陳妍竹,張雪敏,俞詩(shī)音,王夢(mèng)迪,杜運(yùn)鵬,楊鳳萍,張秀海,李玉舒,曹麗

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002; 2.北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所,北京 100097;3.北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院,北京 100083; 4.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院,北京 102442)

百合是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)植物,屬野百合的一個(gè)變種,具備極高的觀賞價(jià)值[1]。百合屬植物有110～115個(gè)種,其中只有卷丹百合(Liliumlancifolium)、淡黃花百合(Liliumsulphureum)、通江百合(Liliumsargentiae)和珠芽百合(Liliumbulbiferum)這4個(gè)種在自然條件下可在莖的葉腋處形成珠芽。珠芽繁殖具有繁殖系數(shù)高、低毒,生產(chǎn)的種球質(zhì)量高,育種周期短等優(yōu)勢(shì),已成為卷丹重要的繁殖策略之一[2]。在有珠芽百合中,卷丹表現(xiàn)出更多的特殊性。卷丹是在中國(guó)分布范圍最廣的百合科百合屬植物,分布于中國(guó)17個(gè)省、自治區(qū)、直轄市。其花大色艷,抗性強(qiáng),兼具觀賞、食用、藥用價(jià)值,為中國(guó)食用百合的主要野生種[3]。截至2019年,中國(guó)食藥用百合產(chǎn)業(yè)規(guī)模超過100億元,而卷丹是中國(guó)藥典記載的三大藥用百合之一,種植面積約30 km2,產(chǎn)值約45億元,是食藥用百合種植面積最多的種。卷丹一般為三倍體,難以通過有性繁殖方式擴(kuò)大種群。目前,制約中國(guó)食藥用百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要阻礙之一是百合種球退化嚴(yán)重。因此脫毒種球的生產(chǎn)是百合產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效、綠色可持續(xù)發(fā)展的核心。珠芽發(fā)生機(jī)制的解析,對(duì)提高百合的栽培及繁殖效率有著重要的生產(chǎn)意義,對(duì)促進(jìn)百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要理論和應(yīng)用價(jià)值。

細(xì)胞分裂素作為重要的植物激素,幾乎參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)方面,如頂端優(yōu)勢(shì)、延遲衰老、頂端分生組織維持、從頭器官再生、根系增殖、頂端分生組織功能和營(yíng)養(yǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[4-5]。研究表明,細(xì)胞分裂素參與珠芽的形成,并在珠芽的形成過程中起促進(jìn)作用[6]。在薯蕷(Dioscoreapolystachya)體外球莖誘導(dǎo)過程中,增加培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素的濃度可以顯著提高球莖誘導(dǎo)率[7]。NAVARRO等[8]報(bào)道,外施細(xì)胞分裂素能夠促進(jìn)番茄(SolanumlycopersicumL.)腋下塊莖的形成。反應(yīng)調(diào)節(jié)因子家族(response regulators,RRs)被認(rèn)為是植物細(xì)胞分裂素響應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子,對(duì)擬南芥基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒別分析,發(fā)現(xiàn)該家族共有24個(gè)基因,被分為了3類:A型、B型和C型[9]。在結(jié)構(gòu)上A型只帶有可接受磷酸的接收器結(jié)構(gòu)域,由細(xì)胞分裂素轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo),是主要的細(xì)胞分裂素應(yīng)答基因,負(fù)調(diào)控細(xì)胞分裂素信號(hào)通路,降低對(duì)細(xì)胞分裂素的敏感性[10-14]。C型ARRs與A型ARRs相似,但它們的表達(dá)不是由細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的[9,15]。B型ARRs帶有保守的核定位信號(hào)(nuclear localization signal, NLS)區(qū)域,在亞細(xì)胞定位研究中全部定位于細(xì)胞核[15]。而B型除具有接收器結(jié)構(gòu)域之外,還包含與DNA結(jié)合的MYB-like結(jié)構(gòu)域與反式激活區(qū)域,是細(xì)胞分裂素信號(hào)通路中的正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子,可直接與靶DNA序列結(jié)合,激活靶基因的表達(dá)[16-17]。ARR1屬于B型ARR基因,是最先被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄因子的RRs家族成員之一。研究表明,ARR1在細(xì)胞分裂素信號(hào)傳遞的通路中起著核心的調(diào)控作用[16]。且干細(xì)胞分化和腋芽的形成與細(xì)胞分裂素信號(hào)通路通過B-ARRs激活WUSCHEL基因的表達(dá)相關(guān)[18-19]。

