逯久幸, 劉燕, 許朵朵, 陳鵬, 李永華, 劉紅利

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林與藝術(shù)學(xué)院,河南 鄭州 450002; 2.河南省優(yōu)質(zhì)花卉蔬菜種苗工程技術(shù)中心,河南 鄭州 450002)

黑殼楠(Linderamegaphylla)屬樟科山胡椒屬,是優(yōu)良的常綠闊葉喬木。據(jù)中國(guó)植物志記載,黑殼楠為中國(guó)特有樹種,主要分布于陜西、甘肅、湖北、湖南、江西、福建、四川、貴州、云南、廣東等。黑殼楠耐陰,原生地主要為山坡、谷地等濕潤(rùn)稍蔭蔽的地方。在北方的園林中,常綠闊葉類樹木極少,能適應(yīng)城市綠地環(huán)境又具有高觀賞價(jià)值的常綠闊葉樹種更為稀缺,所以針對(duì)高觀賞價(jià)值的常綠闊葉類樹種的引種、育種和推廣非常有價(jià)值[1]。黑殼楠樹形優(yōu)美、四季常青、樹干通直、青翠濃郁、抗性強(qiáng)且能分泌殺菌素起到凈化空氣的作用,又因其木材結(jié)構(gòu)致密,紋理美觀也是重要的用材樹種[2]。黑殼楠以其優(yōu)良的特性成為河南地區(qū)常綠闊葉類樹種推廣的重要候選樹種之一。河南伏牛山南坡、桐柏山和大別山等800 m以下的山坡或溝谷是黑殼楠自然分布的最北緣[3]。據(jù)《河南省重點(diǎn)保護(hù)植物名錄》記載,野生的黑殼楠已經(jīng)屬于瀕危植物[4]。前人對(duì)黑殼楠的研究主要集中在分泌物的化學(xué)成分、栽培措施、繁育方法和栽培技術(shù)、群落結(jié)構(gòu)、物種多樣性等方面[5-7],針對(duì)黑殼楠細(xì)胞遺傳學(xué)的研究較少。

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)最早起源于20世紀(jì)80年代,起初是利用放射性元素(同位素)作為標(biāo)記,后來逐漸發(fā)展為以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新型原位雜交技術(shù)。它的原理是將DNA(或RNA)探針用特定的核苷酸分子標(biāo)記,然后將探針雜交到植物組織切片中,再通過熒光染料染色,使特定的核苷酸分子與熒光染料耦聯(lián)進(jìn)而激發(fā)熒光,在顯微鏡下就可以觀測(cè)獲得目標(biāo)DNA(或RNA)分子的定位和相對(duì)含量。植物中重要的管家基因之一就是核糖體基因,它包括5S rDAN和45S rDAN。45S rDNA基因包含18S-5.8S-26S rDNA基因,3者縱向排列在染色體上[8]。因此,可以通過定位其中1個(gè)基因來定位45S rDNA基因在染色體上的分布情況,本研究選用的是18S rDNA基因。這些基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以與核糖體蛋白結(jié)合組成核糖體。核糖體基因多由高度重復(fù)的序列組成,它們?cè)谥参镏懈叨缺Ｊ?并通過串聯(lián)重復(fù)的方式分布在染色體的某個(gè)或多個(gè)部位。利用5S rDAN和18S rDAN探針對(duì)植物染色體進(jìn)行熒光原位雜交,可以定位5S rDNA和18S rDAN在染色體上的位置,進(jìn)而確定植物染色體的倍性和基因組進(jìn)化情況。

染色體是遺傳信息的載體,對(duì)染色體數(shù)目、形態(tài)和分子特征的分析稱為核型分析[9]。遺傳物質(zhì)在細(xì)胞層面上的表型特征反應(yīng)在核型上,能揭示物種在染色體層面上的所有特性,為研究物種起源、演化、親緣關(guān)系、遺傳進(jìn)化等問題提供及其重要的細(xì)胞學(xué)依據(jù)[10]。本研究以端粒重復(fù)序列、5S rDNA和18S rDNA為探針,通過熒光原位雜交的方法對(duì)黑殼楠染色體進(jìn)行了精細(xì)的核型分析,又通過高通量測(cè)序的方法對(duì)黑殼楠基因組進(jìn)行了預(yù)測(cè)。染色體核型分析和基因組預(yù)測(cè)為黑殼楠染色體定位、物種起源等細(xì)胞遺傳學(xué)及表觀遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ),并為進(jìn)一步良種選育等提供重要的細(xì)胞學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自河南省南陽市西峽縣種苗試驗(yàn)站野生黑殼楠種子。種子經(jīng)過3個(gè)月沙藏,取露白的種子播種于穴盤中,待幼苗長(zhǎng)至15 cm時(shí),取生長(zhǎng)旺盛的側(cè)根根尖制片。

