摘要：

采用金屬輔助化學(xué)蝕刻法制備高定向硅納米線陣列（silicon nanowire arrays， SiNWs），結(jié)合碳點（carbon dots，CDs）改性制備了一種新型無標(biāo)記光電免疫傳感器，用于心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I， cTnI）的檢測。N型SiNWs作為光陽極，可獲得強(qiáng)的光電信號基底響應(yīng)。采用旋涂法將CDs負(fù)載于SiNWs表面，可以提高SiNWs對可見光的吸收能力，促進(jìn)光生載流子分離，從而提高SiNWs的光電性能；同時，CDs為抗體連接提供了羧基活性位點?；贑Ds@SiNWs的光電免疫傳感器對cTnI的檢測具有良好的線性范圍（0.005～5.000 ng/mL）和較低的檢出限（3.79 pg/mL）。所設(shè)計的光電化學(xué)（photoelectrochemical， PEC）免疫傳感器具有良好的靈敏度、穩(wěn)定性和重復(fù)性。該電極可實現(xiàn)無標(biāo)簽檢測，為實現(xiàn)cTnI的即時檢測提供了新的途徑。

關(guān)鍵詞：光電免疫傳感器；心肌肌鈣蛋白 I；硅納米線陣列；碳點

中圖分類號：TQ 127 " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Construction and performance of photoelectrochemical

immunosensor based on CDs@SiNWs

HUANG Yueyi， " " "ZHI Shibo， " " "LI Huijun

（School of Materials and Chemistry， University of Shanghai for Science and Technology， Shanghai 200093， China）

Abstract：A novel label-free photoimmunosensor was prepared by metal-assisted chemical etching of highly oriented silicon nanowire arrays （SiNWs） combined with carbon dots （CDs） modification for the detection of cardiac troponin I （cTnI）. N-type SiNWs were used as photoanodes to obtain a strong photoelectric signal response. CDs are loaded on the surface of SiNWs by the spin-coating method. CDs can improve the photoelectric performance of SiNWs by enhancing the absorption of visible light and promoting the separation of photogenerated carriers; meanwhile， CDs provide the carboxyl active site for antibody attachment. The CDs@SiNWs-based immunosensor has a good linear range （0.005-5.000 ng/mL） and a low detection limit （3.79 pg/mL） for the detection of cTnI. The designed photoelectrochemical （PEC） immunosensor has good sensitivity， stability， and reproducibility. The electrode enables label-free detection and provides a new way to achieve immediate detection of cTnI.

Keywords： "photoelectrochemical immunosensor; "cardiac troponin I; "silicon nanowire arrays; "carbon dots

急性心肌梗死（acute myocardial infarction， AMI）已成為最直接危及生命的心血管疾病之一^[1]。心肌肌鈣蛋白I （cTnI）是AMI診斷的主要生物標(biāo)志物，cTnI的檢測可應(yīng)用于AMI的早期篩查、診斷和預(yù)后^[2]。光電化學(xué)（photoelectrochemical， PEC）生物免疫傳感器具有靈敏度高、操作簡單、易于小型化、成本低等優(yōu)點，被認(rèn)為是生物分析的有力工具^[3]。

近年來，許多具有優(yōu)異性能的半導(dǎo)體材料被用于設(shè)計光電化學(xué)傳感器，硅納米線（（silicon nanowire arrays， SiNWs））是一種窄禁帶（Eg=1.12 eV）半導(dǎo)體材料，具有較低的反射率以改善光捕獲，較大的比表面積以提供更多的活性位點，快速和直接的載流子傳輸途徑以提高載流子的分離效率等優(yōu)點^[4]，能成為PEC分析的高活性光電材料。碳點（carbon dots，CDs）由于其優(yōu)異的光學(xué)性能、出色的導(dǎo)電性、低生物毒性、高化學(xué)穩(wěn)定性、良好的水溶性等，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域^[5-6]。CDs與半導(dǎo)體材料復(fù)合，一方面CDs促進(jìn)電子的轉(zhuǎn)移，同時可以擴(kuò)大對光的吸收范圍，增強(qiáng)半導(dǎo)體材料的光電性能^[7-8]。

本文以含有豐富羧基的沒食子酸為前驅(qū)體，以N，N?二甲基甲酰胺（DMF）為溶劑，通過溶劑熱法制備了含有羧基的碳點（COOH-CDs）。將制備的COOH-CDs通過旋涂法修飾在SiNWs表面，在提高SiWNs光電性能的同時，為抗體的固定也提供了活性位點；通過系列表征手段對其光電性能進(jìn)行探究。