通過北京市農(nóng)林科學(xué)院草葉花卉與景觀生態(tài)研究所百合組前期珠芽形成過程的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),LlARR1基因在卷丹S0(珠芽準(zhǔn)備發(fā)生期)和S1(珠芽小白點(diǎn)時(shí)期)[6]的表達(dá)中具有顯著差異。對(duì)LlARR1基因在卷丹百合珠芽形成過程中表達(dá)分析進(jìn)行研究,以期能夠進(jìn)一步闡述卷丹珠芽發(fā)生的性狀,為卷丹珠芽發(fā)生機(jī)制研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 植物材料 卷丹獨(dú)頭種球及不同品種有珠芽、無珠芽百合種植于北京市農(nóng)林科學(xué)院國(guó)家百合種質(zhì)資源圃中。根據(jù)北京市農(nóng)林科學(xué)院草葉花卉與景觀生態(tài)研究所百合組前期對(duì)珠芽的觀察,將其發(fā)生發(fā)育階段劃分了4個(gè)時(shí)期分別為S0、S1、S2、S3[6]。每個(gè)時(shí)期取9株卷丹,每株卷丹取同一部位的2個(gè)相鄰葉腋,每3株卷丹的葉腋作為一個(gè)混合樣本混樣;同時(shí)取每株卷丹百合上下部葉腋處;不同品種百合取其植株上部葉腋處混合樣本錫箔紙包裹后用液氮速凍,在-80 ℃冰箱中凍存,用于后續(xù)總RNA的提取及qRT-PCR的檢測(cè)。

1.1.2 不同激素處理卷丹百合 隨機(jī)選取30株卷丹百合進(jìn)行外源激素處理并觀察。噴灑蒸餾水作為對(duì)照,且每3 d噴灑100 mg ·L-1生長(zhǎng)素IAA和100 mg·L-1生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑NPA以及100 mg·L-1赤霉素GA3溶液。每個(gè)處理中均使用了10個(gè)獨(dú)立的植株。

1.1.3 菌株、載體和試劑 EASYspin Plus多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒(愛博森生物科技有限公司,北京),大腸桿菌(DH5α)感受態(tài)BC102細(xì)胞(博邁德生物技術(shù)有限公司,北京),pCE2 TA/Blunt-Zero Vector載體5 min TM TA/Blunt-Zero Cloning Kit,2×Phanta? Flash Master Mix(Dye Plus),2×Rapid Taq Master Mix和反轉(zhuǎn)錄試劑HiScriptⅢ SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(諾唯贊,南京),DNA通用純化回收試劑盒(天根生化科技有限公司,北京),熒光定量PCR試劑TB Green? Premix ExTaqTM(寶生物工程有限公司,大連)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 卷丹百合中LlARR1來源 通過對(duì)處于不同發(fā)育時(shí)期的卷丹葉腋和珠芽混樣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,并基于前人[20]對(duì)細(xì)胞分裂素通路研究的基礎(chǔ)上,在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中篩選細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑相關(guān)所有基因。

1.2.2LlARR1基因克隆及定量引物設(shè)計(jì) 利用卷丹珠芽發(fā)生發(fā)育過程轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選獲得目的基因,利用目的基因的轉(zhuǎn)錄本序列在ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)獲得其開放閱讀框(open reading frames, ORF)序列,將獲得的長(zhǎng)度大于200 bp的ORF序列在NCBI protein BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/-Blast.cgi)依次進(jìn)行比對(duì),與轉(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果相吻合即視為比對(duì)成功,保存比對(duì)成功的ORF序列用于定量引物設(shè)計(jì)。將保存的ORF序列提交至GenScript(https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool?page_no= 1& position_no=2&sensors=googlesearch),調(diào)整參數(shù)orga-nism:other,size range:180～220 bp,Tm≥60 ℃進(jìn)行定量引物設(shè)計(jì),根據(jù)引物設(shè)計(jì)的原則選擇最好的1～2個(gè)設(shè)計(jì)結(jié)果作為定量引物,后續(xù)再進(jìn)行定量引物的篩選。

克隆引物和病毒檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)則是將該ORF序列提交至NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找獲得基因的CDS序列,利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)克隆引物,熒光定量引物,克隆引物和病毒檢測(cè)引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。

