董純豪, 李俁佳, 唐建衛(wèi), 鄭繼周, 邱軍, 谷登斌, 王道文,鄭天存,, 殷貴鴻

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,省部共建小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心,國(guó)家小麥工程技術(shù)研究中心,河南 鄭州 450046; 2.河南豐德康種業(yè)股份有限公司,河南 鄭州 454001;3.全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推服務(wù)推廣中心,北京 100125)

小麥葉銹病是由小麥葉銹菌(Pucciniatriticina,Pt)引起的真菌病害,主要侵染小麥的葉片,嚴(yán)重時(shí)可蔓延至小麥莖稈與穗部[1]。小麥葉銹病具有流行性廣、破壞性強(qiáng)、轉(zhuǎn)型寄生和循環(huán)式侵染等特點(diǎn),因此該病害流行迅速,防治不及時(shí)則會(huì)導(dǎo)致大面積爆發(fā),減產(chǎn)幅度一般為5%～20%,大流行年份可達(dá)50%[2-4]。中國(guó)從20世紀(jì)90年代后期至今,共發(fā)生了5次葉銹病大流行,分別在2008、2009、2012、2013和2015年,其中2012年的葉銹病大流行席卷了安徽、甘肅、河南、四川及山西等省份的15 000萬(wàn)hm2麥田,造成近300萬(wàn)t的小麥產(chǎn)量損失[4-5]。盡管中國(guó)通過(guò)“一噴三防”等諸多防控措施對(duì)農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害治理的能力不斷提升,但是由此引發(fā)的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問(wèn)題并不符合農(nóng)業(yè)綠色生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展理念[3]。挖掘抗葉銹病種質(zhì)資源,明確抗病基因在現(xiàn)有品種中的分布,通過(guò)多基因聚合從而科學(xué)開(kāi)展基因布局仍然是抑制小麥葉銹病流行最經(jīng)濟(jì)有效、綠色安全的途徑。

目前已經(jīng)有80個(gè)葉銹病抗性基因從普通小麥及其野生種或近源種中發(fā)掘并正式命名[6-7]。通過(guò)系譜分析、分子標(biāo)記檢測(cè)等方法,已經(jīng)對(duì)這些抗葉銹病基因在國(guó)內(nèi)外小麥品種中的分布有了廣泛研究。朱瑜等[3]通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)40份小麥葉銹病抗性鑒定發(fā)現(xiàn),運(yùn)黑14207等10個(gè)品種含有Lr1,禾美988和百農(nóng)207含有Lr11,漯6073等4個(gè)品種含有Lr37。董娜等[8]對(duì)39份外引小麥種質(zhì)資源開(kāi)展抗葉銹病基因檢測(cè)及抗性鑒定,發(fā)現(xiàn)抗葉銹病基因Lr1、Lr10、Lr20、Lr24、Lr26、Lr34、Lr37和Lr38在引進(jìn)小麥種質(zhì)中均有分布,且攜帶Lr24和Lr38的種質(zhì)抗性良好。段振盈等[1]從石新828、百農(nóng)3217、濟(jì)南2號(hào)、泰山1號(hào)等小麥品種中檢測(cè)到Lr1、Lr26、Lr34、Lr37、Lr46等5個(gè)抗葉銹病基因。閆曉翠等[9]對(duì)30個(gè)小麥品種抗葉銹基因分析發(fā)現(xiàn),鄂恩5號(hào)攜帶Lr26和Lr1,貴農(nóng)16攜帶Lr26和Lr13。