1 " "試 驗

1.1 " "CD @SiNWs 的制備

采用金屬輔助化學(xué)蝕刻法^[9]制備SiNWs。首先清洗（100）硅片（n型），將硅片放置到濃硫酸：雙氧水體積比為7：1的清洗液中浸泡30 min，依次用丙酮、去離子水（3次）、乙醇、去離子水（3次）進(jìn)行超聲清洗。將清洗好的硅片，放入5 mol/L氫氟酸和0.04 mol/L硝酸銀混合溶液中蝕刻1 min，去離子水沖洗硅表面多余離子。將沉積好Ag^＋的硅片放入含有0.3 mol/L過氧化氫和5 mol/L氫氟酸混合溶液中蝕刻 1 h。最后將蝕刻好的SiNWs放入濃硝酸溶液中浸泡30 min以上，去除殘余銀納米顆粒得到SiNWs。

以含有豐富羧基的沒食子酸為前驅(qū)體，DMF為溶劑，通過溶劑熱法制備COOH-CDs。將200 mg沒食子酸加入到30 mL DMF溶液中，攪拌10 min至溶液澄清；然后將燒杯中溶液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯（50 mL）內(nèi)襯中，將內(nèi)襯放入不銹鋼高壓反應(yīng)釜，在180 ℃下溶劑熱反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液放置24 h后，通過0.22 μm的濾膜真空抽濾，經(jīng)透析后得到COOH-CDs。COOH-CDs通過旋涂的方法將其修飾在SiNWs表面。旋涂速度設(shè)置為3 000 r/min，旋涂時間為30 s；重復(fù)3次，得到CDs-SiNWs電極。

1.2"材料表征

采用掃描電子顯微鏡（scanning electron micro-scope，SEM）和透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）分析樣品形貌。采用傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR），拉曼光譜儀（Raman spectrometer，Raman），X射線衍射儀（X-ray diffractometer，XRD）分析樣品的相組成和化學(xué)鍵合性質(zhì)。用X射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectrometer，XPS）研究樣品物相組成。

1.3" 光電免疫測試

首先，活化負(fù)載于電極表面CDs的羧基。將CDs-SiNWs電極浸泡在含有1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞氨（EDC，10 mg/mL）和 N-羥基琥珀酰?亞氨（NHS，10 mg/mL）的混合溶液15 min；然后，將羧基活化后的CDs-SiNWs電極表面滴加0.1 mg/mL的肌鈣蛋白抗體，在37 ℃恒溫箱中孵育1 h（電極放置于濕盒中避免電極表面干燥）；反應(yīng)結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗電極表面得CDs-SiNWs/Ab電極，然后將該電極浸泡在1 mg/mL的BSA溶液中30 min，封閉電極表面活性位點；最后，用PBS沖去未結(jié)合的BSA，得到PEC免疫傳感器CDs-SiNWs/Ab/BSA電極。CDs-SiNWs/Ab/BSA免疫傳感器的構(gòu)建如圖1所示。

采用Ivium電化學(xué)工作站對電極進(jìn)行光電性能測試。選用三電極體系，Ag/AgCl為參比電極，鉑片（Pt）為對電極，樣品為工作電極。PEC檢測過程采用模擬太陽光源，光照強(qiáng)度為100 mW/cm²。測試在PBS（0.01 mol/L，pH=7.2）溶液中進(jìn)行。進(jìn)行免疫傳感檢測時，將不同濃度的抗原滴加到電極表面，孵育1 h；孵育完成后PBS緩沖液漂洗，得到的電極進(jìn)行PEC測試。

2 " "結(jié)果與分析

2.1 " "材料結(jié)構(gòu)表征

從圖2（a）上可以看出，在XRD譜圖中29°和41.2°的位置有兩個峰衍射峰，分別對應(yīng)于石墨的（002）晶面和（100）晶面，可以證明所制備得到的固體是CDs。圖2（a）下為SiNWs電極的XRD譜圖，在69°處出現(xiàn)了硅的特征峰，對應(yīng)（400）晶面，這表明成功制備出SiNWs^[10]。為了進(jìn)一步證明CDs成功修飾在SiNWs表面，對修飾前后的SiNWs進(jìn)行了FTIR測試。如圖2（b）所示，SiNWs在1078cm^?1處的吸收峰是由Si?O的拉伸振動引起^[11]。經(jīng)CDs修飾后，SiNWs的紅外光譜在3 436、2 934、2 856、1 629、1 430 cm^?1處出現(xiàn)新吸收峰。其中，3 436、1 430 cm^?1的吸收峰歸因于?OH的伸縮振動；2 934、285 6 cm^?1是由于C?H的伸縮振動；1 629 cm^?1是由于C=O的伸縮振動^[12]。紅外光譜表明CDs-SiNWs的表面成功修飾了CDs，并具備用于固定抗體的羧基活性位點。

