康 瑛, 胡 佳, 謝富貴, 郭蕓君, 李 芹, 朱永群, 林超文, 張建華, 胡容平, 王 謝
(1. 成都天府綠道建設(shè)投資集團(tuán)有限公司,成都 610041;2. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南山地農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610066)
【研究意義】隨著城鎮(zhèn)化發(fā)展,因村莊“空心化”出現(xiàn)大量閑置宅基地,極大浪費(fèi)了土地資源。為了再利用廢棄宅基地,盤活土地存量,全國各地政府紛紛開展宅基地復(fù)墾,以實(shí)現(xiàn)土地資源的有效利用。宅基地復(fù)墾土壤表層一般來源于地基翻耕土或土墻搗碎土,通常存在瓦片石塊多、物理結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重、土壤板結(jié)、通氣性差、養(yǎng)分含量低和生物活性弱等問題[1]。因此,宅基地復(fù)墾土壤必須經(jīng)過整治和培肥措施,改善土壤理化性質(zhì)、提升微生物活性和肥力,才能達(dá)到耕作的一般要求[2]。【前人研究進(jìn)展】近年來,對(duì)于宅基地復(fù)墾土壤的研究逐漸增多,但多集中在復(fù)墾適宜性評(píng)價(jià)、復(fù)墾土壤物理性質(zhì)和礦質(zhì)養(yǎng)分變化等方向[3-4]。采用人工施肥結(jié)合作物種植或種植翻壓綠肥的方式進(jìn)行土壤改良和培肥,是解決復(fù)墾土壤物理結(jié)構(gòu)不佳、養(yǎng)分貧瘠等限制的有效措施[5-6]。宅基地復(fù)墾種植后,植物生長(zhǎng)代謝和分泌物可有效增加有機(jī)質(zhì)組分輸入,改善土壤生物活性,增強(qiáng)耕作適宜性。種植綠肥(苜蓿)、番茄、玉米等作物會(huì)明顯提高耕層有機(jī)質(zhì)含量,且土壤微生物量也會(huì)由幾乎為0增加至100~400 mg/kg[7]。閆銳等[8]在宅基地復(fù)墾土壤上開展麥-玉輪作發(fā)現(xiàn),耕層微生物量碳含量可提升54.59%,亞表層則可提升150.12%。這些研究都反映出作物種類和耕作方式對(duì)宅基地復(fù)墾土壤生物活性的影響具有異質(zhì)性[9]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】土壤微生物是土壤的重要組成部分之一,其活性是衡量土壤健康的重要指標(biāo)。目前大多研究?jī)H限于宅基地復(fù)墾前后土壤微生物數(shù)量的變化,對(duì)于微生物群落結(jié)構(gòu)的變化情況知之甚少[9]。鑒于研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與作物種類之間的強(qiáng)關(guān)聯(lián)性,如何選擇肥土作物成為當(dāng)前研究亟需解決的重要問題?!緮M解決的關(guān)鍵問題】禾本科飼草因其耐賤踏、多年生且粗蛋白含量高,常作為荒山草坡修復(fù)和疏林改良的先鋒植物,本研究以自然恢復(fù)為對(duì)照,以南方山區(qū)商業(yè)化最成熟的3種禾本科飼草(高羊茅、鴨茅和黑麥草)為例,研究禾本科飼草種植對(duì)宅基地復(fù)墾土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性的影響,剖析復(fù)墾土壤中關(guān)鍵菌群對(duì)飼草品種的響應(yīng),為禾草在改良宅基地復(fù)墾土壤中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
本研究設(shè)4個(gè)處理,3次重復(fù),共建立1.00 m×1.00 m試驗(yàn)小區(qū)12個(gè)。每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)用1.00 m×0.30 m 塑料板(材質(zhì)為PE)分割,小區(qū)內(nèi)填充宅基地土壤厚度為30 cm。4個(gè)處理分別種植高羊茅(Festucaelata,處理簡(jiǎn)稱FEA,包括FEA1、FEA2、FEA3共3個(gè)小區(qū))、種植鴨茅(Dactylisglomerata,處理簡(jiǎn)稱DGA,包括DGA1、DGA2、DGA3共3個(gè)小區(qū))、種植黑麥草(Loliumperenne,處理簡(jiǎn)稱LPE,包括LPE1、LPE2、LPE3共3個(gè)小區(qū))和自然生態(tài)修復(fù)(Natural ecological restoration,簡(jiǎn)稱NER,包括NER1、NER2、NER3共3個(gè)小區(qū))。NER主要植被為狗尾草(Setariaviridis)、千里光(Senecioscandens)、一年蓬(Erigeronannuus)。宅基地土壤來自成都市錦江區(qū)獅子山(104.11° E,30.62° N,海拔492.31 m),該地區(qū)屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候,終年溫暖濕潤(rùn),四季分明,年平均氣溫16.2 ℃左右;年平均降雨量800~1000 mm,雨量充沛,年無霜期大于300 d。試驗(yàn)土壤為黃壤,宅基地歷史20年以上。2019年5月挖掘于堅(jiān)硬水泥地下,6月布設(shè)小區(qū),10月種植飼草,連續(xù)種植2年。2021年取樣測(cè)定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。