1.2 染色體制備

剪取側(cè)根根尖2～3 cm。將剪好的根用蒸餾水沖洗干凈,放入0.5 mL特制離心管中。在離心管中沖入0.9～1.0 MPa的笑氣(N2O),靜置處理2 h。靜置后立即轉(zhuǎn)入冰浴,離心管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)90%預(yù)冷冰乙酸,靜置固定。10 min后取出沖洗,并放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%乙醇中保存。制片時(shí)先用酶液混合液37 ℃酶解1 h,后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%乙醇清洗3次,再用解剖針破碎根尖,震蕩離心棄廢液。再次加入冰乙酸,充分震蕩混勻后,滴入載玻片中央,將染色體標(biāo)本在普通光學(xué)顯微鏡下鏡檢。

1.3 探針制備

端粒探針為末端(TTTAGGG)6探針,5S rDNA和18S rDNA探針分別為標(biāo)記好的pTa794和pTa71質(zhì)粒DNA。

1.4 熒光原位雜交

將制好的根尖玻片加入標(biāo)記好的探針溶液,蓋上蓋玻片,80 ℃熱變性5 min,放入雜交盒中,后放入原位雜交箱,在37 ℃的條件下雜交過夜。室溫清洗玻片2～3次,將玻片吹干。最后加上8 μL DAPI染液,利用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.5 染色體核型分析

染色體核型分析依據(jù)李懋學(xué)等[11]提出的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行,以30個(gè)中期分裂相的細(xì)胞為對(duì)象,統(tǒng)計(jì)黑殼楠植物染色體數(shù)目。選取5個(gè)分散良好、圖片清晰的染色體細(xì)胞,使用Photoshop圖像處理器統(tǒng)計(jì)染色體的長(zhǎng)度數(shù)據(jù)。染色體形態(tài)判斷依據(jù)LEVAN等[12]的方法,核型對(duì)稱性分析依據(jù)STEBBINS[13]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行劃分。

1.6 基因組survey測(cè)序

基因組survey測(cè)序由武漢菲沙基因信息有限公司測(cè)序完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑殼楠染色體的核型分析

通過對(duì)黑殼楠處于細(xì)胞中期分裂相的細(xì)胞進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì),結(jié)果發(fā)現(xiàn),黑殼楠染色體數(shù)目為2n=2X=24,其染色體核型參數(shù)見表1,染色體核型圖見圖1-A,染色體核型模式圖見1-B。對(duì)染色體的長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)測(cè)量發(fā)現(xiàn),染色體組絕對(duì)長(zhǎng)度變異范圍為2.92～5.83,相對(duì)長(zhǎng)度的變化范圍為5.33%～11.11%,相對(duì)長(zhǎng)度組成的最長(zhǎng)染色體與最短染色體的比值為2.09。通過相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)計(jì)算獲得黑殼楠相對(duì)長(zhǎng)度組成(IRL)為2n=6L+6M2+10M1+2S。通過對(duì)長(zhǎng)短臂的分析發(fā)現(xiàn),黑殼楠的臂比變化范圍為1.08～2.16,臂比大于2的染色體數(shù)量百分比為17%,屬于2B型染色體。通過每條染色體臂比的分析最終確定黑殼楠的核型公式為:2n=2X=24=18m(2 SAT)+6sm。其中9號(hào)染色體存在1對(duì)隨體。

紅色信號(hào)為5S rDNA熒光雜交信號(hào)位置,綠色信號(hào)為18S rDNA熒光雜交信號(hào)位置。

表1 黑殼楠染色體核型參數(shù)Table 1 Chromosome karyotype parameters of Lindera megaphylla

從黑殼楠的核型模式圖中發(fā)現(xiàn),黑殼楠染色體組共有12對(duì)染色體,黑殼楠的組成類型為:9對(duì)染色體(1/2/3/5/6/7/8/9/12號(hào)染色體)為中部著絲點(diǎn)染色體(m),3對(duì)染色體(4/10/11號(hào)染色體)為近端部著絲點(diǎn)染色體(sm),通過計(jì)算獲得黑殼楠核型不對(duì)稱系數(shù)(As.K%)為59.49%,染色體整體較為對(duì)稱。