表1 LlARR1基因克隆及定量試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.3 總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄 試驗(yàn)中選取的材料包括卷丹百合葉腋、卷丹百合不同組織、不同品種百合(有珠芽和無珠芽)開花前的莖稈上部葉腋以及不同激素處理(IAA、NPA、GA3,噴施質(zhì)量濃度均為100 mg·L-1)的卷丹百合葉腋,其總RNA利用EASYspin Plus多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒提取;根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑HiScript Ⅲ SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反應(yīng)體系為:5×HiScriptIII qRT SuperMix 4 μL,4×gDNA wiper Mix 4 μL,RNA 1 μg,RNase Free ddH2O添加至20 μL;反應(yīng)條件為:37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s;4 ℃永久保存。反應(yīng)結(jié)束后,樣品于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣品制備及文庫(kù)構(gòu)建 卷丹百合S0、S1、S2、S3,4個(gè)時(shí)期葉腋樣品,液氮冷凍,-80 ℃凍存。由北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及初步數(shù)據(jù)分析。NCBI SRA (順序讀取存檔)登錄號(hào)為PRJNA916842。

采用EASYspin Plus多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒(愛博森生物科技有限公司,北京)提取總RNA。首先通過Oligo(dT)磁珠富集帶的mRNA,隨后加入Fragmentation Buffer隨機(jī)打斷得到的mRNA。以片段化的mRNA為模板,在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA第一條鏈,隨后用RNaseH降解RNA鏈,并在DNA polymerase I體系下,以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過末端修復(fù),加A尾并連接測(cè)序接頭,用AMPure XP beads篩選約370～420 bp的cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物,最終獲得文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后,首先使用Qubit 2.0 Fluorometer進(jìn)行初步定量,稀釋文庫(kù)至1.5 ng·μl-1,隨后使用Agilent 2100 bioanalyzer對(duì)文庫(kù)大小進(jìn)行檢測(cè),而后,qRT-PCR對(duì)文庫(kù)有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度高于1.5 nmol·L-1),以保證文庫(kù)質(zhì)量。

1.2.5LlARR1基因克隆 利用卷丹葉腋cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系包含2×Phanta Master Mix 25 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA 2 μL,ddH2O 19 μL,總體系50 μL。反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃ 30 s,98 ℃ 10 s,55 ℃ 5 s,72 ℃ 15 s,72 ℃ 5 min,共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并用DNA回收試劑盒(TIANGEN,北京)回收目的片段;將目的片段連接至pCE2 TA/Blunt-Zero Vector載體,并轉(zhuǎn)化到DH5α(博邁德,北京)感受態(tài)中,涂布于LB固體培養(yǎng)基(含50 mg·L-1卡那霉素),37 ℃培養(yǎng)12 h后,隨機(jī)挑取單克隆并進(jìn)行菌液PCR檢測(cè),將條帶位置正確的陽性單克隆菌液送往生工生物工程(上海)有限公司。

1.2.6LlARR1序列分析、蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 通過ProtParam對(duì)蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析;利用ProtScale對(duì)蛋白親疏水性進(jìn)行分析;采用TMHMM Serverv 2.0分析編碼氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)域;利用NetPhos 2.0 Server進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè);利用NCBI ORF finder在線程序及Conserved domains數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)序獲得的cDNA序列進(jìn)行開放閱讀框及保守功能結(jié)構(gòu)域分析;利用PredictProte預(yù)測(cè)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)域;通過SOPMA及SWISS.MODEL預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu);利用Cell-PLoc 2.0分析亞細(xì)胞定位情況;利用JAlview進(jìn)行編碼蛋白多重序列比對(duì);利用MEGA7.0進(jìn)行Neighbor.joining系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。系統(tǒng)發(fā)育樹中序列的模體結(jié)構(gòu)采用MEME(https://meme-suite.org/me-me/tools/meme)在線網(wǎng)站進(jìn)行分析。

1.2.7LlARR1的表達(dá)分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系:5 μL TB green、1 μL cDNA模板、0.4 μL上下游引物、3.6 μL ddH2O。擴(kuò)增程序:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,循環(huán)39次。以卷丹18S為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計(jì)算LlARR1的相對(duì)表達(dá)量。利用Excel 2019、SPSS17.0、GraphPad Prism8等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 卷丹百合珠芽發(fā)生發(fā)育時(shí)期劃分

