摘 要：以香菇廢菌棒為原料，通過(guò)水熱法一步制備得到水溶性和單分散性良好的碳量子點(diǎn)，基于碳量子點(diǎn)對(duì)不同濃度諾氟沙星熒光淬滅速率的差異，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)諾氟沙星的濃度。結(jié)果表明，碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度淬滅因子（F0-F）/F0與諾氟沙星濃度在0～80 μmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的回歸方程為y=0.099 1x+0.036 1，R2=0.99。采用碳量子點(diǎn)熒光淬滅法檢測(cè)諾氟沙星溶液的濃度，試驗(yàn)結(jié)果與理論計(jì)算結(jié)果一致，表明碳量子點(diǎn)熒光淬滅法檢測(cè)諾氟沙星具有良好的可行性。

關(guān)鍵詞：香菇廢菌棒；碳量子點(diǎn)；熒光淬滅；諾氟沙星

中圖分類號(hào)：O657.3" " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " "文章編號(hào)：1674-0033（2024）04-0050-06

引用格式：趙艷艷，趙穎杰，鄭紅星.碳量子點(diǎn)熒光淬滅法檢測(cè)諾氟沙星研究[J].商洛學(xué)院學(xué)報(bào)，2024，38（4）：50-55.

Detection of Norfloxacin by Fluorescence Quenching

Method with Carbon Quantum Dot

ZHAO Yan-yan1， ZHAO Ying-jie1， ZHENG Hong-xing2

（1.College of Biopharmaceutical and Food Engineering， Shangluo University， Shangluo" 726000， Shaanxi; 2.Qinling-Bashan Mountains Bioresources Comprehensive Development C. I. C.， Shaanxi University of Technology， Hanzhong" 723001， Shaanxi）

Abstract： A carbon quantum dot with good water solubility and mono-dispersity is prepared via one step hydrothermal method with waste mushroom sticks as raw material. The standard curve can be obtained and the concentration of norfloxacin can be detected based on the different fluorescence quenching rate of the carbon quantum dot in different norfloxacin concentration. The experimental results indicate that fluorescence quenching factor （F0-F）/F0 of carbon quantum dot has a good linear relationship with the concentration of norfloxacin in the range of 0～80 μmol/L， the regression equation obtained from the standard curve is y=0.099 1x+0.036 1， R2=0.99. The fluorescence quenching method with carbon quantum dot is employed to detect the concentration of norfloxacin， the experimental results are consistent with the theoretical calculation results， suggesting the good feasibility of the carbon quantum dot-based fluorescence quenching method.

Key words： waste mushroom sticks; carbon quantum dot; fluorescence quenching; norfloxacin

諾氟沙星（Norfloxacin，NOR）又名氟哌酸，屬于典型的第三代氟喹諾酮類抗菌藥物[1]。由于抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、毒副作用小等特點(diǎn)，NOR被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療行業(yè)和畜牧養(yǎng)殖業(yè)。然而，大量的NOR通過(guò)人體、動(dòng)物的排泄等途徑進(jìn)入環(huán)境并在水體和土壤中累積，誘導(dǎo)了環(huán)境中致病耐藥菌株的出現(xiàn)，對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境造成了巨大威脅[2]。開發(fā)一種能夠快速、高效檢測(cè)環(huán)境中抗生素的方法，顯得尤為重要。目前常用的檢測(cè)抗生素類藥物活性成分的方法包括薄層色譜法、高效氣相和液相色譜法、酶聯(lián)免疫法等[3-5]。這些檢測(cè)方法所需儀器昂貴、操作復(fù)雜、檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，導(dǎo)致檢測(cè)成本偏高。納米熒光探針是近年來(lái)發(fā)展的新技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，在藥物活性分子檢測(cè)領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景[6]。