采用高通量法[10]測(cè)定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。土壤細(xì)菌群落分析基于16S rDNA通用引物PCR擴(kuò)增及Illumina平臺(tái)Miseq高通量測(cè)序技術(shù)。特異性引物為341F和806R。16S使用RDP classifier比對(duì)RDP數(shù)據(jù)庫(http://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp),測(cè)序區(qū)間為V3~V4。土壤真菌群落分析基于真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列的Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù),特異性引物為F2045和R2390。ITS使用Blast比對(duì)UNITE數(shù)據(jù)庫(http://unite.ut.ee/index.php),測(cè)序區(qū)間為ITS1~I(xiàn)TS2。
為揭示土壤微生物多樣性,分別對(duì)各處理細(xì)菌域和真菌域的觀測(cè)物種數(shù)(Observed OTU,簡(jiǎn)稱OBS指數(shù))、Chao’s指數(shù)、基于豐度的物種覆蓋度估值(Abundance-based Coverage Estimator,簡(jiǎn)稱ACE指數(shù))、Shannon多樣性指數(shù)、Simpson多樣性指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)進(jìn)行方差分析和Turkey多重比較。
在注釋的3587個(gè)細(xì)菌OTU和760種OTU中存在大量的稀少微生物。這些稀少微生物由于豐度較低,易造成計(jì)算的系統(tǒng)性誤差。因此,以所有樣本的絕對(duì)豐度之和大于100為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)OTU進(jìn)行篩選,構(gòu)建新的關(guān)鍵物種OTU分類學(xué)信息數(shù)據(jù)集OTUs,以排除稀少微生物的影響。新構(gòu)建的OTUs含602種細(xì)菌和339種真菌。
為揭示OTUs中物種豐度的數(shù)量級(jí)差異,利用密度圖進(jìn)行表示。為揭示土壤細(xì)菌群落和真菌群落對(duì)處理響應(yīng)差異的可識(shí)別度,采用ward法進(jìn)行聚類分析。為揭示OTUs中的關(guān)鍵微生物菌群和指示OTU,對(duì)每個(gè)細(xì)菌OTU和真菌OTU進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析、方差分析和Turkey多重比較,并將平均相對(duì)豐度大于1%、P<0.05的OTU作為關(guān)鍵指示物種。隨后通過對(duì)關(guān)鍵指示物種進(jìn)行聚類分析和相關(guān)性分析,以展示其內(nèi)在關(guān)聯(lián)。所有數(shù)據(jù)整理與分析基于R project 4.2.1。
由表1可知,細(xì)菌物種數(shù)明顯多于真菌,且各處理中細(xì)菌平均觀測(cè)物種數(shù)、Chao’s指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、Simpson多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)皆顯著高于真菌(student’st檢驗(yàn)的P>0.05)。由圖1可知,在OTUs中,真菌豐度數(shù)量級(jí)高于細(xì)菌,表明相對(duì)于細(xì)菌而言,種植禾草更有利土壤真菌繁殖。此外,OTUs中細(xì)菌豐度數(shù)量級(jí)表現(xiàn)為(DGA,LPE)>FEA>NER(圖1-A),真菌豐度數(shù)量級(jí)表現(xiàn)為L(zhǎng)PE>DGA>(FEA,NER)(圖1-B)。表明相對(duì)自然修復(fù),種植禾草可以明顯增加關(guān)鍵細(xì)菌和關(guān)鍵真菌豐度。但無論是細(xì)菌還是真菌,DGA、LPE、FEA和NER之間物種多樣性和均勻性皆無顯著差異(P>0.05,表1)。表明種植禾草植物對(duì)土壤微生物多樣性和均勻性不會(huì)產(chǎn)生顯著影響。