根據(jù)卷丹百合珠芽發(fā)生發(fā)育過程將其劃分為4個(gè)時(shí)期,將第1個(gè)葉腋處產(chǎn)生小白點(diǎn)時(shí)期記為S1時(shí)期,將該葉腋上部1～3個(gè)葉片的葉腋記為S0時(shí)期,即珠芽準(zhǔn)備發(fā)生時(shí)期。隨著珠芽發(fā)育,依次將珠芽綠球期記為S2時(shí)期,珠芽成熟期記為S3時(shí)期(圖1)。

A. S0:珠芽準(zhǔn)備發(fā)生期;B. S1:珠芽小白點(diǎn)期;C. S2:珠芽綠球期;D. S3:珠芽成熟期。A.S0: Preparation stage; B. S1: White dot stage; C. S2: Green bulbil stage; D. S3: Mature bulbil stage.

2.2 卷丹ARR1在珠芽發(fā)生過程轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)

基于細(xì)胞分裂素在腋芽發(fā)生過程中的重要性[6],為探究卷丹百合珠芽發(fā)生過程中的細(xì)胞分裂素相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)S0和S1時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,在細(xì)胞分裂素信號(hào)通路中,篩選到了一個(gè)注釋為ARR1的差異表達(dá)基因。相比于S1時(shí)期,該基因在S0時(shí)期有較高的表達(dá)(圖2-A),并且熒光定量的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致(圖2-B)。

**表示差異極顯著(p<0.01)。下同。 ** indicates a significant difference (p<0.01). The same as below.

2.3 卷丹LlARR1基因CDS全長(zhǎng)克隆及其編碼氨基酸序列分析

為獲得LlARR1基因CDS序列,將其轉(zhuǎn)錄本序列提交至ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)找到一條全長(zhǎng)2 148 bp的序列,使用引物L(fēng)lARR1-F和LlARR1-R對(duì)卷丹LlARR1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得1條長(zhǎng)度約為2 000 bp的條帶(圖3-A),純化回收后連接TA/Blunt-Zero Vector載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后,通過菌液PCR挑選條帶正確的陽性克隆單克隆菌液送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明,LlARR1基因開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)2 148 bp,共編碼715個(gè)氨基酸。如圖3-B中,紅色方框?yàn)槠鹗济艽a子,藍(lán)色方框?yàn)榻K止密碼子。

注:M代表DNA marker trans2K plus; 1,2指LIARR1基因的PCR產(chǎn)物。Note:M represents for DNA marker trans2K plus,1,2 refers to the PCR product of the LIARR1 gene.

2.4 LlARR1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

經(jīng)分析,16種ARR1蛋白聚為5個(gè)小分支,具有較高的支持率,LlARR1與卷丹(Liliumlancifolium)、雜交百合(Liliumhybrid division)的ARR1序列處于同一個(gè)進(jìn)化分支上,表明它們的親緣關(guān)系最近(圖4)。模體結(jié)構(gòu)分析顯示,基序1,2,3比較保守,不同物種的16個(gè)ARR1蛋白均含有1,2,3基序,且均無特有基序,說明ARR1蛋白是比較保守的。此外,聚合在系統(tǒng)進(jìn)化樹同一分支內(nèi)的不同植物ARR1的模體基序是相似的,關(guān)系越近,模體基序越相似。

圖4 LlARR1與其他物種同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹及模體分析Fig.4 LlARR1 Phylogenetic tree and motif analysis of proteins homologous to other species

2.5 卷丹LlARR1蛋白生物信息學(xué)分析

2.5.1 卷丹LlARR1蛋白的理化性質(zhì)分析 對(duì)卷丹LlARR1基因編碼的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,結(jié)果顯示,該蛋白分子式為C3361H5329N987O1102S29,相對(duì)分子質(zhì)量為78 125.98,理論等電點(diǎn)為5.76,脂肪系數(shù)為72.24。LlARR1蛋白的氨基酸中共含有82個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸殘基(Asp+Glu),70個(gè)帶正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)(圖5-A)。不穩(wěn)定系數(shù)為50.68,蛋白親水性平均值為-0.517,因此LlARR1為不穩(wěn)定疏水性蛋白(圖5-B)。LlARR1蛋白從內(nèi)到外無跨膜區(qū)域,有接近1的概率表明該蛋白位于膜外,推測(cè)是一種非跨膜蛋白(圖5-C)。LlARR1蛋白含有可能發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)有81個(gè),包括Ser(絲氨酸)60個(gè)、Thr(蘇氨酸)16個(gè)、Tyr(酪氨酸)5個(gè)(圖5-D)。