2.2 黑殼楠端粒保守序列、5S rDNA和18S rDNA-FISH的定位分析

為進(jìn)一步確定染色體條數(shù)和5S rDNA和18S rDNA在染色體上的分布,以端粒重復(fù)序列、5S rDNA和18S rDNA為探針與黑殼楠細(xì)胞中期染色體進(jìn)行雜交。端粒保守重復(fù)序列的DAPI染色結(jié)果表明,細(xì)胞染色體數(shù)目為24條,端粒序列位于染色體兩端,未發(fā)現(xiàn)染色體異常的細(xì)胞(圖2-A)。黑殼楠5S rDNA和18S rDNA定位結(jié)果表明,黑殼楠染色體上具有1對(duì)5S rDNA雜交位點(diǎn)(紅色信號(hào))和1對(duì)18S rDNA雜交位點(diǎn)(綠色信號(hào)),4個(gè)染色體信號(hào)均較強(qiáng)(圖2-B)。5S rDNA雜交位點(diǎn)位于第5號(hào)染色體的近中心粒區(qū)域,而18S rDNA雜交位點(diǎn)位于第9號(hào)染色體的短臂近端粒區(qū)域,2對(duì)雜交信號(hào)的位置接近,這也證明黑殼楠為二倍體的結(jié)論,且在9號(hào)染色體短臂存在1對(duì)隨體。

紅色信號(hào)為5S rDNA熒光雜交信號(hào),綠色信號(hào)為18S rDNA熒光雜交信號(hào)。

2.3 黑殼楠的基因組預(yù)測(cè)

基于小片段文庫(kù)的深度測(cè)序,通過K-mer分析,獲取了黑殼楠基因組的基本信息(圖3、表2、表3)。結(jié)果顯示,測(cè)序共獲得50 201 264 Gb的clean data。通過測(cè)序質(zhì)量評(píng)估發(fā)現(xiàn),Q30大于93%,測(cè)序錯(cuò)誤率分布合理,C和G的比例接近,說明測(cè)序質(zhì)量?jī)?yōu),符合進(jìn)一步分析要求。CG含量呈現(xiàn)單峰趨勢(shì)(圖3),NT庫(kù)對(duì)比到黑殼楠的近緣物種DNA上說明取材未有明顯的外源污染(表3)。

圖3 黑殼楠基因組Survey測(cè)序數(shù)據(jù)GC分布圖

表2 黑殼楠基因組Survey測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 2 The genome sequencing data of Lindera megaphylla

表3 質(zhì)控后數(shù)據(jù)NT庫(kù)對(duì)比結(jié)果Table 3 Blast results in NT database of row data

基因組survey結(jié)果顯示,黑殼楠預(yù)估基因組大小為1.38 Gb,測(cè)序深度為30倍,雜合率為0.8%,重復(fù)序列比例為70%。所以黑殼楠為大基因組,雜合率較高,重復(fù)序列多的物種。

