥草（Lolium perenne）4個(gè)雜交組合的78個(gè)雜交后代進(jìn)行真實(shí)性鑒定，每個(gè)雜交組合分別選擇2對(duì)特異性SSR引物共鑒定出72個(gè)真雜種。謝文剛等［11］基于SSR分子標(biāo)記對(duì)140個(gè)鴨茅（Dactylis glomerata）雜交種進(jìn)行鑒定，利用3對(duì)特異引物快速準(zhǔn)確鑒定出真雜種111個(gè)。馬驄毓等［12］利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建了13個(gè)白三葉品種的指紋圖譜。馬賽男等［13］利用SSR分子標(biāo)記對(duì)10個(gè)白三葉品種及其近緣系的遺傳多樣性進(jìn)行了分子水平的分析，發(fā)現(xiàn)紫色白三葉與其它9個(gè)白三葉品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且具有清晰的帶譜，有效與其它品種區(qū)別鑒定，為白三葉優(yōu)質(zhì)種質(zhì)和品種的選育奠定理論基礎(chǔ)。但紫色白三葉其生長(zhǎng)性能較差，因此本研究利用紫色白三葉與1個(gè)性狀優(yōu)良的白三葉雜交，并對(duì)55個(gè)雜交后代進(jìn)行SSR鑒定，以期篩選出具有優(yōu)良性狀的雜種后代用于后續(xù)育種工作。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用具有較高縮合單寧含量，葉片顏色為紫色的‘Tr-292’為母本（♀）（‘紫色白三葉’由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)提供）和生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)量較高，葉片顏色為綠色的‘Tr-445’為父本（♂）（‘Luclair increase’由新西蘭皇家科學(xué)院院士John Caradus贈(zèng)予）作為親本（圖1），在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)崇州試驗(yàn)基地大田先單株扦插繁殖，再進(jìn)行套袋不去雄雜交。把所獲種子浸泡在98%的濃硫酸中5 min，再用蒸餾水沖洗3 min。然后將種子于同一時(shí)間播種在培養(yǎng)皿中，置于20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照/黑暗時(shí)間為12 h/12 h，光照強(qiáng)度為2 000 lx，相對(duì)濕度為60%。最終得到55份雜交后代，其中后代葉片顏色為綠色的有11份（以G為前綴命名），為紫色的有44份（以P為前綴命名）。當(dāng)白三葉幼苗形成穩(wěn)定根系時(shí)移栽到營(yíng)養(yǎng)土中，30 d后取健壯生長(zhǎng)單株葉片進(jìn)行SSR鑒定，然后在180 d時(shí)測(cè)其表型性狀。

1.2 表型測(cè)定指標(biāo)與方法

株高（Plant height，PH）：采用五點(diǎn)取樣法，從地面至植株最高部位的絕對(duì)高度為株高。

葉柄長(zhǎng)（Petiole length，PL）：采用五點(diǎn)取樣法，把葉柄拉伸垂直于地面再測(cè)量時(shí)的長(zhǎng)度為葉柄長(zhǎng)。

葉柄粗（Petioles wide，PW）：采用五點(diǎn)取樣法，利用游標(biāo)卡尺測(cè)量葉柄的直徑。

葉面積（Leaf area，LA）：隨機(jī)選取9片小葉，用圖像處理技術(shù)測(cè)量葉面積。

葉長(zhǎng)（Leaf length，LL）：隨機(jī)選取9片小葉，并壓平葉片測(cè)量其長(zhǎng)度。

葉寬（Leaf width，LW）：隨機(jī)選取9片小葉，并壓平葉片測(cè)量其寬度。

1.3 DNA提取

試驗(yàn)選取生長(zhǎng)良好的白三葉幼嫩葉片0.2 g，用CTAB法提取其基因組DNA［14］，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度和濃度。最后將DNA原液的一部分用ddH2O稀釋為20 ng·μL-1，DNA樣品于-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，剩余的DNA原液放于-80℃冰箱。

