關(guān)鍵詞 團(tuán)頭魴； lpin1 基因； 基因表達(dá)； 肌肉損傷修復(fù)

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞（skeletal muscle satellite cell，MuSC）是參與肌肉受損后修復(fù)和再生過程的肌肉干細(xì)胞［1］。一旦肌肉受到損傷，MuSC 就會(huì)響應(yīng)并退出靜止?fàn)顟B(tài)，然后增殖成為生肌前體細(xì)胞或肌母細(xì)胞［2］，增殖結(jié)束后分化成肌細(xì)胞，以相互融合或和肌纖維融合的方式來修復(fù)受到損傷的肌肉組織，并補(bǔ)充骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量［3-4］。在這個(gè)過程中，MuSC會(huì)受到多種因子的調(diào)控，特別是以Pax7（paired box7）表達(dá)為特征的MuSC 發(fā)揮著十分關(guān)鍵的作用，缺乏Pax7 的衛(wèi)星細(xì)胞，會(huì)導(dǎo)致肌肉再生失敗［5-6］。

Lpin1 既可以作為一種磷脂酸磷酸化酶（phos?pha-tidic acid phophyhydrolase，PAP）參與磷脂和甘油三酯的合成［7］，也可以作為一種轉(zhuǎn)錄輔激活因子，調(diào)節(jié)脂類代謝相關(guān)基因的表達(dá)［8］。之前的研究發(fā)現(xiàn)Lpin1 在脂肪分解和脂肪細(xì)胞分化［9-10］、肝臟脂肪酸和脂蛋白生成［11］以及線粒體自噬中都發(fā)揮重要作用［12-14］。LPIN1 缺乏癥患者會(huì)出現(xiàn)肌肉萎縮和橫紋肌溶解癥［15-16］，LPIN1 基因雜合子突變的患者也易患他汀類藥物誘導(dǎo)的肌?。?7］。LPIN1 缺乏的脂肪肝營(yíng)養(yǎng)不良小鼠在肌肉損傷后，再生肌纖維橫截面會(huì)減少，肌分化因子（myogenic differentiation，MyoD）的表達(dá)降低［18］。另外，小鼠Lpin1 基因缺乏會(huì)導(dǎo)致其骨骼肌纖維表型顯著變化，肌膜下線粒體質(zhì)量也有所增加［19］。在斑馬魚中，lpin1 基因的缺失會(huì)導(dǎo)致肌分裂缺陷，初級(jí)和次級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元減少［20］。以上研究說明，磷脂酸磷酸化酶基因可能在骨骼肌損傷后修復(fù)的過程中扮演著重要角色。

前期基于團(tuán)頭魴骨骼肌損傷后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，lpin1 基因在團(tuán)頭魴肌肉損傷后差異表達(dá)［21］，為進(jìn)一步研究該基因的功能，本研究克隆團(tuán)頭魴lpin1 基因，檢測(cè)lpin1 在團(tuán)頭魴成魚各組織及胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)模式，并分析肌肉損傷對(duì)該基因表達(dá)的影響，旨在為深入研究lpin1 基因在魚類肌肉損傷修復(fù)過程中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 肌肉損傷試驗(yàn)和樣品收集

本研究使用的團(tuán)頭魴幼魚（1 齡）全長(zhǎng)（15.62±2.33） cm，購(gòu)自黃岡團(tuán)頭魴養(yǎng)殖場(chǎng)，充氧袋打包運(yùn)回華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院試驗(yàn)基地，并于池中暫養(yǎng)2 周后用于肌肉損傷試驗(yàn)。供試魚用0.1% 的MS-222（Sigma）麻醉后，用直徑0.2 cm 的針頭插入其排泄孔上方側(cè)線附近的肌節(jié)中進(jìn)行肌肉損傷操作，其中輕度損傷的長(zhǎng)度約為0.3 cm，重度損傷的長(zhǎng)度約為1 cm，深度約為0.5 cm。將損傷后的團(tuán)頭魴魚體消毒后立即放入清水中，正常養(yǎng)殖。分別于損傷后0、24、48、72、96、144、216 h 取損傷部位的肌肉組織（規(guī)格為1.0 cm ×1.0 cm），所取樣品立即放入液氮中保存，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取9 尾魚樣本。