3 結(jié)論與討論

不同種源染色體存在多態(tài)性。本研究結(jié)果顯示,南陽西峽的野生黑殼楠的染色體核型為2n=2X=24=18m(2SAT)+6sm,除4/10/11號(hào)染色體為近端部著絲點(diǎn)染色體(sm)外,其他均為中部著絲點(diǎn)染色體(m),9號(hào)染色體短臂端粒處含1對(duì)隨體,未觀測(cè)到異性染色體細(xì)胞。這個(gè)核型結(jié)果與采自都江堰的黑殼楠核型一致,但與采自南充的黑殼楠存在差異[14]。陳成斌等[14]研究發(fā)現(xiàn),采自南充的黑殼楠的染色體核型為2n=18m+6sm+3B,含有3～6個(gè)不等的B染色體細(xì)胞,這種差異的出現(xiàn)可能是由于不同的種源地黑殼楠B染色體存在多態(tài)性。盡管如此,3者染色體核型相同,均屬于2B型染色體。根據(jù)相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)進(jìn)行的染色分類,3者存在一定差異。西峽黑殼楠染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成為2n=6M+6M2+10M1+2S,而南充黑殼楠為2n=6M+4M2+8M1+6S,都江堰黑殼楠為2n=6M+4M2+10M1+4S。這種差異的存在可能是由于染色體制片方法的不同而產(chǎn)生的。本研究采用的是酶解去壁滴片法制片,后2者采用的是卡寶品紅壓片法制片。與傳統(tǒng)的壓片法相比,酶解去壁滴片法呈現(xiàn)的染色更加清晰,染色體形態(tài)也更加優(yōu)質(zhì)。這種方法也廣泛應(yīng)用在向日葵、薔薇、毛竹等物種上,是更利于熒光定位分析的方法[15-21]。另外,在取樣時(shí)間和處理上與3者均不同。可能拍照時(shí)所選擇的細(xì)胞染色體回縮的程度存在差異,從而展現(xiàn)在長(zhǎng)度上就會(huì)不同。另外,后兩者在計(jì)算染色體長(zhǎng)度時(shí)使用的是裁剪法,顯微鏡清晰度較差,精度相對(duì)較低;而前者采用的是軟件繪制,高清晰度顯微攝像,精度較高。雖然3者相對(duì)長(zhǎng)度存在差異,但最終計(jì)算獲得的染色體核型不對(duì)稱系數(shù)卻十分接近,西峽、南充和都江堰黑殼楠分別為59.49%、59.36%和60.35%[14],數(shù)值接近50%為較對(duì)稱染色體,這也標(biāo)志著在樟科的進(jìn)化中,黑殼楠為較為原始的物種。

熒光原位雜交技術(shù)以其快速、穩(wěn)定、特異度高的優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于植物細(xì)胞遺傳學(xué)研究中。它可以用來構(gòu)建物種的物理圖譜,鑒定轉(zhuǎn)基因植株、闡明基因組的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化過程或分析物種親緣關(guān)系[22-25]。rDNA是一種精準(zhǔn)的分子遺傳學(xué)標(biāo)記,常作為探針應(yīng)用于熒光原位雜交中。利用rDNA為標(biāo)記多用于研究植物多拷貝基因的形成和演化、鑒定植物染色體組型、多倍體的起源與非整倍體,還可以研究基因組的進(jìn)化等問題[26-28]。常見的rDNA有5S rDNA和45S rDNA。45S rDNA與核仁相連,伴隨著隨體的出現(xiàn),所以其位點(diǎn)的個(gè)數(shù)也代表了隨體的個(gè)數(shù)[29]。45S rDNA雜交信號(hào)的強(qiáng)度可以間接反應(yīng)基因拷貝數(shù)的多少。5S rDNA標(biāo)記往往用來鑒定植物的倍性情況[30]。本研究發(fā)現(xiàn),黑殼楠在9號(hào)染色體短臂端粒含有1對(duì)45S rDNA強(qiáng)雜交信號(hào),位置相同,強(qiáng)度相近。在5號(hào)染色體含有1對(duì)5S rDNA雜交信號(hào),這也說明黑殼楠45S rDNA在9號(hào)染色體上存在1對(duì)隨體,基因的拷貝數(shù)相近,且染色體未發(fā)生重組、變異或者種內(nèi)雜交等現(xiàn)象,且所檢測(cè)野生黑殼楠為二倍體。

基因組survey是在高通量測(cè)序的基礎(chǔ)上預(yù)測(cè)基因組的手段。對(duì)基因組的大小、雜合度和重復(fù)序列預(yù)測(cè)對(duì)精確的植物基因組測(cè)序有重要的指導(dǎo)意義,這種手段已經(jīng)廣泛應(yīng)用在樟、四合木、西番蓮等多種植物基因組測(cè)序中[31-32]。目前所報(bào)道的植物基因組的大小約為63 Mb～127 Gb[33]。在已報(bào)道的樟科植物中,樟屬樟樹基因組大小為723.12 Mb,牛樟732.7 Mb,樟科山胡椒屬木姜子1.3 Gb,樟科鱷梨屬為2.24～2.46 Gb[34-37]。基因組最大是鱷梨屬植物,最小是樟屬植物。本研究發(fā)現(xiàn),黑殼楠屬山胡椒屬,基因組大小為1.38 Gb,基本與同屬木姜子基因組大小相同,屬較大基因組。黑殼楠基因組的雜合率為0.8%,重復(fù)序列比例為70%。說明其屬于高雜合率和高重復(fù)率的基因組,這也為下一步基因組測(cè)序指明了方向。