圖1 處理間OTUs的數(shù)值分布特征Fig.1 The numerical distribution characteristics of the OTUs among the treatments
表1 各處理細(xì)菌域和真菌域物種分布多樣性和均勻性Table 1 Diversity and uniformity of species distribution in bacterial and fungal domains in each treatment
由聚類分析結(jié)果(圖2)可知,利用OTUs細(xì)菌子集可較好區(qū)分NER、FEA,但對(duì)LPE和DGA處理無法有效區(qū)分其菌群結(jié)構(gòu)差異。利用OTUs真菌子集可較好區(qū)分出NER,但不能有效區(qū)分FEA、LPE和DGA。表明相對(duì)自然恢復(fù),種植禾草可顯著改變細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu),但不同禾本科植物種對(duì)細(xì)菌的影響比對(duì)真菌的影響更明顯。
圖2 各處理OTUs中細(xì)菌和真菌在門水平上的物種組成Fig.2 Species composition of bacteria and fungi at the phylum level in OTUs of different treatments
由圖3可知,各處理間OTUs中部分關(guān)鍵細(xì)菌和真菌組成在門水平上存在顯著差異。
在細(xì)菌中(圖3-A),有13個(gè)細(xì)菌門的相對(duì)豐度對(duì)處理具有顯著響應(yīng)(P<0.05)。相對(duì)于自然恢復(fù),種植禾草顯著增加了酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、裝甲菌門(Armatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、儉菌總門(Parcubacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、變形菌門(Proteobacteria)、其他未分類細(xì)菌(unclassified_Bacteria)和疣微菌門(Verrucomicrobia)的相對(duì)豐度(P<0.05),顯著降低了candidate_division_WPS-1菌門、Candidatus_Saccharibacteria菌門的相對(duì)豐度(P<0.05),而對(duì)藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)-葉綠體(Chloroplast)菌門、厚壁菌門(Firmicutes)、Latescibacteria菌門、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)的相對(duì)豐度無顯著影響(P>0.05)。而在真菌中(圖3-B),僅擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和未知真菌門(unclassified)的相對(duì)豐度對(duì)處理具有顯著正響應(yīng)(P<0.05),其他真菌門則對(duì)處理無顯著響應(yīng)(P>0.05)。
其中,在上述門水平上,較自然恢復(fù)而言,種植禾草下放線菌門(Actinobacteria)細(xì)菌、綠彎菌門(Chloroflexi)細(xì)菌、浮霉菌門(Planctomycetes)細(xì)菌和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)真菌的相對(duì)豐度增加5倍以上。FEA、DGA和LPE的放線菌門(Actinobacteria)細(xì)菌相對(duì)豐度分別是NER的5.09、6.16和6.05倍,綠彎菌門(Chloroflexi)細(xì)菌相對(duì)豐度分別是NER的13.07、4.63和6.96倍,浮霉菌門(Planctomycetes)細(xì)菌相對(duì)豐度分別是NER的3.39、6.36和6.48倍,擔(dān)子菌門(Basidiomycota)真菌相對(duì)豐度分別是NER的14.24、1.56和2.12倍。
在OTUs中,顯著響應(yīng)處理的細(xì)菌OTU為206個(gè)(P<0.05)。各處理平均相對(duì)豐度大于1%的OTU有7個(gè)(表2)。其中,4個(gè)OTU相對(duì)豐度高于NER,分別是OTUB0008(沉積物桿狀菌屬Sediminibacterium細(xì)菌)、OTUB0041(Ohtaekwangia菌屬細(xì)菌)、OTUB0024(未分類β-變形菌綱Betaproteobac teria細(xì)菌)和OTUB0007(鏈球菌屬Streptococcus細(xì)菌)。3個(gè)OTU相對(duì)豐度低于NER,皆為鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas細(xì)菌,分別是OTUB0045、OTUB0009和OTUB0002。