試驗(yàn)所需胚胎及仔魚是通過3 對(duì)團(tuán)頭魴親本人工授精而來。受精卵在平均水溫27 ℃左右的孵化桶中進(jìn)行孵化，解剖鏡下觀察胚胎發(fā)育情況，取樣后立即放入液氮中保存。原位雜交所用胚胎去卵膜后于4% 多聚甲醛中4 ℃ 固定24 h 后脫水至甲醇中-20 ℃保存。另外，采集團(tuán)頭魴成魚（n=3）肝臟、鰓、心臟、大腦、腸道和肌肉等6 個(gè)組織樣品，用于分析目的基因在各組織中的表達(dá)情況。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

參照TRIzol? Reagent 說明書提取各時(shí)間點(diǎn)團(tuán)頭魴胚胎、仔魚和成魚各組織及損傷肌肉的總RNA，用HiScript?ⅡQRT SuperMix for qPCR（+gDNA wip?er）試劑盒將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后保存至-20 ℃。

1.3 基因的克隆

從筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期已有的團(tuán)頭魴轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得lpin1 基因的序列，通過PCR 驗(yàn)證該基因的ORF 序列，并送至武漢天一輝遠(yuǎn)科技有限公司測(cè)序，PCR 引物見表1。

1.4 生物信息學(xué)分析

運(yùn)用在線網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gox/orffinder）預(yù)測(cè)氨基酸序列；使用MAGA 6.0 軟件構(gòu)建Lpin1 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹、DNAMAN 軟件進(jìn)行Lpin1 蛋白的多序列比對(duì)；蛋白質(zhì)信號(hào)肽預(yù)測(cè)、蛋白質(zhì)的理論分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)分析分別用軟件SignalP（www.cbs. dtu. dk/services/SignalP/）和Protparam（http：//web.expasy.org/protparam）進(jìn)行；利用NCBI 的CDD數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）預(yù)測(cè)Lpin1 蛋白的結(jié)構(gòu)域。

1.5 熒光定量PCR

為分析lpin1 基因的時(shí)空表達(dá)譜，本研究分別以團(tuán)頭魴成魚各組織、胚胎發(fā)育各時(shí)期和不同損傷程度的肌肉的cDNA 為模板，以ef-1α 作為內(nèi)參基因，試驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)［22］，結(jié)果通過2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量并使用GraphPad Prism 6 進(jìn)行制圖。數(shù)據(jù)以Mean±SD 表示，采用單因素方差分析方法（ANOVA）和Duncan’s 進(jìn)行差異表達(dá)分析，當(dāng)Plt;0.05 時(shí)為差異顯著。

1.6 整胚原位雜交

以團(tuán)頭魴cDNA 作為模板擴(kuò)增lpin1 基因，PCR產(chǎn)物回收后參照下列反應(yīng)體系進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄：回收產(chǎn)物1 μg，DIG-labeling UTP Mix（10×）1 μL，Tran?scription buffer（5×）2 μL，T7/SP6 RNA 聚合酶（20U/μL）1 μL，RNase Inhibitor 1 μL，DEPC 水加至20μL；吹打混勻后37 ℃水浴2 h，然后加入1 μL DNas?eI 37 ℃水浴15 min 除去DNA 后合成探針。整胚原位雜交的步驟參照文獻(xiàn)［23］進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的序列分析