2.2"材料形貌表征

圖3比較了CDs修飾前后SiNWs形貌的變化。圖3（a）和3（b）是修飾前SiNWs的俯視圖和截面圖，從圖中可以看出SiNWs分布均勻。TEM對CDs微觀形貌進(jìn)行表征。如圖3（c）和3（d）所示，TEM圖顯示CDs粒徑分布均勻，從高分辨TEM圖中可以看到該CDs具有清晰的晶格條紋，測量其晶格間距為0.33 nm，對應(yīng)于石墨碳的（002）晶面。圖3（e）和3（f）顯示了修飾CDs后SiNWs的形貌，對比CDs修飾前SiNWs的形貌幾乎沒有發(fā)生變化。由于CDs的尺寸只有10 nm左右，且負(fù)載量較少，因此，在SEM圖中無法直接觀察到CDs。

2.3"材料成分分析

為了探究CDs是否成功修飾于SiNWs表面，通過XPS對修飾后的SiNWs進(jìn)行元素分析。如圖4（a）所示，CDs-SiNWs的XPS全譜顯示新增了N。進(jìn)一步對各元素分析后，圖4（b） C1s高分辨能譜顯示，CDs-SiNWs上存在C=O（288.1 eV）、C?O（286.0 eV）和C?C/C=C（284.6 eV）3種不同類型的碳，這與CDs點中C種類一致^[13]。圖4（c）中N1s高分辨譜中，吡咯N和吡啶N也與CDs保持一致^[14]。圖4（d）中高分辨O1s譜顯示，在533.2、532.2、531.4 eV處存在吸附氧、C?O和C=O，與CDs中O種類相對應(yīng)^[15-16]。此外，532.2、531.4 eV處C?O和C=O鍵表明CDs-SiNWs表面可能含有?COOH官能團(tuán)，為后續(xù)生物傳感器的構(gòu)建提供活性位點。

2.4"免疫傳感器性能研究

如圖5（a）所示，CDs修飾首先提高了SiNWs的光電流密度，但隨著Ab、BSA、Ag等蛋白質(zhì)分子依次負(fù)載于電極表面，其光電流密度逐漸下降。圖5（b）的電化學(xué)阻抗譜（electrochemical impedance spectroscopy， EIS）表明了蛋白質(zhì)連接過程中電極表面電阻變化情況。從圖5中可以看到，CDs修飾明顯降低了電極表面阻值，由于蛋白質(zhì)的絕緣特性，隨著電極表面連接蛋白質(zhì)數(shù)量不斷增加，電極阻值也在逐漸增大。EIS的變化進(jìn)一步證明了Ab成功固定于電極表面。

將不同濃度的cTnI分別滴加在免疫傳感器電極表面，孵育1 h 后用PBS沖去未結(jié)合的抗原。每個濃度準(zhǔn)備3個電極為平行實驗。cTnI會與免疫傳感器表面固定好的Ab發(fā)生特異性結(jié)合，非目標(biāo)抗原不會結(jié)合在電極表面，免疫傳感器在不同濃度的抗原溶液中結(jié)合不同數(shù)量的抗原；由于空間位阻效應(yīng)，抗原結(jié)合在免疫傳感器表面后，會引起免疫傳感器光電流密度變化。圖6（a）顯示，隨著抗原濃度的增加，光電流密度逐漸降低。為了減少不同批次之間初始空白電極性能波動帶來的影響，用光電流的相對變化值作為對不同濃度cTnI的信號響應(yīng)值。I₀表示空白電極的光電流值，I表示某濃度cTnI下光電流信號。以光電流下降的百分比（I₀-I）/I₀作為縱坐標(biāo)，cTnI 濃度取對數(shù)作為橫坐標(biāo)作圖，其線性關(guān)系如圖6（b）所示。檢測結(jié)果顯示，在0.005～5.000 ng/mL內(nèi)，cTnI 濃度與光電流下降百分比成線性關(guān)系，線性方程為Y=0.434 92+0.179 65X，線性相關(guān)系數(shù)R²=0.97，cTnI 的檢測下限（LOD）為3.79 pg/mL（S/N=3）。

3"結(jié) 論

本文采用金屬輔助化學(xué)蝕刻法制備了SiNWs，CDs用于SiNWs表面改性，可促進(jìn)電子的轉(zhuǎn)移，并進(jìn)一步連接cTnI抗體?；贑Ds@SiNWs制備的光電免疫傳感器具有較好的檢測性能，在0.005～5.000 ng/mL，cTnI抗體濃度與光電流下降百分比成線性關(guān)系，線性方程Y=0.43492+0.17965X，線性相關(guān)系數(shù)為0.97，cTnI的檢測下限（LOD）為3.79 pg/mL（S/N=3），實現(xiàn)對cTnI的超靈敏檢測，在生物免疫傳感領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用潛力。

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（編輯：畢莉明）