圖5 LlARR1蛋白理化性質(zhì)分析Fig.5 Analysis of physicochemical properties of LlARR1 protein

2.5.2 卷丹LlARR1蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析 采用NCBI CD search在線網(wǎng)站分析LlARR1基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域,該蛋白有2個(gè)specific-hits,為REC_typeB_ARR-like和myb SHAQKYF位點(diǎn),分別屬于REC superfamily、SANT superfamily(圖6-A)。

圖6 LlARR1蛋白質(zhì)二三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of secondary and tertiary structure of LlARR1 protein

注:不同字母表示在0.05水平上差異顯著。下同。Note: The different letters within the same column mean significant difference by Duncan’s multiple range test at p<0.05.The same as below.

利用SOPMA在線軟件對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明,LlARR1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量中:無規(guī)則卷曲(黃色c)(58.32%)>α螺旋(藍(lán)色h)(26.01%)>延伸鏈(紅色e)(10.63%)>β轉(zhuǎn)角(綠色t)(5.03%),因此可推斷,無規(guī)則卷曲和α螺旋是LlARR1蛋白的主要組成成分(圖6-B)。蛋白質(zhì)的多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行盤曲或折疊形成具有規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)。利用在線軟件SWISS-MODEL對(duì)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,獲得了LlARR1蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型,發(fā)現(xiàn)LlARR1以DNA-binding response regulator作為目標(biāo)建模,含有8個(gè)α螺旋,6個(gè)β折疊 ,組分間均以β轉(zhuǎn)角(loop)相連(圖6-C)。采用CellPLoc 2.0亞細(xì)胞定位顯示,該蛋白主要定位于細(xì)胞核。

2.6 LlARR1在卷丹百合不同組織及植株上下莖部的表達(dá)分析

為探究LlARR1的表達(dá)模式,通過qRT-PCR檢測(cè)了卷丹百合不同組織及同一植株S0時(shí)期莖稈上下部中LlARR1的相對(duì)表達(dá)量。從圖中可以看到,LlARR1在葉腋中的表達(dá)最高,在花柱中的表達(dá)水平最低,并且其在珠芽中的表達(dá)水平顯著低于葉腋(圖7-A),推測(cè)LlARR1的表達(dá)主要集中于珠芽準(zhǔn)備發(fā)生時(shí)期,即S0時(shí)期,但在珠芽發(fā)育時(shí)期的表達(dá)處于較低水平。隨后發(fā)現(xiàn),LlARR1在莖稈上部的表達(dá)水平顯著高于莖稈下部,而卷丹珠芽的發(fā)生主要集中于莖稈上部(圖7-B)。因此,基于以上結(jié)果可以說明,LlARR1可能主要在珠芽發(fā)生過程中發(fā)揮作用。

2.7 ARR1在不同百合品種中的定量分析

為進(jìn)一步探究ARR1在珠芽發(fā)生中表達(dá)模式,選取了不同系列的11種百合來檢測(cè)莖稈上部ARR1的表達(dá)量,分別是A系列品種(‘Flore Pleno’‘Pearl White’‘Red Velvet’)、A復(fù)色品種(‘Fore-ver Linda)、Free A系列(‘Easy Whisper’)、Tiger A系列(‘Strawberry Event’)、LA重瓣系列(‘Must See’)、OA系列(‘Hotel California’)、O系列(‘Brasilia’)、OT系列(‘Red Morning’)和T系列(‘Orange Planet’)。以上11種百合中,OA系列的‘Hotel California’和A系列的‘Flora pleno’均可以自然產(chǎn)生珠芽,‘Must See’在植株開花后才能產(chǎn)生珠芽外,而其余8個(gè)品種在自然條件下均不能產(chǎn)生珠芽。檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ARR1在2種可以產(chǎn)生珠芽的百合中的表達(dá)水平顯著高于其他9個(gè)品種(圖8)。而圖9中ARR1在‘Red Velvet’、Strawberry Event’2個(gè)不產(chǎn)生珠芽品的相對(duì)表達(dá)量高于‘Must See’。這可能是由于取樣時(shí)‘Must See’尚未產(chǎn)生珠芽。該結(jié)果進(jìn)一步說明ARR1可能作用于珠芽的發(fā)生過程,并可能發(fā)揮一個(gè)正調(diào)控因子的作用。

圖8 ARR1在不同百合品種中的表達(dá)水平Fig.8 Expression levels of ARR1 in different varieties of lily

注:以NPA作為相對(duì)的量;*表示差異顯著(p<0.05);**表示差異極顯著(p<0.01):ns表示無顯著差異(p>0.05)。Note: NPA is used as a relative quantity;* indicats significant difference (p<0.05); ** means highly significant difference (p<0.01); ns means no significant difference (p>0.05).