1.4 SSR反應(yīng)體系及電泳檢測(cè)

進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，將引物干粉稀釋至規(guī)定濃度放于4℃冰箱保存，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，其中加入10.5 μL PCR-Mix（北京天根生化公司），2 μL稀釋后的DNA，SSR上、下游引物各0.7 μL，最后加入6.1 μL ddH2O補(bǔ)足體積，用液體石蠟密封。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；35個(gè)降落PCR循環(huán)：94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸5 min，擴(kuò)增完成的PCR板放于4℃冰箱保存，保存時(shí)間最好不超過(guò)一周。取出PCR板，用8%聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，在緩沖體系為1×TBE的緩沖液中進(jìn)行檢測(cè)。膠版制好后固定在電泳儀上，拔出梳子后開(kāi)始點(diǎn)樣，點(diǎn)樣時(shí)樣孔中每樣品加樣3 μL，以D2000 Marker為對(duì)照，恒定電壓電泳約2 h，電壓為300 V。電泳完畢后，將膠板放于0.1%的AgNO3溶液銀染15 min，隨后放入NaOH液中，放置在搖床上直至顯色，最后用相機(jī)照相保存。

1.5 SSR引物的篩選

試驗(yàn)所用19條白三葉SSR標(biāo)記引物序列從Griffiths等［15］中篩選得出，引物信息詳見(jiàn)表1。篩選可重復(fù)性好、擴(kuò)增條帶清晰的引物，用于下一步雜交種的分析和鑒定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)使用Excel 2019 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，使用SPSS 28.0進(jìn)行單因素方差分析，并采用Origin 2021繪制聚類(lèi)熱圖，然后利用NTSYS PC 2.10軟件計(jì)算株系間的遺傳系數(shù)，用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析，并繪制樹(shù)狀聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白三葉雜交F1代的表型變異分析

通過(guò)SPSS 28.0對(duì)白三葉親本及雜交F1代共57個(gè)株系的株高、葉柄長(zhǎng)、葉柄寬、葉面積、葉長(zhǎng)和葉寬6個(gè)表型性狀進(jìn)行單因素方差分析，在方差齊性檢驗(yàn)顯示各樣本所在總體方差的前提下，F(xiàn)檢驗(yàn)表明測(cè)定的6個(gè)性狀個(gè)體間差異都達(dá)到極顯著水平（P≤0.01）。此外，白三葉親本及雜交F1代的6個(gè)表型性狀的變異系數(shù)分別為17.86%，15.54%，25.54%，34.36%，17.59%和17.11%。同時(shí)‘Tr-292’的表型性狀為219.40 mm，224.40 mm，2.22 mm，834.86 mm2，38.33 mm，30.22 mm，‘Tr-445’的表型性狀為287.80 mm，241.60 mm，2.80 mm，928.93 mm2，38.00 mm，35.00 mm，雜交后代中6個(gè)表型性狀均有超親優(yōu)勢(shì)的出現(xiàn)。表明白三葉親本及雜交F1代不同性狀在個(gè)體間具有較為豐富的變異為后續(xù)白三葉的育種工作提供了良好的基礎(chǔ)（表2）。

對(duì)白三葉親本及雜交F1表型進(jìn)行聚類(lèi)熱圖分析，結(jié)果如圖2所示：57個(gè)株系可以明顯的劃分為2類(lèi)，第Ⅰ類(lèi)27個(gè)雜交后代與‘Tr-445’（♂）聚在一起，雜交后代占比49.1%；第Ⅱ類(lèi)28個(gè)雜交后代與‘Tr-292’（♀）聚在一起，雜交后代占比50.9%。此外，與‘Tr-445’聚在一起的雜交后代在6個(gè)表型性狀的平均值分別為291.30 mm，275.61 mm，2.56 mm，1 080.12 mm2，38.12 mm，35.93 mm，與‘Tr-292’聚在一起的雜交后代在6個(gè)表型性狀的平均值分別為227.10 mm，223.92 mm，1.78 mm，623.10 mm2，28.91 mm，27.83 mm，表明與‘Tr-445’聚在一起的雜交后代其6個(gè)表型性狀明顯優(yōu)于與‘Tr-292’聚在一起的雜交后代。并且與‘Tr-445’聚在一起的雜交后代中大部分的葉色為紫色，表明其雜交后代成功獲得父母本的優(yōu)良性狀，為后續(xù)白三葉育種工作提供了良好的材料。

2.2 白三葉親本及雜交種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性分析

用篩選出的19對(duì)引物對(duì)白三葉2個(gè)親本及55個(gè)F1代進(jìn)行擴(kuò)增，共得到清晰可辨條帶281條。其中，多態(tài)性條帶137條，多態(tài)位點(diǎn)占比為48.41%；平均每對(duì)引物擴(kuò)增出14.79條帶，多態(tài)性條帶7.21條；每個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）在18.49%～43.58%之間，平均值為34.73%（表3）。