在OTUs中,顯著響應(yīng)處理的真菌OTU為74個(gè)(P<0.05)。各處理平均相對(duì)豐度大于1%的OTU有9個(gè)(表2)。其中,OTUF0564(未分類傘菌綱Agaricomycetes真菌)為FEA獨(dú)有,OTUF0247(須殼孢屬Pyrenochaeta真菌)和OTUF0322(有孔疣苔屬Verrucaria真菌)為NER獨(dú)有。OTUF0028(未知真菌)在DGA中相對(duì)豐度最高。OTUF0458(鬼傘屬Coprinopsis真菌)、OTUF0059(未分類的銀耳綱Tremellomycetes真菌)顯著高于其他處理,在FEA中相對(duì)豐度最高。OTUF0015(考克氏菌屬Knufia真菌)、OTUF0068(Capronia屬真菌)和OTUF0056(考克氏菌屬Knufia真菌)在NER中相對(duì)豐度最高。表明處理之間真菌結(jié)構(gòu)具有典型的特異性,暗示種植禾本科植物種更容易促進(jìn)土壤中與之強(qiáng)關(guān)聯(lián)的真菌物種生長(zhǎng)與繁殖。
由圖4可知,宅基地復(fù)墾種植禾草的指示微生物之間具有明顯共線性,根據(jù)其相關(guān)性大致可分為5類。OTUF0564獨(dú)成一類,主要表征FEA。OTUF0247、OTUF0322、OTUF0015、OTUB0045、OTUB 0009、OTUF0068、OTUF0056和OTUB0002為一類,主要表征NER。OTUF0458和OTUF0059為一類,主要表征FEA處理。OTUF0028獨(dú)成一類,主要表征DGA。無菌單獨(dú)表征LPE。OTUB0008、OUTB00 24、OTUB0041和OUTB0007為一類,主要表征種植禾草。
圖4 指示物種之間的相關(guān)性Fig.4 Correlations between indicator species
復(fù)墾土壤由于壓實(shí)或人為破壞較大,土壤板結(jié)、通氣性差,土壤中微生物和原生動(dòng)物數(shù)量和種類很少,但通過不同方式培肥,土壤生物活性有了不同程度提高。外源新增的土壤有機(jī)物為微生物繁殖提供了豐富碳源和氮源,均可促進(jìn)宅基地復(fù)墾土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌的生長(zhǎng),但培肥使用的有機(jī)質(zhì)種類也調(diào)控了土壤中不同微生物的變化速率和變化幅度。如施用化肥可使宅基地復(fù)墾土壤真菌數(shù)量提高3.5倍,有機(jī)肥和菌肥配合使用可顯著提高土壤真菌和放線菌數(shù)量,但對(duì)細(xì)菌數(shù)量無影響[11]。又如秸稈還田可使宅基地復(fù)墾土壤微生物總量增加36%,而菌渣和豬糞還田可使微生物總量增加100%以上[12]。除施肥外,復(fù)墾種植作物后,根系死亡及其分泌物的輸入對(duì)土壤微生物的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用。且宅基地復(fù)墾土壤微生物的繁殖規(guī)律與種植的作物種類有緊密關(guān)系。如宅基地復(fù)墾種植番茄、玉米和茄子等作物后,0~20 cm土層土壤微生物量明顯增加,且種植番茄對(duì)土壤微生物的促進(jìn)作用優(yōu)于種植玉米和茄子[7]。本研究也發(fā)現(xiàn),相比于自然恢復(fù),種植禾草后土壤細(xì)菌和真菌豐度的數(shù)量級(jí)明顯增加,且種植鴨茅和黑麥草下土壤細(xì)菌和真菌的豐度大于種植高羊茅。這在證明“種植禾草可促進(jìn)土壤細(xì)菌、真菌繁殖,有改善宅基地復(fù)墾土壤生物活性的作用”同時(shí),也強(qiáng)調(diào)了“飼草種類對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的特異性調(diào)控”。
土壤微生物參與調(diào)節(jié)土壤團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)形成和養(yǎng)分循環(huán),受土壤中可供利用的物質(zhì)和能源影響,其群落結(jié)構(gòu)和物種組成也會(huì)對(duì)不同環(huán)境特性作出特異性響應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn),相比于自然恢復(fù),種植禾草后,宅基地復(fù)墾土壤微生物群落組成發(fā)生了一系列特異性變化,細(xì)菌和真菌在門和屬水平上表現(xiàn)出明顯差異。趙文等[13]在研究祁連山草地時(shí)指出無論是天然草地還是人工草地,土壤細(xì)菌均以變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和浮霉菌門為主要類群,屬水平上因種植牧草類型不同而具有明顯差異,但鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌仍是次優(yōu)勢(shì)類群。