團(tuán)頭魴lpin1 基因的ORF 序列長(zhǎng)度為2 694 bp，編碼897 個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)的蛋白理論分子質(zhì)量為98.93 ku，理論等電點(diǎn)為5.43。SignalP 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Lpin1 蛋白N-末端無信號(hào)肽，為非分泌型蛋白。基于多個(gè)物種Lpin1 氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，魚類聚為1 個(gè)分支，爬行類、鳥類和哺乳類形成另一分支，在魚類分支中團(tuán)頭魴與鯉和斑馬魚的親緣關(guān)系最近（圖1）。多序列比對(duì)結(jié)果如圖2 所示，團(tuán)頭魴Lpin1 和鯉的相似性最高（80.92%），其次是斑馬魚（79.55%），最低的是白沙鳉（53.33%）。對(duì)不同物種Lpin1 蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明，該蛋白的氨基端、中間和羧基端都有一段高度保守的序列，分別為L(zhǎng)ipin-N、Lipin-mid 和LNS2（Lipin/Ned1/Smp2）結(jié)構(gòu)域。

2.2 團(tuán)頭魴lpin1 的時(shí)空表達(dá)

使用熒光定量PCR 分析lpin1 基因在團(tuán)頭魴成魚各組織和胚胎各發(fā)育階段的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lpin1mRNA 在肌肉和心臟中的表達(dá)量最高且顯著高于其他組織（圖3）。另外，lpin1 基因在胚胎發(fā)育過程中的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，但在出膜后的表達(dá)量相對(duì)較高，且隨著發(fā)育的進(jìn)行其表達(dá)量逐漸增加并在出膜后8 d達(dá)到峰值（圖4）。整胚原位雜交結(jié)果進(jìn)一步顯示，lpin1 在受精卵期就能檢測(cè)到高表達(dá)，并且在體節(jié)生成期前的各時(shí)期呈現(xiàn)持續(xù)而一致的泛表達(dá)模式。從肌肉效應(yīng)期開始，可以在體節(jié)肌中觀察到弱表達(dá)，而在眼、端腦、中腦以及后腦中檢測(cè)到強(qiáng)信號(hào)，心跳期表現(xiàn)得尤其明顯；隨后的出膜期，其表達(dá)主要在大腦、肝臟和腸道，并且在體節(jié)肌中持續(xù)表達(dá)（圖5）。

2.3 肌肉損傷后團(tuán)頭魴lpin1 和pax7 基因表達(dá)的變化

熒光定量PCR 結(jié)果顯示，與未損傷組相比，lpin1 和pax7 基因在輕度和重度損傷后24 h 的表達(dá)均下調(diào)。輕度損傷后，lpin1 表達(dá)量在48 h 達(dá)到峰值，然后降低，但在48～216 h 其表達(dá)量均高于對(duì)照組；而pax7 基因表達(dá)量在損傷后96 h 顯著升高，并在144 h 達(dá)到最高。重度損傷后，lpin1 表達(dá)量在72h 和216 h 時(shí)顯著高于對(duì)照組；pax7 表達(dá)量在48 h 和96～216 h 均顯著高于對(duì)照組，且在96 h 達(dá)到峰值（圖6）。

3 討論

本研究獲得了團(tuán)頭魴lpin1 基因ORF 全長(zhǎng)2 694bp，編碼897 個(gè)氨基酸。通過對(duì)不同物種功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白的氨基末端和羧基末端都有一段高度保守的序列，分別為L(zhǎng)ipin-N 和LNS2（Lipin/Ned1/Smp2）結(jié)構(gòu)域。其中LNS2 結(jié)構(gòu)域包含了磷脂酸磷酸酶活性序列DxDxT 和轉(zhuǎn)錄共激活因子功能的活性位點(diǎn)基序LxxIL，DxDxT 的存在將Lpin1 鑒定為鹵代酸脫鹵酶超家族（haloacid dehalogenase super?family， HAD）的成員［24］，PGC-1α 和PPARα 能通過與LxxIL 直接作用調(diào)節(jié)脂肪酸氧化基因的轉(zhuǎn)錄［8］。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示團(tuán)頭魴與其他魚類聚為一個(gè)分支，且與鯉和斑馬魚的親緣關(guān)系最近。Lpin1 的結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化樹分析說明其在進(jìn)化過程中可能具有保守的生物學(xué)功能。

