楊甲定,劉雨節(jié),馮建元,2,張遠(yuǎn)蘭

(1.南京林業(yè)大學(xué),南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,南京林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210037;2. 江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇 淮安 223005)

氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育中需求量最大的營(yíng)養(yǎng)元素[1],在自然生態(tài)系統(tǒng)中,氮素缺乏是限制植物生長(zhǎng)與分布的常見(jiàn)環(huán)境因子之一,而在人工農(nóng)林生產(chǎn)系統(tǒng)中,施用氮肥以保證土壤中存在足夠的氮素營(yíng)養(yǎng)是保障植物生物量生產(chǎn)的重要措施之一[2]。據(jù)估計(jì),全球每年有超過(guò)1億t合成氮肥的施用來(lái)支持農(nóng)業(yè)生產(chǎn),但由于農(nóng)作物的氮素利用效率普遍低于50%,有近一半的外施氮素并沒(méi)有被植物所吸收而流失到環(huán)境中。我國(guó)人口眾多,每年需施用大量氮肥來(lái)確保農(nóng)作物豐收,但大量化肥投入并沒(méi)有帶來(lái)成比例糧食產(chǎn)量的提高,化肥利用率僅為30%左右,因此農(nóng)業(yè)生產(chǎn)存在“高肥低效”的問(wèn)題[1]。就林業(yè)而言,天然林通常不需要化肥的投入,但人工林(plantation forests)作為當(dāng)前木材相關(guān)產(chǎn)品的重要來(lái)源,因其速生和短輪伐特性,每年需要密集的管理和投入,其中重要的內(nèi)容就是化肥的施用。大量氮素的投入不但意味著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本的增加,而且氮素向環(huán)境的流失,帶來(lái)土壤酸化、土壤和水體富營(yíng)養(yǎng)化、溫室氣體大量排放等一系列的環(huán)境問(wèn)題[3]。因此,如何在保證農(nóng)林系統(tǒng)生物量生產(chǎn)的前提下,減少氮肥施用,減輕環(huán)境污染,成為亟待解決的現(xiàn)實(shí)和科學(xué)問(wèn)題[4]。

近年來(lái),以提高植物氮素利用效率(nitrogen use efficiency, NUE)為目標(biāo)的研究正成為植物學(xué)、農(nóng)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[5],但與樹(shù)木相關(guān)的機(jī)理解析和應(yīng)用研究尚不多見(jiàn)。培育具有較高NUE的作物和林木新品種,不僅可以一定程度上減少植物根際土壤氮素的流失,有利于改善環(huán)境,同時(shí)有助于減少農(nóng)林生產(chǎn)中人工氮肥的施用,降低生產(chǎn)成本,維持可持續(xù)生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)。筆者對(duì)植物(側(cè)重于樹(shù)木)葉片衰老與氮素再吸收的關(guān)系及其分子調(diào)控機(jī)理等方面進(jìn)行綜述,并就未來(lái)研究的方向進(jìn)行探討,以期為培育具有高氮素再吸收效率的落葉樹(shù)木新種質(zhì)提供科學(xué)參考。

1 植物氮素利用效率的基礎(chǔ)

在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中,由于人工化肥的大量施加,土壤中的無(wú)機(jī)氮(硝酸鹽和銨鹽,包括有機(jī)氮肥尿素在脲酶的作用下生成的銨態(tài)氮)含量較高,是作物根系主要吸收的氮源。土壤酸堿性會(huì)影響無(wú)機(jī)氮的存在形式,即在通氣良好的土壤中以硝態(tài)氮為主,在水淹或酸性土壤中以銨態(tài)氮為主[6]。而在人工干擾較少的特定生態(tài)系統(tǒng)中(比如北方或北極的森林或草地),土壤有機(jī)氮(比如氨基酸、氨基糖和核苷酸等)通常有較高的水平而作為植物吸收的主要氮源[7]。植物除了可以從土壤中直接獲得氮素之外,豆科(Leguminosae)植物能夠通過(guò)與土壤中細(xì)菌共生形成根瘤,通過(guò)固定大氣中的氮?dú)鉃橹参锾峁╀@態(tài)氮[8]。

植物對(duì)氮素的利用包括幾個(gè)步驟,即吸收、同化/轉(zhuǎn)運(yùn)、再吸收/轉(zhuǎn)運(yùn)等,這些步驟的活性在物種(或亞種)間、植物不同發(fā)育階段、不同植物組織/器官間存在差異,而且受到各種外界環(huán)境條件的影響,因此植物氮素利用效率是一個(gè)涉及遺傳因素和環(huán)境因素互作的復(fù)雜性狀,是植物根系對(duì)土壤氮素的吸收、植株對(duì)所吸收氮素的同化與利用、衰老組織/器官中氮素的再吸收等多方面效率的綜合表現(xiàn)[4]。解析植物氮素利用效率形成的限速步驟或環(huán)節(jié),有助于有針對(duì)性地調(diào)控這些步驟或環(huán)節(jié)以提高氮素利用效率。

1.1 氮素吸收(nitrogen uptake)

植物根系吸收土壤中不同形態(tài)的氮素由相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成,根據(jù)其對(duì)所轉(zhuǎn)運(yùn)氮素的親和性分為低親和和高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[5]。①植物對(duì)硝態(tài)氮的吸收由硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(nitrate transporter,NRT)完成[9]。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物體內(nèi)成員眾多,以擬南芥(Arabidopsisthaliana)為例,已知有72個(gè)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白,分為NRT1、NRT2、CLC和SLAC/SLAH等4類(lèi)[10],其中NRT1成員最多,達(dá)53個(gè),主要是低親和性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,負(fù)責(zé)在高濃度硝酸鹽條件下對(duì)硝酸離子的吸收,但某些成員專一性不強(qiáng),除了硝酸離子,還可轉(zhuǎn)運(yùn)二肽、多種激素或硫代葡萄糖苷。擬南芥AtNRT1.1是植物中第一個(gè)被鑒定的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,不僅可參與根系對(duì)硝酸鹽的吸收,也參與硝酸鹽由根向莖的轉(zhuǎn)運(yùn),而且其對(duì)硝酸離子的親和活性具有高低兩種狀態(tài),通過(guò)其蛋白上Thr101的磷酸化(表現(xiàn)高親和性)與去磷酸化(表現(xiàn)低親和性)轉(zhuǎn)換親和性[11]。與NRT1不同,NRT2家族成員均對(duì)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)表現(xiàn)高親和性,參與在低硝酸鹽濃度下根系對(duì)硝酸離子的吸收(或轉(zhuǎn)運(yùn))過(guò)程,擬南芥中有7個(gè)成員(AtNRT2.1-2.7),除AtNRT2.7外,其他成員均需輔助蛋白(AtNAR2.1)的協(xié)助才能發(fā)揮其轉(zhuǎn)運(yùn)功能。②植物對(duì)銨鹽的吸收由銨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ammonium transporter,AMT)完成,在擬南芥中,轉(zhuