邵允 張蒙蒙 陳云 王曉菲 董康 劉寧 張郎郎 譚彬 王偉 程鈞 馮建燦

摘? ? 要：【目的】乙烯合成及果肉褪綠是桃果實(shí)成熟過程中相伴出現(xiàn)的兩個(gè)生理事件。STAY-GREEN（SGR）是參與植物葉片和果實(shí)褪綠的重要基因。然而，桃SGR基因在果實(shí)成熟及褪綠過程中的功能尚不清晰，旨在初步探究PpSGR基因在桃果實(shí)成熟及褪綠過程中的功能。【方法】以秋蜜紅為試驗(yàn)材料，對(duì)PpSGR基因進(jìn)行克隆，對(duì)PpSGR的核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行分析，對(duì)不同發(fā)育時(shí)期桃果肉中PpSGR的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，并對(duì)PpSGR基因調(diào)控葉綠素降解及乙烯合成的功能進(jìn)行研究?！窘Y(jié)果】PpSGR編碼區(qū)全長為831 bp；該基因編碼的蛋白序列含有1個(gè)高度保守的SGR域。PpSGR基因的表達(dá)水平隨著果肉逐漸褪綠呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。瞬時(shí)過表達(dá)PpSGR基因后，桃葉片顏色明顯褪綠，并且在300 mmol·L-1 NaCl的鹽脅迫下，過表達(dá)PpSGR的葉片褪綠更加明顯。此外，過表達(dá)PpSGR后，桃苗乙烯合成的限速基因PpACS1、PpACS4及PpACS6均表達(dá)上調(diào)，且內(nèi)源乙烯釋放量顯著增多?！窘Y(jié)論】對(duì)PpSGR的基因功能進(jìn)行鑒定和研究，并分析了其對(duì)乙烯的調(diào)控作用，為進(jìn)一步解析桃果實(shí)成熟及果肉褪綠提供了新的思路，也為不同成熟期桃品種的選育提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：桃；STAY-GREEN （SGR）；褪綠基因；葉綠素降解；乙烯

中圖分類號(hào)：S662.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2023）12-2513-11

收稿日期：2023-07-28 接受日期：2023-11-02

基金項(xiàng)目：河南省杰出外籍科學(xué)家工作室（GZS2020007）；國家河南省聯(lián)合項(xiàng)目（U1804114）

作者簡介：邵允，女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)楣麡浞肿由飳W(xué)。E-mail：15937171226@163.com

*通信作者 Author for correspondence. E-mail：jcheng2007@163.com；E-mail：jcfeng@henau.edu.cn

Function identification of PpSGR gene and its regulation of ethylene synthesis in peach

SHAO Yun， ZHANG Mengmeng， CHEN Yun， WANG Xiaofei， DONG Kang， LIU Ning， ZHANG Langlang， TAN Bin， WANG Wei， CHENG Jun*， FENG Jiancan*

（College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： 【Objective】 Ethylene synthesis and disappearance of peel green color are two physiological events associated with fruit ripening of peach. STAY-GREEN （SGR） is a crucial gene that promotes disappearance of leaf and fruit green color in the plant kingdom. In various plant species， SGR genes exhibit similar functions in regulating chlorophyll. Peach （Prunus persica） is a significant fruit globally. However， the function of the PpSGR gene in the peach genome has not been identified， and its potential impact on green color disappearance and ripening of peach fruit remains unclear. This study aims to identify the SGR gene in the peach genome， analyze the expression level of the PpSGR gene in different fruit maturity stages， and preliminarily investigate the function of the PpSGR gene. 【Methods】The nucleotide sequences of the PpSGR gene were cloned from the Qiumihong cultivar. Bioinformatics analysis was conducted to analyze the gene structure of PpSGR in peach， the secondary and tertiary structure of the PpSGR protein was predict， the amino acid sequences of SGR in different species were compared， and a phylogenetic tree was constructed. Subsequently， the transcriptional level of the PpSGR gene in peach fruits at different maturity stages was analyzed using Quantitative Real-time PCR （qRT-PCR）. The function of the PpSGR gene in chlorophyll degradation was preliminarily verified by transient overexpression in peach seedlings. Numerous studies have reported that the SGR gene can promote chlorophyll degradation under salt stress， leading to leaf yellowing. To verify the function of SGR under salt stress， the Fv/Fm values were measured and analyzed using a chlorophyll fluorescence analyzer after dark treatment of the whole peach seedlings transiently infected with the PpSGR gene. Additionally， there is evidence suggesting that ethylene can promote the expression of the SGR gene， but whether the SGR gene has a direct effect on ethylene synthesis remains to be studied. Therefore， we measured ethylene production and the transcriptional level of PpACSs genes involved in ethylene synthesis in the peach seedlings transiently overexpressing the PpSGR gene. 【Results】 The results of the bioinformatics analysis revealed that the length of the PpSGR gene sequencewas 1115 bp， consisting of 4 exons and 3 introns. The coding region of PpSGR spanned a total length of 831 bp， encoding 277 amino acids. Comparative analysis of SGR proteins from different species demonstrated that the PpSGR protein shared high homology with SGR proteins from other species. The middle region of the SGR protein contained a highly conserved SGR domain， while the N-terminal region contained a conserved chloroplast transit peptide. The C-terminal region of the SGR protein exhibited variability across different species. The amino acid sequence similarities between PpSGR and MdSGR， FvSGR or CsSGR were found to be 77.63%， 69.83% and 63.05%， respectively. A phylogenetic tree was constructed using amino acid sequences of SGR proteins from 13 different plant species， revealing that the PpSGR protein from peach was closely related to apples and strawberries， which belonged to the same Rosaceae family. The predicted tertiary structure of the PpSGR protein consisted mainly of α-helices and random graph curls， which was consistent with the predicted secondary structure. qRT-PCR results indicated that the transcription level of the PpSGR gene was lower during the early stage of peach fruit development when the flesh was still green. As the fruit matured gradually， the flesh turned green， and the expression level of PpSGR increased continuously. At 120 days after the full-bloom stage， the expression of PpSGR increased rapidly， reaching a level of 16 times higher than that at 80 days after the full-bloom stage， with the highest expression observed at 180 days after the full-bloom stage. This suggested that the expression level of the PpSGR gene gradually increased with the decolorization of peach fruit. Phenotypic analysis of PpSGR transgenic plants revealed that the leaves of transient PpSGR plants were light green， whereas the control plants had dark green leaves. This suggested that transient overexpression of the PpSGR gene led to chlorosis in peach seedlings. Under salt stress conditions （300 mmol·L-1 NaCl）， the leaves of peach plants transiently overexpressing PpSGR exhibited a slower rate of yellowing， compared to control plants. The Fv/Fm value of the leaves in PpSGR-overexpressing plants was significantly lower than that of the control plants， indicating that the PpSGR gene may play an important role in leaf yellowing induced by the abiotic stress. Furthermore， the expression levels of genes involved in ethylene production were analyzed in peach seedlings transiently overexpressing PpSGR. The results demonstrated that the ethylene synthesis genes PpACS1， PpACS4 and PpACS6 were significantly induced and up-regulated in these seedlings. The expression of PpACS1 in peach seedlings with PpSGR overexpression was more than 32 times higher than that in control seedlings. Additionally， the ethylene production of peach seedlings with PpSGR overexpression showed a gradual increase. 【Conclusion】 Based on the aforementioned findings， it can be concluded that the PpSGR gene plays a role in promoting chlorosis in peach leaves. Moreover， our preliminary analysis suggests that PpSGR may enhance the function of ethylene synthesis in peach seedlings. This finding holds great significance for understanding the molecular mechanism of SGR in regulating ethylene synthesis. Additionally， it also provides some theoretical references for SGR gene function research， peach fruit ripening and post-harvest preservation.