本研究發(fā)現(xiàn)lpin1 mRNA 在團(tuán)頭魴成魚肌肉和心臟中的表達(dá)顯著高于其他組織。類似地，在小鼠中，lpin1 基因在脂肪、心臟和骨骼肌中高表達(dá)［7， 25］。斑馬魚中，l pin1 基因在胚胎早期發(fā)育過程中泛表達(dá)，隨后開始在體節(jié)中特異表達(dá)，受精后24 h 在頭部和體節(jié)肌表達(dá)，受精后72 h 僅在神經(jīng)嵴、頭肌和胸鰭處檢測(cè)到，但受精后6 d 在肌節(jié)特異性表達(dá)恢復(fù)［20］。與在斑馬魚中研究相符，我們的研究結(jié)果顯示，lpin1mRNA 從受精卵到體節(jié)生成期呈泛表達(dá)；肌肉效應(yīng)期和心跳期在眼和腦中檢測(cè)到強(qiáng)表達(dá)，出膜期在腦、肝臟和腸道的特異表達(dá)尤為明顯，在這個(gè)過程中，lpin1 在體節(jié)肌中持續(xù)弱表達(dá)。

當(dāng)骨骼肌出現(xiàn)損傷后，肌衛(wèi)星細(xì)胞被激活，通過增殖、遷移和分化形成肌細(xì)胞，經(jīng)過融合過程后形成新的肌纖維以修復(fù)受傷的肌肉組織［7，26-27］。肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化過程中，受到生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)錄因子等不同類型信號(hào)分子的調(diào)控［28-29］。Pax7 作為肌肉發(fā)育和再生所需的MuSC 標(biāo)志物［30］，在哺乳動(dòng)物損傷后骨骼肌再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用［31-32］。研究發(fā)現(xiàn)團(tuán)頭魴肌肉損傷后，Pax7+細(xì)胞的數(shù)量在損傷后96～144 h達(dá)到峰值，且重度損傷的肌肉中Pax7+細(xì)胞的增殖比輕度損傷的肌肉更顯著［21］。在斑馬魚中，pax7 和pax3 的表達(dá)水平在損傷后4～5 d 達(dá)到峰值［33］。在小鼠成肌細(xì)胞中，Lpin1 可以抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）磷酸化進(jìn)而抑制肌肉再生［18］，而ERK 信號(hào)的激活發(fā)生在肌肉再生的早期階段［34］和傷口愈合過程中［35］。另外，在脂肪肝營(yíng)養(yǎng)不良中Lpin1 缺乏會(huì)影響骨骼肌的再生能力［18］，斑馬魚中l(wèi)pin1 缺失也會(huì)導(dǎo)致骨骼肌發(fā)育受損［20］。本研究也發(fā)現(xiàn)與損傷前相比，lpin1 基因在肌肉損傷修復(fù)過程中的表達(dá)發(fā)生顯著變化，這些結(jié)果都說明lpin1 基因可能參與肌肉的損傷修復(fù)過程。

綜上，本研究克隆獲得團(tuán)頭魴lpin1 基因，其Lip?in-N、Lipin-mid 和LNS2 結(jié)構(gòu)域在進(jìn)化上高度保守。時(shí)空表達(dá)結(jié)果顯示lpin1 在團(tuán)頭魴成魚肌肉中的表達(dá)量最高，從受精卵到出膜后20 d 的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，且肌肉效應(yīng)期和心跳期時(shí)在頭部和體節(jié)中特異表達(dá)。另外，本研究也發(fā)現(xiàn)團(tuán)頭魴肌肉不同程度損傷后，lpin1 與pax7 基因表達(dá)變化呈現(xiàn)相似趨勢(shì)，這些結(jié)果可為研究lpin1 基因在魚類肌肉損傷和修復(fù)過程中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。