2.3 親本與其雜交F1代的聚類(lèi)分析

基于遺傳相似性指數(shù)，運(yùn)用NTSYS PC 2.10對(duì)2個(gè)白三葉親本與雜交F1代進(jìn)行非加權(quán)組平均法（Unweighted Pair-group Method with Arithmetic mean，UPGMA）聚類(lèi)分析，如圖3所示：在相似系數(shù)為0.664處可將55個(gè)F1劃分為四類(lèi)，第一類(lèi)是與母本‘Tr-292’聚在一起的45個(gè)雜交F1代，占81.82%；第二類(lèi)是與父本‘Tr-445’聚在一起的8個(gè)雜交F1代，占14.55%；第三類(lèi)是G013單獨(dú)聚在一起，占1.82%；第四類(lèi)是G010單獨(dú)聚在一起，占1.82%。大部分雜交后代都與母本聚在一起，表明‘Tr-292’（♀）與‘Tr-445’（♂）雜交中，雜交后代多為偏母本遺傳。此外，單獨(dú)聚成一類(lèi)的G013和G010可能是發(fā)生較大的重組變異，有利于下一步的育種工作。

2.4 雜交F1代真實(shí)性鑒定

從篩選出來(lái)的19對(duì)SSR引物中選擴(kuò)增帶型好，且父本出現(xiàn)明顯特征條帶的引物進(jìn)行F1代真假雜種的分子鑒定，選擇3對(duì)能產(chǎn)生互補(bǔ)特異位點(diǎn)的引物以確保鑒定的準(zhǔn)確性。將F1代SSR引物擴(kuò)增的條帶帶型與其親本比對(duì)，只要擴(kuò)增出父本特異性位點(diǎn)的判斷為真雜種，沒(méi)有擴(kuò)增出父本特異性位點(diǎn)為假雜種［16］，引物的擴(kuò)增條帶見(jiàn)圖4。

鑒定結(jié)果如表4所示：白三葉的55個(gè)雜交后代中真雜種53個(gè)，假雜種2個(gè)（分別為G013和G017），真雜種比率為96.36%，表明白三葉雜交獲得的真雜種比率較高。此外，引物gtrs165鑒定出真雜種29個(gè)，鑒定比率為52.73%；引物gtrs173鑒定出真雜種23個(gè)，鑒定比率為41.82%；引物gtrs245鑒定出真雜種51個(gè)，鑒定比率為92.73%。表明引物gtrs245鑒定真雜種的比率高、效果好，為加速白三葉育種工作奠定基礎(chǔ)。

3 討論

雜交育種作為最有效與最廣泛的育種方式，是擴(kuò)大遺傳變異和獲得新類(lèi)型材料的一個(gè)有效辦法［17］。但大多數(shù)異花授粉植物在雜交育種過(guò)程中后代易出現(xiàn)假雜種，極大地影響了其育種進(jìn)程［10］。此外，白三葉屬于異源四倍體，雜交后代遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜，性狀分離廣，難以從形態(tài)學(xué)上確定其真實(shí)性。SSR分子標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，具有重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，鑒定周期短等特點(diǎn)，目前已成為用于鑒定雜交后代真實(shí)性的最有效方法之一［18］。李文秀等［19］篩選出3對(duì)多態(tài)性引物對(duì)橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）優(yōu)良品系‘PR107’和‘93-114’的35株雜交后代進(jìn)行真實(shí)性鑒定，鑒定后代真雜種為100%，并驗(yàn)證了其1對(duì)引物鑒定真?zhèn)坞s種的可靠性。曹奕鴦等［20］應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定非洲菊（Gerbera jamesonii）F1代雜種的真實(shí)性，選用4對(duì)引物將65個(gè)雜交后代鑒定為真雜種，真雜種率達(dá)100%。陳慶明等［21］利用2對(duì)多態(tài)性引物對(duì)‘綠優(yōu)’冬瓜（Benincasa hispida）和‘梅花8號(hào)’節(jié)瓜雜種種子純度進(jìn)行鑒定，分子檢測(cè)平均純度均為98%，田間純度鑒定分別為98%和99%，結(jié)果基本一致。在本研究中55份雜交后代，其后代與父本顏色一致為綠色的僅有11個(gè)雜交后代，與母本顏色一致為紫色的有44個(gè)雜交后代。此外，在親本及雜交F1代的株高、葉柄長(zhǎng)、葉柄粗、葉面積、葉片長(zhǎng)和葉片寬6個(gè)表型性狀的聚類(lèi)熱圖中，與父本表型相似的有27個(gè)雜交后代，與母本表型相似的有28個(gè)雜交后代。但在SSR分子標(biāo)記鑒定中顯示，其鑒定出的假雜種僅有G013和G017這兩個(gè)雜交后代，且都在聚類(lèi)熱圖中與父本表型類(lèi)似。表明白三葉雜交后代遺傳復(fù)雜，僅通過(guò)表型不能完成其真實(shí)性的鑒定，SSR分子標(biāo)記結(jié)果更為準(zhǔn)確。