Key words： Peach; STAY-GREEN （SGR）; Degreening gene; Chlorophyll degradation; Ethylene

葉綠素降解是葉片衰老、果實(shí)成熟進(jìn)程中發(fā)生的一系列重要的生化反應(yīng)，由6種葉綠素代謝酶（chlorophyll catabolic enzymes，CCE）共同催化完成[1]。除了這6種CCE之外，STAY GREEN（SGR）在葉綠素降解過程中也發(fā)揮著非常重要的作用。SGR可以和6個(gè)CCE、光系統(tǒng)Ⅱ形成動(dòng)態(tài)的蛋白復(fù)合體，從而形成葉綠素代謝通道，最大程度上減少代謝中間產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒害。有研究表明，SGR既不具有CCE活性，也不能直接結(jié)合葉綠素，這表明SGR可能不是一種直接參與葉綠素代謝的酶[2]。SGR參與葉綠素降解的功能在大豆[3]、水稻[4]、柑橘[5]、擬南芥[6]、甘藍(lán)型油菜[7]等多個(gè)物種中都得到了驗(yàn)證。例如，Wang等[3]對(duì)大豆顏色變化的研究表明，GmSGR在控制種子黃化方面具有重要作用；Peng等[4]研究發(fā)現(xiàn)，敲除水稻OsSGR后植株能保持綠色；Zhu等[5]研究顯示，CsSGRa能使煙草葉片中葉綠素含量顯著降低，而突變CsSGRa后，棕橙果實(shí)和葉片中葉綠素的降解受到抑制，葉綠素含量顯著增加。同樣，在擬南芥中，AtSGR1被報(bào)道具有誘導(dǎo)葉綠素和葉綠素結(jié)合蛋白降解的作用，AtSGR1過表達(dá)后誘導(dǎo)擬南芥葉片逐漸褪綠[8]。此外，在番茄、辣椒、香蕉等植物中，發(fā)現(xiàn)SGR1同源基因突變后可延緩葉綠素的降解速度[9-12]。SGR基因具有響應(yīng)非生物脅迫的功能，在鹽脅迫下會(huì)表現(xiàn)出早期衰老和葉片褪綠速度加快的現(xiàn)象，而sgr突變體在非生物脅迫條件下表現(xiàn)出不褪綠的現(xiàn)象[9-10，13]。許多研究表明，在植物發(fā)育和衰老過程中葉綠素的分解代謝受到遺傳程序的高度調(diào)控，因此，在非生物脅迫下對(duì)SGR的基因功能進(jìn)行研究，對(duì)進(jìn)一步闡明葉綠素降解的未知調(diào)節(jié)機(jī)制也具有重要作用。

不同物種中SGR基因在調(diào)控葉綠素方面表現(xiàn)出的類似現(xiàn)象，可能是由于不同物種中SGR蛋白結(jié)構(gòu)較為保守（在其N-端含有一個(gè)葉綠體的信號(hào)肽，C端存在一個(gè)多變區(qū)域，兩者之間存在一個(gè)高度保守的SGR保守域，且在C端多變區(qū)域中含有一個(gè)保守的富含半胱氨酸的基序）。

桃（Prunus persica）是廣受消費(fèi)者喜愛的重要水果之一。PpSGR基因在桃中的功能尚未鑒定，其對(duì)桃果實(shí)成熟可能存在的影響也未得到深入研究。筆者在本研究中對(duì)其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并對(duì)PpSGR的基因功能進(jìn)行鑒定和研究，這對(duì)桃成熟及采后保鮮等方面的研究具有一定的啟發(fā)意義，也為進(jìn)一步研究PpSGR基因在桃中的生物學(xué)功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以新疆毛桃實(shí)生苗為試驗(yàn)材料。將毛桃種子置于4 ℃低溫貯存1個(gè)月，溫水浸種后去除1/3種皮進(jìn)行催芽5～7 d，將種胚單獨(dú)種植在營養(yǎng)缽中，放置于溫度為25 ℃、光周期為長日照條件（16 h光照/8 h黑暗）、光照為白光（140 μmol·m-2·s-1）的溫室培養(yǎng)至幼苗，待試驗(yàn)使用[14]。