周8425B是六倍體小黑麥廣麥74與普通小麥通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交、大群體回交、輻射誘變、階梯雜交改良及快速加代等技術(shù),創(chuàng)制出的重要小麥骨干親本[10]。周8425B自1988年創(chuàng)制成功以來(lái)便以其抗病抗逆、矮稈大穗的突出特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用,截至2023年07月,在豫、皖、蘇、陜、魯、冀、京、甘、鄂、貴、晉、川、滬13個(gè)省份330家單位育成通過(guò)國(guó)審和省審小麥新品種839個(gè)(86個(gè)跨區(qū)審定的品種不再重復(fù)計(jì)算),為保障國(guó)家糧食安全和農(nóng)民增產(chǎn)增收做出了重要貢獻(xiàn)[10-11]。周8425B對(duì)小麥條銹病和葉銹病等均有優(yōu)異的抗性表現(xiàn),從周8425B及其衍生品種周麥22中挖掘到2個(gè)抗葉銹病基因LrZH84[12-13]和LrZH22/Lr13[13-14],周麥22中的抗葉銹病基因LrZH22/Lr13來(lái)源于周8425B[15-16],其中LrZH84表現(xiàn)全生育期抗性,而LrZH22/Lr13既表現(xiàn)出苗期抗性,又表現(xiàn)成株期抗性。然而,在眾多周8425B的衍生品種中,LrZH84和LrZH22/Lr13的基因分布情況并不清楚。本研究對(duì)周8425B及其207份衍生品種進(jìn)行了葉銹病苗期抗性鑒定和分子標(biāo)記檢測(cè),以期掌握LrZH84和LrZH22/Lr13在衍生品種中的分布情況和遺傳規(guī)律,為小麥抗葉銹病育種和抗葉銹病新基因挖掘提供新的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為KKSQ、TKTS、TKGQ小麥葉銹病流行菌株,均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)李在峰教授提供,葉銹菌生理小種依據(jù)LONG等[17]提出的葉銹菌密碼命名系統(tǒng)進(jìn)行命名。供試材料為骨干親本周8425B及其衍生品種207份,感病對(duì)照品種鄭州5389和成株慢銹對(duì)照品種SAAR由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)李在峰教授饋贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苗期抗性鑒定 將骨干親本周8425B、抗病對(duì)照SAAR、感病對(duì)照鄭州5398及207份供試材料種植于穴盤(pán)(7 cm × 7 cm × 5 cm)中,每個(gè)穴盤(pán)均勻種植4棵麥苗,置于溫室中培養(yǎng)(25 ℃, 光照/黑暗=16 h / 8 h),當(dāng)小麥第1片葉完全展開(kāi)時(shí),采用掃抹法[18]將KKSQ、TKTS、TKGQ葉銹菌生理小種分別接種,并置于90%～100%濕度的黑暗環(huán)境中過(guò)夜(16 h),之后在溫室中繼續(xù)培養(yǎng)(25 ℃),待感病對(duì)照鄭州5398充分發(fā)病后,依據(jù)ROEFS等[19]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗葉銹病鑒定進(jìn)行侵染型調(diào)查,其中0～2級(jí)代表抗葉銹病,3～4級(jí)代表感葉銹病,“+”代表比正常狀態(tài)下孢子堆偏大,病害等級(jí)表現(xiàn)較高,“-”代表比正常狀態(tài)下孢子堆偏小,病害等級(jí)表現(xiàn)較低(表1)。

表1 小麥葉銹病侵染型Table 1 Infection types of leaf rust in wheat

1.2.2 抗葉銹病基因分子標(biāo)記檢測(cè) 利用CTAB法[20]提取供試材料的DNA,并用NanoDrop2000檢測(cè)DNA的純度和濃度,稀釋至50～60 mg·L-1的工作液用以抗葉銹病基因分子標(biāo)記檢測(cè)(表2)。PCR反應(yīng)體系為10 μL:待測(cè)小麥葉片的基因組DNA 1 μL、2×PCR Mix 5 μL、引物F/R(10 μmol·μL-1)各1 μL、ddH2O 2 μL。HBAU標(biāo)記是針對(duì)LrZH22/Lr13基因開(kāi)發(fā)的CAPS功能標(biāo)記,酶切體系和反應(yīng)條件為:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL、限制性內(nèi)切酶HindⅢ 1 μL、10×Buffer 1 μL和ddH2O 3 μL,于37 ℃酶切30 min。Hbsf-1標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物和HBAU標(biāo)記酶切產(chǎn)物均使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

表2 抗葉銹病基因分子標(biāo)記引物序列Table 2 Sequence of molecular markers primers for leaf rust resistance genes

2 結(jié)果與分析

2.1 葉銹病抗性鑒定結(jié)果

苗期葉銹病接種鑒定結(jié)果(表3)顯示,骨干親本周8425B對(duì)KKSQ、TKTS、TKGQ葉銹菌生理小種均表現(xiàn)中抗水平,其207份衍生品種對(duì)KKSQ、TKTS、TKGQ生理小種表現(xiàn)中抗及以上水平的材料分別有57、73、64份,對(duì)3個(gè)生理小種均表現(xiàn)中抗及以上水平的材料有42份,所占比例為20.3%;5個(gè)子1代品種中周麥11對(duì)鑒定的3個(gè)生理小種表現(xiàn)中抗,周麥12和周麥13對(duì)TKTS生理小種表現(xiàn)中抗,周麥16對(duì)KKSQ生理小種表現(xiàn)中抗;68個(gè)子2代品種對(duì)鑒定的3個(gè)生理小種表現(xiàn)中抗的材料分別有20、21、21份;113個(gè)子3代品種對(duì)鑒定的3個(gè)生理小種表現(xiàn)中抗的材料分別有23、38、33份;21個(gè)子4代品種對(duì)鑒定的3個(gè)生理小種表現(xiàn)中抗的材料分別有6、11、9份。

表3 周8425B及其207個(gè)衍生系的品種信息、葉銹病抗性基因檢測(cè)及對(duì)3個(gè)葉銹菌生理小種苗期抗性鑒定結(jié)果Table 3 Cultivar variety information, results of molecular marker detection and identification of resistance to 3 pathotypes of Puccinia triticina at seedling stage

2.2 分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)LrZH84和LrZH22/Lr13葉銹病抗性基因連鎖標(biāo)記或功能標(biāo)記的檢測(cè)(表3),發(fā)現(xiàn)周8425B的207份衍生品種中周麥13、周麥16、淮川101、淮麥28等31份材料僅攜帶LrZH84基因,其中對(duì)鑒定的3個(gè)生理小種表現(xiàn)中抗水平的分別有8、10、8份,所占比例分別為25.8%、32.3%、25.8%;禾豐3號(hào)、機(jī)麥211、西農(nóng)805、鄭麥7698等46份材料僅攜帶LrZH22/Lr13基因,其中對(duì)鑒定的3個(gè)生理小種表現(xiàn)中抗水平的分別有21、31、25份,所占比例分別為45.7%、67.4%、54.3%;周麥11、周麥12、丹麥118、洛麥22等14份材料同時(shí)攜帶LrZH84和LrZH22/Lr13抗病基因,其中對(duì)鑒定的3個(gè)生理小種表現(xiàn)中抗水平的分別有9、11、11份,所占比例分別為64.2%、78.6%、78.6%;鄧麥996、保麥5號(hào)、才智16號(hào)、泛麥5號(hào)等116份材料均不攜帶LrZH84和LrZH22/Lr13抗病基因,其中對(duì)鑒定的3個(gè)生理小種表現(xiàn)中抗水平的分別有19、21、20份,所占比例分別為16.4%、18.1%、17.2%。盡管在衍生品種中泛麥803、華育166、存麥20、賽德麥5號(hào)等10個(gè)小麥品種不含LrZH84和LrZH22/Lr13抗病基因,但是仍然對(duì)KKSQ、TKTS、TKGQ生理小種均表現(xiàn)中抗水平,可能其含有其他抗葉銹病基因,有待進(jìn)一步檢測(cè)與挖掘。