碳量子點(diǎn)（CQDs）是一類粒徑小于10 nm的新型熒光納米粒子，具有比表面積大、生物相容性好、激發(fā)波長(zhǎng)依賴的光致發(fā)光性、化學(xué)惰性和低毒性等優(yōu)點(diǎn)，是優(yōu)良的納米熒光探針材料，可用于快速檢測(cè)藥物活性成分[7-8]。李萍等[9]以鐵觀音茶為原料，用水熱合成了具有藍(lán)色熒光的CQDs，并作為熒光探針應(yīng)用于水體中Cr6+離子的檢測(cè)，較高選擇性可滿足定量分析要求。馮建海等[10]以L-半胱氨酸和葡萄糖做碳源制備CQDs，與藥物中鏈霉素的濃度有著良好線性關(guān)系，且回收率較高，相對(duì)偏差較小。王騰飛等[11]以小麥、大米等作為碳源，用水熱合成了一種新型熒光探針，該探針可與Fe3+結(jié)合致熒光淬滅，而在多巴胺作用下可不同程度恢復(fù)熒光，因此可用于牛奶中鹽酸多巴胺的檢測(cè)。大量研究表明，CQDs制備方法簡(jiǎn)單，可檢測(cè)生物活性分子。CQDs是一種應(yīng)用前景良好的新型納米熒光材料。

食用菌是商洛市的支柱經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)之一，其生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的廢菌棒。這些廢菌棒中含有豐富的有機(jī)碳，具有很高的再利用價(jià)值。本研究基于變廢為寶的理念，以香菇廢菌棒作為碳源，采用一步水熱法制備具有良好單分散性和NOR熒光淬滅的水溶性CQDs，并通過(guò)CQDs的熒光強(qiáng)度變化檢測(cè)NOR的濃度。以期為CQDs納米熒光探針檢測(cè)藥物活性分子提供理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1 材料

香菇廢菌棒來(lái)源于陜西商洛娜娜菌業(yè)有限公司；諾氟沙星膠囊來(lái)自于哈藥集團(tuán)制藥總廠；氫氧化鈉和鹽酸購(gòu)自于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，試劑純度為分析純；試驗(yàn)所用超純水采自實(shí)驗(yàn)室Millipore超純水系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1碳量子點(diǎn)的制備

取適量香菇廢菌棒，用超純水清洗去除表面的泥土、灰塵等殘留物，在電熱鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃烘干，粉碎，得到菌渣粉末。稱取0.5 g菌渣粉末，加入50 mL超純水，轉(zhuǎn)移至100 mL聚四氟乙烯水熱釜中，200 ℃條件下水熱反應(yīng)8 h，待冷卻至室溫后，將反應(yīng)釜內(nèi)的混合溶液取出，5 000 r/min離心，取上清液，得到淺黃色澄清透明的CQDs水溶液。

1.2.2碳量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu)表征

采用透射電鏡（TEM）觀察CQDs的納米尺寸和分散性，傅里葉變換紅外光譜（FTIR）檢測(cè)其表面特征官能團(tuán)。

1.2.3碳量子點(diǎn)的熒光光譜檢測(cè)

量取制備的CQDs溶液2 mL，加入超純水稀釋至10 mL備用。采用F-380型熒光光譜儀，設(shè)置入射波長(zhǎng)的狹縫寬度為2.5 nm，發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬度設(shè)為5.0 nm，掃描速率為12 000 nm/min，光電倍增管電壓600 V的條件下進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，在360 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，記錄CQDs的熒光發(fā)射光譜圖。

1.2.4碳量子點(diǎn)的熒光穩(wěn)定性檢測(cè)

量取制備的CQDs溶液2 mL于10 mL比色管中，用0.2 mol/L HCl和0.2 mol/L NaOH分別調(diào)節(jié)pH至1～14，采用F-380型熒光光譜儀檢測(cè)不同pH下CQDs溶液的熒光強(qiáng)度。將CQDs溶液避光放置240 h，采用熒光光譜儀檢測(cè)不同pH下CQDs溶液的熒光強(qiáng)度，考察放置時(shí)間對(duì)CQDs熒光穩(wěn)定性的影響。