1.2 桃PpSGR過表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

根據(jù)PpSGR目的基因編碼區(qū)（CDS）的全長序列，結(jié)合pSAK277載體上的EcoRⅠ和XhoⅠ為酶切位點(diǎn)，進(jìn)行同源重組引物的設(shè)計(jì)，由上海生工公司進(jìn)行引物的合成。以秋蜜紅莖尖的cDNA為模板，利用合成的全長引物（pSAK277-PpSGR-F：AAAGAATTCGGTACCATGGGTACTTTGACTGCTGCTTC；pSAK277-PpSGR-R：TTTGTAATCCTCGAGGTTTGTTTCTTGGGTTTGGC）擴(kuò)出PpSGR目的基因CDS區(qū)的全長序列，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對(duì)空載體進(jìn)行雙酶切以獲得線性化載體，于水浴鍋中37 ℃酶切2～3 h。待PCR擴(kuò)增反應(yīng)及酶切反應(yīng)結(jié)束后，用200 V的電壓，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下帶有目的基因條帶的凝膠，利用DNA凝膠回收試劑盒（莊盟生物）進(jìn)行目的DNA片段的回收及純化，將所得到的DNA溶液進(jìn)行濃度及質(zhì)量檢測后用于后續(xù)的載體連接或置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。利用SE無縫克隆和組裝試劑盒SE Seamless Cloning and Assembly Kit（ZC231，北京莊盟生物）對(duì)PpSGR基因的純化產(chǎn)物與線性化載體進(jìn)行重組連接反應(yīng)，以構(gòu)建35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pSAK277-PpSGR的過表達(dá)載體。步驟為：在冰上進(jìn)行無縫克隆的連接反應(yīng)體系的配制，輕輕將其混勻后，放于PCR儀上，37 ℃條件下反應(yīng)30 min。

將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒使用凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101中，利用真空滲透的方法瞬時(shí)侵染桃幼苗。

1.3 葉片顏色觀察及葉綠素含量分析

將GV3101：：SAK277-PpSGR基因侵染桃苗后，對(duì)整株植物進(jìn)行黑暗處理，黑暗孵育后對(duì)葉片進(jìn)行取樣，使用葉綠素?zé)晒夥治鰞x（捷克PSI Flu）進(jìn)行分析。如前所述[15]進(jìn)行鹽脅迫分析，將3周齡植物的離體葉片背面朝上漂浮在300 mmol·L-1 NaCl的3 mmol·L-1 MES 緩沖液（pH 5.8）中孵育數(shù)天。

1.4 總RNA的提取、cDNA的合成和實(shí)時(shí)定量PCR

提取轉(zhuǎn)PpSGR基因秋蜜紅桃的葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR鑒定乙烯合成相關(guān)基因PpACS1、PpACS4、PpACS5和PpACS6的表達(dá)水平。利用SPSS Statistics 22對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行作圖。按照DNase Ⅰ（TaKaRa，Dalian，China）試劑盒步驟除去基因組DNA污染。根據(jù)SYBR? Primescript miRNA RT-PCR Kit（TaKaRa，Dalian，China）試劑盒說明書進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。定量RT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，含有1 × ROX參比染料，10 μL 2 × SYBR預(yù)混物Ex Taq Ⅱ（TaKaRa），每個(gè)引物濃度0.4 μmol·L-1，模板cDNA 100 ng。所有分析均采用3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，qPCR所用引物見表1。

1.5 葉綠素含量的測定

稱取0.3 g左右的桃葉片放入干凈無水的研缽內(nèi)，加入少量的碳酸鈣粉末和3 mL 95%乙醇，使用干凈的研磨棒進(jìn)行充分研磨，再向其中加入10 mL 95%乙醇，繼續(xù)研磨至組織變白，放置在避光條件下，靜置5 min后，使用濾紙將研磨液過濾至25 mL的棕色容量瓶中，并用少量的95%乙醇沖洗濾紙定容至25 mL。以95%乙醇作為空白對(duì)照，分別在波長665 nm、649 nm下測定提取液的吸光度[16-17]。