本研究也得到相似結(jié)論,即種植禾草促進(jìn)復(fù)墾土壤中放線菌門、浮霉菌門大量繁殖。但在屬水平上卻有明顯差異。鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌對(duì)貧營(yíng)養(yǎng)條件的適應(yīng)能力較強(qiáng),具有促進(jìn)有機(jī)物料腐解和養(yǎng)分釋放的功能[17],在自然恢復(fù)宅基地復(fù)墾土壤中較豐富,可能與植物種類較多、土壤中有機(jī)物質(zhì)組成更復(fù)雜有關(guān)。本研究對(duì)處理具有顯著正響應(yīng)的是1種沉積物桿狀菌屬細(xì)菌、Ohtaekwangia菌屬細(xì)菌、鏈球菌屬細(xì)菌及1種未分類β-變形菌綱細(xì)菌。一些研究指出,這4種細(xì)菌在消解作物秸稈、降解纖維素方面也具有明顯優(yōu)勢(shì),它們可能發(fā)揮著代替鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌功能的作用[14-16]。這也暗示了宅基地復(fù)墾后細(xì)菌主要功能需求一致,即需要快速分解有機(jī)物料以獲取養(yǎng)分供給給植物。
自然界約有150萬真菌種類,但至今只有5%~10%已被正式描述,人類僅了解當(dāng)中極少部分真菌[18]。真菌有參與有機(jī)質(zhì)分解、與植物共生(為植物提供養(yǎng)分)和病原真菌3個(gè)主要功能。其中,擔(dān)子菌門腐生或寄生,在潮濕土壤中可分解木質(zhì)纖維素,是土壤中主要的真菌分解者。本研究發(fā)現(xiàn),種植禾草后,宅基地復(fù)墾土壤中擔(dān)子菌門相對(duì)豐度顯著增加。種植禾草有利于真菌繁殖,雖不顯著影響真菌群落多樣性,但對(duì)關(guān)鍵物種的豐度有較大改變。在屬水平上,本研究發(fā)現(xiàn)某些具有典型特異性的真菌,如:自然恢復(fù)下宅基地土壤獨(dú)有1種須殼孢屬Pyrenochaeta真菌(OTUF0247)和1種有孔疣苔屬Verrucaria真菌(OTUF0322),而1種未知真菌(OTUF0028)僅存在于種植禾草的復(fù)墾土壤中。其中,Pyrenochaeta屬真菌多為農(nóng)作物土傳病原真菌,如P.lycopersici[19]、P.terrestris[20]和P.glycines[21]。這一發(fā)現(xiàn)與其他研究結(jié)論[22]基本一致,如人工種植牧草后土壤中病原真菌豐度較天然草地土壤大幅增加,同時(shí)還顯著提高了土壤中生防菌類群的相對(duì)豐度。因此,宅基地復(fù)墾土壤中人工種植禾草對(duì)真菌群落的組成演替暫不能一概而論,還需對(duì)上述特有的真菌進(jìn)一步培養(yǎng)和鑒定。
植物和土壤生物相互依存,土壤中的微生物組由生長(zhǎng)在土壤中的植物塑造[23-24]。這是由于植物根際微生物大多是從周圍的土壤中招募而來[25]。若將土壤效應(yīng)與植物效應(yīng)分開,則明確反映出植物物種對(duì)土壤真菌起著關(guān)鍵控制作用[26]。Kos等[27]指出植物功能類型之間的這些差異可以調(diào)節(jié)土壤微生物群落。當(dāng)前,一些學(xué)者已經(jīng)認(rèn)識(shí)到植物對(duì)土壤生物群的調(diào)節(jié)效應(yīng)超過了對(duì)土壤非生物特征的影響,并且這種驅(qū)動(dòng)植物生長(zhǎng)的土壤生物因素會(huì)長(zhǎng)期保留在土壤中[28-29]。但更多的人認(rèn)為這種驅(qū)動(dòng)力主要來自于真菌,而非細(xì)菌[30-31]。本研究得出細(xì)菌的影響明顯強(qiáng)于真菌,可能是由于本研究的土壤來自于多年的宅基地土壤,沒有任何的植物背景,而其他研究對(duì)象是具有一定植被的土壤。雖然當(dāng)前研究[32]已經(jīng)證實(shí)土壤微生物可以通過植物根部募集有益細(xì)菌形成共生關(guān)系來直接影響作物生長(zhǎng),也可以通過改變土壤養(yǎng)分間接影響作物生長(zhǎng)。但作物種植模式在時(shí)間上可以相對(duì)靜態(tài),也可以高度動(dòng)態(tài)。作物與復(fù)墾土壤之間的長(zhǎng)期關(guān)系仍需持續(xù)關(guān)注,特別是要將作物類型與耕地質(zhì)量和耕地健康的長(zhǎng)期穩(wěn)定性關(guān)系耦合起來,思考復(fù)墾土地的開發(fā)和利用。
種植禾草可以增加宅基地復(fù)墾土壤關(guān)鍵細(xì)菌和關(guān)鍵真菌的豐度,改變微生物群落結(jié)構(gòu)。不同禾草品種對(duì)宅基地復(fù)墾土壤中真菌繁殖的促進(jìn)作用具有特異性。關(guān)鍵菌群的功能性差異為宅基地復(fù)墾土壤改良中飼草品種的選擇提供了科學(xué)依據(jù)。