1.2.5碳量子點(diǎn)檢測(cè)諾氟沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線

取出諾氟沙星膠囊劑里面的藥粉，用瑪瑙研缽研成細(xì)粉。稱取NOR細(xì)粉160 mg至50 mL玻璃杯中，再加入5 mL濃度為2 mol/L的鹽酸溶液，接著加入超純水，超聲10 min至NOR完全溶解后，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，得到濃度為0.5 mmol/L的NOR溶液，備用。量取一定量的NOR溶液，加入25 mL的容量瓶中，接著加入5 mL制備得到的CQDs水溶液，用超純水定容至刻度，分別得到濃度為0，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80 μmol/L的NOR溶液。搖勻后靜置30 min，在360 nm的熒光激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定其熒光強(qiáng)度，記錄F和F0的值（F0是NOR濃度為0時(shí)CQDs的熒光強(qiáng)度；F是不同NOR濃度下CQDs的熒光強(qiáng)度）。以熒光淬滅因子（F0-F）/F0為縱坐標(biāo)，NOR濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。

1.2.6碳量子點(diǎn)檢測(cè)諾氟沙星

分別量取5 mL制備得到的CQDs溶液至25 mL容量瓶中，接著在各容量瓶中分別加入3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5 mL濃度為0.5 mmol/L的NOR溶液，用超純水定容至刻度，搖勻，在360 nm的熒光激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定其熒光強(qiáng)度，計(jì)算熒光增強(qiáng)因子（F0-F）/F0。根據(jù)1.2.5的方法求得的回歸方程計(jì)算NOR的含量，驗(yàn)證CQDs熒光探針檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

2" 結(jié)果與分析

2.1 碳量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1碳量子點(diǎn)的TEM分析

采用TEM觀察制備得到的CQDs的尺寸和微觀形貌，結(jié)果如圖1所示。通過(guò)高溫水熱法制備得到的CQDs為單分散性能良好的小顆粒。對(duì)CQDs的尺寸進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到粒徑分布圖，結(jié)果表明制備得到的CQDs直徑介于2～6 nm，平均直徑為4 nm，具有均勻的尺寸。

2.1.2碳量子點(diǎn)的FTIR結(jié)構(gòu)分析

采用傅里葉變換紅外光譜儀分析CQDs的表面特征官能團(tuán)，結(jié)果如圖2所示。3 245 cm-1處觀察到較寬的峰為—OH的伸縮振動(dòng)峰，2 930 cm-1處的特征峰為—CH的伸縮振動(dòng)峰，1 580 cm-1處的特征峰為C=C的伸縮振動(dòng)，1 380 cm-1處的峰為—C=O的伸縮振動(dòng)，1 273 cm-1處的峰為—COO的伸縮振動(dòng)，1 075 cm-1處的峰為—C—O的伸縮振動(dòng)。FTIR結(jié)果表明，該CQDs表面有羥基、羧基等有機(jī)官能團(tuán)，因而其親水性能優(yōu)良。豐富的表面官能團(tuán)更容易與藥物活性分子的官能團(tuán)連接，有利于檢測(cè)過(guò)程。

2.2 碳量子點(diǎn)的熒光光譜分析

為確定制備的CQDs的最佳激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，采用F-380型熒光分光光度計(jì)對(duì)CQDs進(jìn)行了熒光發(fā)射光譜的測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。在360 nm的熒光激發(fā)波長(zhǎng)下，CQDs的發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm。

2.3 碳量子點(diǎn)的熒光穩(wěn)定性

光學(xué)穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)CQDs納米熒光探針檢測(cè)性能的一個(gè)重要參數(shù)。采用F-380型熒光分光光度計(jì)分析CQDs在不同pH條件下的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖4所示。CQDs的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm，且該CQDs在酸性條件下具有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。其熒光強(qiáng)度隨著pH值的增大逐漸減小，在堿性條件下發(fā)生熒光淬滅。表明該CQDs可用于酸性和中性條件下對(duì)活性物質(zhì)的檢測(cè)。