根據(jù)以下公式計(jì)算葉綠素含量：

C葉綠素a/（mg·L-1）=13.95×A665-6.88×A649；

C葉綠素b/（mg·L-1）=24.96×A649-7.32×A665；

w（葉綠素a）/（mg·g-1）=C葉綠素a×V×N/W×0.001；

w（葉綠素b）/（mg·g-1）=C葉綠素b×V×N/W×0.001；

w（總?cè)~綠素）/（mg·g-1）=w（葉綠素a）+w（葉綠素b）。

式中，V為提取液體積，N為稀釋倍數(shù)，W為鮮質(zhì)量（g）。

1.6 乙烯釋放量的測定

取處理后生長良好的桃幼苗5 g；將上述材料分別放入100 mL 色譜瓶中，使用氣相色譜分析儀（島津GC-2010 Plus）進(jìn)行乙烯測定，每個(gè)處理3次重復(fù)。色譜條件：WBI為110 ℃，柱溫 50 ℃，F(xiàn)ID為200 ℃，氫氣流速為50 mL·min-1，進(jìn)樣量：1000 μL，運(yùn)行時(shí)間5 min。

乙烯釋放量/（ng·kg-1·s-1）=[乙烯質(zhì)量濃度（ng·mL-1）×容器體積（mL）]/[樣品質(zhì)量（g）×密封時(shí)間（s）]。

1.7 生物信息學(xué)分析

利用Phytozome網(wǎng)站（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）獲得PpSGR和PpSGRL序列信息，同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)下載其他物種中的同源序列。通過DNAMAN獲得不同物種中SGR氨基酸序列比對(duì)圖，并結(jié)合MEGA 7.0的Clustal W進(jìn)行聚類分析。使用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）在線分析，對(duì)PpSGR蛋白的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨基酸數(shù)目、氨基酸組分、脂肪指數(shù)、親水性等進(jìn)行分析。用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/）在線軟件對(duì)PpSGR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；使用Phyre2軟件對(duì)PpSGR蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PpSGR基因的序列特征

PpSGR基因組序列全長1115 bp，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。編碼區(qū)全長831 bp，編碼277個(gè)氨基酸。通過Protparam進(jìn)行預(yù)測，等電點(diǎn)pI為8.05，屬于堿性蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為31.18 ku。由20種氨基酸組成，帶負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)量為30，帶正電荷氨基酸殘基數(shù)量為32；不穩(wěn)定系數(shù)為47.54，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為77.04，總平均親水性為-0.386，屬親水蛋白（+值為疏水蛋白，-值為親水蛋白）。

不同物種SGR氨基酸序列比對(duì)的結(jié)果顯示，PpSGR蛋白與其他物種中SGR蛋白具有較高的同源率，且都含有保守的SGR保守域（SGR domain），N端的葉綠體信號(hào)肽（chloroplast transit peptide）和C端多變區(qū)域（variable C-terminal region）（圖1）。其中PpSGR與蘋果MdSGR蛋白的同源率最高，為77.89%，與草莓FvSGR蛋白的同源率為70.41%，與柑橘CsSGR蛋白和楊樹PtSGR蛋白的同源率為64.29%，系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果顯示，桃PpSGR蛋白與同屬薔薇科的蘋果、草莓的親緣關(guān)系最近（圖2）。

對(duì)PpSGR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，蛋白質(zhì)的多肽鏈通過折疊、螺旋和卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)形成比較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，利用Sopma網(wǎng)站分析桃PpSGR的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3-A），發(fā)現(xiàn)多個(gè)氨基酸參與α-螺旋、無規(guī)則卷曲和延伸鏈等二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，其中α-螺旋占比27.44%、延伸鏈占比12.64%、無規(guī)則卷曲占比57.04%（表2）。采用在線軟件Phyre2對(duì)PpSGR蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測的結(jié)果（圖3-B）顯示，PpSGR蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則圖卷曲構(gòu)成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