此外，對(duì)于SSR分子標(biāo)記而言，理論上1對(duì)多態(tài)性較好的引物便可以對(duì)雜交后代完成鑒定［22］。但在實(shí)際操作中，僅用1對(duì)引物難以鑒定出全部的真雜種，其鑒定結(jié)果可能存在一定的誤差［23-24］。朱志成［25］在使用2對(duì)SSR引物鑒定玉米（Zea mays）的種子純度時(shí)發(fā)現(xiàn)，每個(gè)引物的鑒別效果有差異。因此為使SSR分子標(biāo)記結(jié)果更加可靠，選用2對(duì)及2對(duì)以上SSR引物較為合理［10］。有研究認(rèn)為，大田試驗(yàn)的外界條件復(fù)雜，易出現(xiàn)用多對(duì)引物鑒定同一批雜交種，引物檢測(cè)結(jié)果不一致的現(xiàn)象［26］。因此本研究采用3對(duì)多態(tài)性引物，進(jìn)一步提高SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果的可靠性。

雜交后代群體的遺傳變異水平與雜交的成功與否密切相關(guān)。雷雨等［18］在茶樹(shù)（Camellia sinensis）真假雜種的SSR鑒定及遺傳多樣性分析顯示，其遺傳相似系數(shù)在0.44～0.95之間，有較豐富的遺傳變異。本研究中白三葉雜交后代的遺傳相似系數(shù)為0.52～0.84，表明其雜交后代群體具有較為豐富的遺傳變異。特別是G010雖鑒定為真雜種，但在UPGMA聚類(lèi)分析中單獨(dú)聚成一類(lèi)，離親本的關(guān)系較遠(yuǎn)，表明其具有較大的遺傳變異。此外，在聚類(lèi)熱圖和UPGMA聚類(lèi)分析中，雜交后代多數(shù)與母本聚在一起，且雜交后代在葉色上大都與母本一致，雜交子代獲得父本優(yōu)良性狀較少。因此在后續(xù)雜交育種中將考慮以‘Tr-445’為母本，‘Tr-292’為父本，以期獲得更多具有父本優(yōu)良性狀的雜交后代。綜上所述，白三葉雜交后代群體具有較為豐富的遺傳變異，為后續(xù)育種工作提供了良好的條件。

4 結(jié)論

對(duì)2個(gè)白三葉親本及55個(gè)雜交F1的6個(gè)表型性狀進(jìn)行聚類(lèi)熱圖分析，55個(gè)雜交后代可以明顯的劃分為2類(lèi)，第Ⅰ類(lèi)27個(gè)雜交后代與‘Tr-445’（♂）聚在一起，雜交后代占比49.1%；第Ⅱ類(lèi)28份雜交后代與‘Tr-292’（♀）聚在一起，雜交后代占比50.9%。選用19對(duì)SSR引物對(duì)2白三葉親本‘Tr-292’和‘Tr-445’以及55個(gè)雜交后代進(jìn)行分析，共得到清晰可辨條帶281條，多態(tài)性條帶137條，多態(tài)位點(diǎn)占比為48.41%，每個(gè)SSR位點(diǎn)的PIC在18.49%～43.58%之間，平均值為34.73%，具有較高的多態(tài)性，可直接用于白三葉遺傳多樣性分析、雜種鑒定等相關(guān)研究。3對(duì)能產(chǎn)生互補(bǔ)特異位點(diǎn)的引物在55個(gè)雜交后代中共鑒定出53個(gè)真雜種，真雜種比率為96.36%，與UPGMA聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致。

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（責(zé)任編輯 劉婷婷）