2.8 LlARR1在不同激素處理中的表達(dá)分析

珠芽的發(fā)生發(fā)育受到多種激素的調(diào)控[2]。為探究LlARR1對(duì)不同激素的響應(yīng),對(duì)卷丹植株進(jìn)行了3種激素處理(IAA、NPA、GA3)(圖9)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)照植株中,LlARR1在S2時(shí)期有一個(gè)小峰值,推測(cè)其在珠芽發(fā)育過程中也發(fā)揮作用。IAA處理中,LlARR1的表達(dá)在S0時(shí)期被顯著抑制,但在后期的S3時(shí)期被顯著上調(diào)。NPA的處理緩解了S0時(shí)期IAA對(duì)LlARR1的抑制,但在后期的S2時(shí)期,NPA對(duì)LlARR1有一定的抑制作用。在赤霉素處理中,LlARR1在S0時(shí)期被顯著抑制,但在后期的發(fā)育過程中均被上調(diào)。由該結(jié)果推測(cè),LlARR1可能在珠芽準(zhǔn)備期發(fā)揮的作用與生長(zhǎng)素和赤霉素相反,但在后期的珠芽發(fā)育過程中發(fā)揮相似的作用。

3 結(jié)論與討論

擬南芥中的細(xì)胞分裂素信號(hào)通路涉及3個(gè)組成部分:擬南芥組氨酸激酶(AHKs)、擬南芥組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移酶(AHPs)和擬南芥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子(ARRs)[21-22,17]。擬南芥中的細(xì)胞分裂素受體家族由3個(gè)組氨酸激酶組成:AHK2、AHK3和AHK4(CRE1或WOL1)[23-24]。AHPs是AHK細(xì)胞分裂素受體的下游靶蛋白,并將磷酸基轉(zhuǎn)移到下游的ARRs,B型ARRs是最終的磷酸化受體[25-28]。已有研究表明,ARR1可能是細(xì)胞分裂素通路中參與調(diào)控珠芽發(fā)生的相關(guān)基因。YANG等[29]通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),細(xì)胞分裂素的高生物合成和低降解可能促進(jìn)卷丹上部葉腋處珠芽的形成,HE等[30]的研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)珠芽的形成,尤其是珠芽的啟動(dòng),而ARR1是細(xì)胞分裂素信號(hào)通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子[31],推測(cè)卷丹珠芽形成過程中ARR1基因可能發(fā)揮重要作用。而其研究檢測(cè)了ARR1在卷丹珠芽發(fā)生過程中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在珠芽發(fā)生過程中ARR1的表達(dá)表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì),這與本研究結(jié)果有所不同,可能是由于對(duì)發(fā)生時(shí)期的劃分有所不同所導(dǎo)致,但這些結(jié)果均說明ARR1可能參與卷丹珠芽的發(fā)生。在擬南芥的腋芽發(fā)生過程中,外源施加細(xì)胞分裂素,可以促進(jìn)ARR1的表達(dá)進(jìn)而激活WUS的表達(dá)來促進(jìn)腋芽的再發(fā)生,這可以說明細(xì)胞分裂素在腋芽的發(fā)生過程中起著重要的作用[18]。目前,對(duì)ARR1在卷丹珠芽發(fā)生發(fā)育過程中的表達(dá)模式及其結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行具體的探討較少,且缺少ARR1參與珠芽發(fā)育過程的研究,本研究初步劃分了卷丹珠芽的發(fā)生發(fā)育時(shí)期,并對(duì)LlARR1在卷丹發(fā)生發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式進(jìn)行了檢測(cè)。