2.2 PpSGR在不同發(fā)育時(shí)期桃果實(shí)中的表達(dá)分析

葉綠素降解主要發(fā)生在果實(shí)成熟及葉片衰老的過程中。因此，筆者選用花后20 d、50 d、80 d、120 d、160 d、180 d，共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的桃果實(shí)，進(jìn)行PpSGR轉(zhuǎn)錄水平分析。qRT-PCR分析的結(jié)果（圖4）顯示，在果實(shí)發(fā)育的前期果肉呈現(xiàn)明顯綠色時(shí)，PpSGR轉(zhuǎn)錄水平較低。隨著果實(shí)逐步成熟，果肉褪綠，表達(dá)量不斷升高。在花后120 d，PpSGR的表達(dá)量快速上升，達(dá)到花后80 d的16倍，并在180 d達(dá)到最高?；谝陨辖Y(jié)果，推測PpSGR基因可能是調(diào)控桃果實(shí)褪綠的重要基因。

2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)化桃幼苗驗(yàn)證PpSGR的功能

為了驗(yàn)證PpSGR基因的功能，利用桃實(shí)生幼苗瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法對(duì)PpSGR基因的功能進(jìn)行初步的驗(yàn)證。半定量結(jié)果顯示，瞬時(shí)過表達(dá)的材料中PpSGR的轉(zhuǎn)錄水平明顯上升（圖5-A）。為進(jìn)一步確認(rèn)PpSGR瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的效果，隨機(jī)選取7個(gè)單株，分別進(jìn)行定量檢測。結(jié)果顯示，在每一個(gè)單株中都實(shí)現(xiàn)了PpSGR的過表達(dá)（圖5-B）。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株表型分析，發(fā)現(xiàn)瞬轉(zhuǎn)PpSGR植株葉片顏色呈現(xiàn)淡綠色，而對(duì)照植株呈現(xiàn)深綠色（圖6-A），PpSGR植株葉片葉綠素含量較低而對(duì)照植株葉片葉綠素含量較高（圖6-B）。上述結(jié)果表明，PpSGR具有促進(jìn)葉綠素降解，進(jìn)而導(dǎo)致桃葉片褪綠的功能。

2.4 鹽脅迫下PpSGR促進(jìn)葉片黃化

有研究表明，過表達(dá)SGR基因的植物植株葉片在非生物脅迫條件下會(huì)表現(xiàn)出早期衰老葉片褪綠的現(xiàn)象[9-10]。筆者在本研究中的結(jié)果顯示，在300 mmol·L-1 NaCl的鹽脅迫條件下，與空載相比，轉(zhuǎn)PpSGR基因的桃葉片在鹽處理5 d后出現(xiàn)明顯的黃化表型（圖7-A），且轉(zhuǎn)PpSGR的桃葉片隨著脅迫處理時(shí)間的延長，PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm值）顯著降低（圖7-B）。

2.5 PpSGR基因?qū)σ蚁┽尫帕康挠绊?/p>

乙烯是促進(jìn)果實(shí)成熟、葉片衰老的重要內(nèi)源激素。因此，推測瞬轉(zhuǎn)PpSGR促進(jìn)桃葉片褪綠的過程可能會(huì)對(duì)乙烯合成產(chǎn)生影響。乙烯合成酶（ACS）是乙烯合成途徑中的關(guān)鍵酶，ACS基因家族是乙烯合成途徑中的重要基因家族，它們編碼乙烯合成酶，參與乙烯的生物合成。前人研究顯示桃中共有6個(gè)ACS基因[18-19]。筆者在本研究中對(duì)轉(zhuǎn)PpSGR桃幼苗中乙烯合成相關(guān)基因進(jìn)行了定量分析。半定量和定量結(jié)果（圖8）顯示，除了ACS2和ACS3未檢出轉(zhuǎn)錄水平外，乙烯合成基因PpACS1、PpACS4和PpACS6在轉(zhuǎn)PpSGR桃幼苗中被顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，其中轉(zhuǎn)PpSGR桃幼苗中PpACS1表達(dá)量是對(duì)照的32倍以上；PpACS5表達(dá)量在轉(zhuǎn)PpSGR桃幼苗中顯著下調(diào)。