由于所制備的CQDs熒光在堿性條件下會(huì)淬滅，因此考察pH=1～7條件下的CQDs室溫避光放置240 h后的熒光強(qiáng)度，研究其熒光穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5所示。pH值為1，3，5，7的CQDs在450 nm發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度分別為5 400，4 041，3 231和2 493，與圖4的熒光強(qiáng)度相比沒(méi)有發(fā)生明顯衰減，說(shuō)明CQDs熒光穩(wěn)定性良好。

2.4 碳量子點(diǎn)對(duì)諾氟沙星的檢測(cè)

評(píng)價(jià)不同濃度NOR誘導(dǎo)的CQDs的熒光響應(yīng)強(qiáng)度，結(jié)果如圖6所示。在360 nm熒光激發(fā)波長(zhǎng)下，CQDs在450 nm發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度隨著NOR的濃度增加而減小，熒光淬滅因子（F0-F）/F0與NOR濃度C在0～80 μmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.099 1x+0.036 1，R2=0.99，表明該CQDs熒光探針在0～80 μmol/L范圍內(nèi)可實(shí)現(xiàn)對(duì)NOR的定量檢測(cè)。

為了驗(yàn)證CQDs對(duì)NOR檢測(cè)的可行性，配制不同濃度的NOR溶液，加入一定量的CQDs溶液，搖勻后，用F-380型熒光分光光度計(jì)檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。記錄360 nm熒光激發(fā)波長(zhǎng)下CQDs在450 nm發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光光譜，計(jì)算熒光淬滅因子（F0-F）/F0，結(jié)果如圖7所示。根據(jù)回歸方程計(jì)算NOR的濃度分別為60.2，62.3，64.3，65.9，67.9，70.4 μmol/L。試驗(yàn)結(jié)果與NOR的理論濃度一致，說(shuō)明該CQDs納米熒光探針檢測(cè)NOR具有良好的可行性。

3" 討論與結(jié)論

CQDs作為一種新型的納米熒光材料，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、優(yōu)異的光穩(wěn)定性、高選擇性和高靈敏度、良好的生物相容性及無(wú)細(xì)胞毒性等優(yōu)勢(shì)，可作為理想的納米熒光探針材料應(yīng)用于活性物質(zhì)檢測(cè)、生物成像、光化學(xué)和生命科學(xué)等領(lǐng)域[12]。Wang等[13]以葡萄糖和乙二胺為前驅(qū)體，通過(guò)簡(jiǎn)易的一鍋水熱法合成了一種新型氮摻雜碳量子點(diǎn)（N-CQDs）熒光探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)四環(huán)素的特異性檢測(cè)。Sajwan等[14]合成了Au@CQDs納米熒光材料，實(shí)現(xiàn)了對(duì)慶大霉素和卡那霉素的高效檢測(cè)。本文基于變廢為寶的理念，以香菇廢菌棒為原料，通過(guò)水熱法制備得到了表面富含羥基、羧基等特征官能團(tuán)、水溶性和單分散性能良好的CQDs。在360 nm的熒光激發(fā)波長(zhǎng)下，制備得到的CQDs在450 nm處有最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)。熒光穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，CQDs的熒光強(qiáng)度隨著pH值的增大逐漸減小，并在堿性條件下發(fā)生淬滅，因此其可用于酸性和中性條件下對(duì)活性物質(zhì)的檢測(cè)。CQDs的熒光淬滅因子（F0-F）/F0與NOR濃度在0～80 μmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，在該范圍內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)NOR的定量檢測(cè)。CQDs納米熒光探針檢測(cè)NOR具有成本低廉、操作過(guò)程簡(jiǎn)便、耗時(shí)短等優(yōu)勢(shì)，為環(huán)境中抗生素的快速檢測(cè)提供了一種靈敏度高、選擇性好的方法。

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