本研究中檢測(cè)的周8425B衍生品種中,周麥22同時(shí)攜帶LrZH84和LrZH22/Lr13抗病基因,以周麥22為親本衍生出48個(gè)小麥品種。其中,同時(shí)攜帶LrZH84和LrZH22/Lr13抗病基因的材料有3份,僅攜帶LrZH84或LrZH22/Lr13抗病基因的材料分別有3和25份,對(duì)KKSQ、TKTS、TKGQ生理小種均表現(xiàn)中抗及以上水平的材料有16份,所占比例為33.3%。矮抗58不攜帶LrZH84和LrZH22/Lr13抗病基因,以矮抗58為親本衍生出了64個(gè)小麥品種。其中,只有周麥36號(hào)小麥品種同時(shí)攜帶LrZH84和LrZH22/Lr13抗病基因,僅攜帶LrZH84或LrZH22/Lr13抗病基因的材料分別有7份和9份,對(duì)KKSQ、TKTS、TKGQ生理小種均表現(xiàn)中抗及以上水平的材料有6份,所占比例為9.4%。周麥22衍生品種中攜帶LrZH84和LrZH22/Lr13抗病基因的比例高于矮抗58的衍生品種,并且周麥22衍生品種對(duì)檢測(cè)的3個(gè)生理小種表現(xiàn)中抗及以上抗性的比例也高于矮抗58的衍生品種。

3 結(jié)論與討論

本研究檢測(cè)的207份周8425B衍生品種中對(duì)KKSQ、TKTS、TKGQ強(qiáng)毒力優(yōu)勢(shì)葉銹菌生理小種均表現(xiàn)中抗及以上水平的材料僅有42份,所占比例為20.3%,可能是由于其中河南省審定的小麥品種偏多,小麥葉銹病發(fā)病區(qū)域主要集中在南陽(yáng)、信陽(yáng)、駐馬店、周口、許昌等豫中南地區(qū),豫北地區(qū)發(fā)病偏輕,對(duì)葉銹病抗性的選擇壓力偏弱,然而,隨著農(nóng)業(yè)機(jī)械化程度顯著提高,收獲時(shí)籽粒田間損失率較多,造成小麥實(shí)生苗基數(shù)很大,為葉銹病完成侵染循環(huán)提供更多的寄主,田間葉銹菌源量增多,同時(shí)由于全球氣候變化,造成暖冬年份增多,以及降水帶北移導(dǎo)致的雨水偏多等原因,河南省小麥葉銹病流行的風(fēng)險(xiǎn)在不斷提高,因此急需重視抗葉銹病小麥新品種的選育工作。

從葉銹病苗期抗性效應(yīng)來(lái)看,在檢測(cè)的LrZH84和LrZH22/Lr13中,均不攜帶該基因的材料對(duì)葉銹病達(dá)到中抗水平的比例最低,僅攜帶LrZH22/Lr13的材料對(duì)葉銹病達(dá)到中抗水平的比例高于僅攜帶LrZH84抗性基因的比例,說(shuō)明LrZH22/Lr13基因的抗性效應(yīng)優(yōu)于LrZH84,同時(shí)攜帶LrZH84和LrZH22/Lr13的材料對(duì)葉銹病達(dá)到中抗水平的比例最高,綜合表現(xiàn)為L(zhǎng)rZH84+LrZH22/Lr13基因組合的抗病效應(yīng)優(yōu)于LrZH22/Lr13和LrZH84。

從周麥22、矮抗58及其衍生品種中的LrZH84、LrZH22/Lr13基因的分布情況來(lái)看,盡管矮抗58并不攜帶以上基因,由于對(duì)手親本可能攜帶LrZH84、LrZH22/Lr13抗病基因,因此其衍生后代中也出現(xiàn)了攜帶該抗病基因的品種,但是矮抗58衍生品種中攜帶LrZH84、LrZH22/Lr13基因的比例較周麥22的衍生品種少。由此可見(jiàn),親本材料攜帶的抗病基因數(shù)量對(duì)其后代中抗病基因的聚合以及抗性表現(xiàn)均有較大的影響。因此,在今后的育種工作中,應(yīng)重視親本材料的遺傳多樣性,加強(qiáng)不同抗性基因的聚合,培育具有持久抗性的小麥新品種從而抑制小麥葉銹病的流行,為保障國(guó)家糧食安全提供品種支持。