為確認(rèn)PpSGR對(duì)桃苗乙烯合成的調(diào)控，設(shè)計(jì)了一個(gè)乙烯含量測量的容器，進(jìn)行桃幼苗乙烯釋放量的測定（圖8-B）。結(jié)果顯示，瞬轉(zhuǎn)PpSGR的桃苗，其乙烯釋放量呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。在侵染4 d和6 d時(shí)，試驗(yàn)組與對(duì)照組乙烯釋放量達(dá)到極顯著差異水平。該結(jié)果表明，過表達(dá)PpSGR具有促進(jìn)桃幼苗乙烯合成的功能。

3 討 論

葉綠素是存在于類囊體中的一種色素蛋白，也是綠色植物吸收光能的重要物質(zhì)，大量分布于植物的葉片和莖中[20-21]。植物綠色組織褪綠是植物在成熟和衰老過程中的葉綠素發(fā)生降解而引起的，例如果實(shí)成熟時(shí)果皮顏色變化及葉片老化黃化等[22-23]。在柑橘成熟過程中，果實(shí)外表皮的葉綠素發(fā)生降解，表皮變黃[24]。

乙烯對(duì)葉綠素的降解有一定的影響[25]。乙烯釋放量增加會(huì)促進(jìn)果實(shí)的成熟，導(dǎo)致葉綠素降解，如：成熟的葡萄果實(shí)會(huì)釋放大量乙烯，引起葡萄穗梗中的葉綠素含量明顯降低，并導(dǎo)致穗梗發(fā)生褐化[26]，其中使得調(diào)控葉綠素降解速率的關(guān)鍵基因，如SGR1等的表達(dá)量明顯升高[27]，暗示著乙烯與SGR1基因之間可能存在著調(diào)控關(guān)系。此外，有研究表明，乙烯對(duì)SGR基因的表達(dá)也具有促進(jìn)作用。在擬南芥中乙烯可以迅速誘導(dǎo)AtSGR1的表達(dá)[28]；在豆科植物中間錦雞兒中乙烯能通過誘導(dǎo)CiNAC1基因上調(diào)促進(jìn)葉片衰老，進(jìn)而促進(jìn)葉綠素降解相關(guān)基因SGR1、SGR2的表達(dá)量升高[29]。Shimoda等[30]報(bào)道了STAY-GREEN（SGR），也稱為NON-YELLOWING（NYE），Wei等[31]從高羊茅中分離得到FaNYE1，與大麥中HvSGR具有較高的同源率，在自然老化和黑暗條件下FaNYE1誘導(dǎo)表達(dá)，F(xiàn)aNYE1蛋白含量與植株中的葉綠素含量成反比，過表達(dá)FaNYE1會(huì)加速葉綠素的降解。SGR在植物葉綠素降解過程具有非常重要的作用。有研究者在擬南芥中發(fā)現(xiàn)SGRs編碼脫鎂螯合酶（MCS），能嵌入到Chl-蛋白酶復(fù)合體中提取Mg2+，具有酶的活性，從而對(duì)植物葉綠素降解具有重要調(diào)控作用[8，32]。目前，已有大量研究對(duì)SGR基因的褪綠功能進(jìn)行驗(yàn)證。例如，當(dāng)萊茵衣藻CrSGR在擬南芥細(xì)胞中過表達(dá)時(shí)，擬南芥葉片中葉綠素含量下降，證實(shí)了SGR基因在葉綠體中具有解鎂活性，從而使得擬南芥葉片褪綠表現(xiàn)黃化[32]；Sato等[33]在水稻和豌豆中找到了孟德爾的綠子葉突變體，即SGR，它能減緩在暗條件下對(duì)葉綠素的分解，結(jié)果表明，SGR參與葉綠素降解主要是通過葉綠素降解酶基因CNYC1/NOL、PAO實(shí)現(xiàn)的。Sakuraba等[15]發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下擬南芥SGR1和SGRL可在衰老前快速降解葉綠素。筆者的研究結(jié)果表明，隨著果實(shí)成熟PpSGR基因表達(dá)量逐漸升高，過表達(dá)PpSGR基因后桃葉片出現(xiàn)褪綠表型，并且在鹽脅迫條件下，PpSGR促進(jìn)了葉片黃化。上述結(jié)果證實(shí)了PpSGR具有促進(jìn)桃葉片褪綠的功能。