本研究通過對(duì)S0和S1時(shí)期卷丹珠芽轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,從差異基因中篩選得到了差異顯著的基因ARR1,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。氨基酸多序列同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)LlARR1和其他植物的同源性較高,表明植物中ARR1蛋白的氨基酸序列較為保守,在模體分析中這一點(diǎn)也得到了驗(yàn)證。模體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),不同植物ARR1蛋白基序大多比較保守。此外,系統(tǒng)進(jìn)化樹及模體結(jié)構(gòu)分析還發(fā)現(xiàn),親緣關(guān)系越近的種屬,ARR1蛋白的模體結(jié)構(gòu)越相似,LlARR1與卷丹ARR1的模體結(jié)構(gòu)一致,說明二者確為同一基因,與雜交百合ARR1相似度最高,推測(cè)二者可能具有相似的功能。且LlARR1編碼一個(gè)由715個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白序列,為疏水性不穩(wěn)定蛋白,無跨膜區(qū),有大量磷酸化作用位點(diǎn),理論等電點(diǎn)為5.76。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),LlARR1定位于細(xì)胞核中。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn),LlARR1以DNA-binding response regulator作為目標(biāo)建模,無規(guī)則卷曲和α螺旋是LlARR1蛋白的主要組成成分。

LlARR1的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn),相對(duì)于S1時(shí)期,LlARR1珠芽S0時(shí)期有較高的表達(dá)水平(圖2),主要集中在葉腋處表達(dá),并且其在莖稈上部葉腋處S0時(shí)期的表達(dá)遠(yuǎn)高于莖稈下部的表達(dá)(圖7),推測(cè)LlARR1在珠芽啟動(dòng)過程中發(fā)揮正調(diào)控因子的作用。該推測(cè)被LlARR1在不同百合品種中的表達(dá)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證,即LlARR1在自然發(fā)生珠芽的百合品種葉腋處有較高的表達(dá)水平。在不同激素處理的卷丹百合中,LlARR1的表達(dá)在S0時(shí)期均被生長(zhǎng)素和赤霉素顯著抑制,由該結(jié)果推測(cè),LlARR1可能在珠芽準(zhǔn)備期發(fā)揮的作用與生長(zhǎng)素和赤霉素相反。而生長(zhǎng)素處理下的卷丹百合在S1時(shí)期與對(duì)照植株相比有顯著上調(diào),由此可以推測(cè)LlARR1可能在S1時(shí)期協(xié)同生長(zhǎng)素并促進(jìn)卷丹珠芽的形成,這與YANG等[29]的結(jié)果相一致(圖9);且譚長(zhǎng)龍等[32]的研究也表明,較低含量的生長(zhǎng)素有利于珠芽魔芋側(cè)葉萌發(fā)。同時(shí)在之后的S3時(shí)期進(jìn)一步與生長(zhǎng)素有協(xié)同,促進(jìn)珠芽的發(fā)育,但外源噴施生長(zhǎng)素是否能增加珠芽的發(fā)生還有待探究。而在赤霉素處理中,LlARR1在后期的發(fā)育過程中均被上調(diào),由此推測(cè)在后期的珠芽發(fā)育過程中其與赤霉素可能協(xié)同發(fā)揮作用。龔明霞等[33]對(duì)山藥進(jìn)行外源噴施赤霉素,發(fā)現(xiàn)其可能抑制珠芽形成,而在本文研究中還不能證明赤霉素的外源施加對(duì)卷丹百合珠芽形成起到正調(diào)控或負(fù)調(diào)控作用,同時(shí)赤霉素是否能夠促進(jìn)卷丹珠芽的發(fā)生發(fā)育還有待探究。

本研究從卷丹葉腋中克隆到細(xì)胞分裂素傳遞通路中的核心轉(zhuǎn)錄因子LlARR1,全長(zhǎng)2 148 bp,編碼715個(gè)氨基酸,為不穩(wěn)定疏水性蛋白,與雜交百合ARR1親緣關(guān)系最近,且在不同植物物種中ARR1氨基酸較為保守。對(duì)其表達(dá)模式分析表明,LlARR1可能參與了卷丹珠芽的發(fā)生和發(fā)育,且在珠芽發(fā)生發(fā)育過程中可能發(fā)揮促進(jìn)作用。但后期仍需對(duì)LlARR1在卷丹珠芽發(fā)生及發(fā)育過程中的功能進(jìn)行驗(yàn)證,從而了解細(xì)胞分裂素在珠芽形成中的作用,以期為珠芽發(fā)生調(diào)控及其分子機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。