在桃果實(shí)成熟過程中會(huì)產(chǎn)生大量乙烯，同時(shí)果皮和果肉褪綠也相伴發(fā)生。前人的大量研究顯示，乙烯可以上調(diào)SGR1表達(dá)促進(jìn)褪綠發(fā)生[27-28]。但也有研究指出，在番茄中沉默SlSGR1能通過改變乙烯相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而延長果實(shí)貨架期。這意味著SGR1可能具有反饋調(diào)節(jié)乙烯合成或乙烯信號(hào)通路的功能[34-35]。乙烯合成酶基因家族成員在乙烯的生物合成和信號(hào)傳遞過程中發(fā)揮重要功能，如Zeng等[19]的結(jié)果表明，PpACS1在調(diào)控油桃成熟階段的乙烯產(chǎn)量方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究中，過表達(dá)PpSGR后，乙烯合成關(guān)鍵基因ACS表達(dá)量也隨之變化，除了ACS2和ACS3未檢出轉(zhuǎn)錄水平外，乙烯合成基因PpACS1、PpACS4和PpACS6在轉(zhuǎn)PpSGR桃幼苗中均顯著誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，PpACS5表達(dá)量在轉(zhuǎn)PpSGR桃幼苗中卻顯著下調(diào)。這與桃果實(shí)成熟后乙烯合成相關(guān)基因的表達(dá)量變化類似，筆者的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)PpSGR的桃苗中PpACS1的表達(dá)量超出對(duì)照32倍。乙烯含量測定結(jié)果顯示，在過表達(dá)PpSGR后，桃幼苗乙烯的釋放量顯著增加。上述結(jié)果表明SGR可能具有促進(jìn)乙烯合成的功能。

SGR除了具有酶的活性，另外也有研究指出，SGRs蛋白還可以通過與LHCII互作或招募主要的Chl降解酶來實(shí)現(xiàn)調(diào)控過程[36]。也正是由于SGR在葉綠素降解中充當(dāng)?shù)慕巧胁粔蚯逦?，因此，進(jìn)一步解析SGR是如何調(diào)控ACS基因的表達(dá)從而影響乙烯的合成具有重要意義，這將加深對(duì)SGR在葉綠素降解以外的生理過程中潛在作用的理解。

4 結(jié) 論

本研究表明，PpSGR基因隨著果實(shí)成熟轉(zhuǎn)錄水平逐漸上升；瞬時(shí)過表達(dá)結(jié)果表明，PpSGR具有促進(jìn)葉片褪綠的功能。此外，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PpSGR后，桃苗乙烯合成限速基因PpACS1的表達(dá)顯著上調(diào)32倍，且內(nèi)源乙烯釋放量顯著增多?；诒狙芯康慕Y(jié)果，初步推測PpSGR具有促進(jìn)桃幼苗乙烯合成的功能，這對(duì)桃果實(shí)成熟以及果實(shí)采后保鮮等方面的研究具有一定的啟發(fā)意義，也為SGR基因功能研究提供了一定的理論參考。

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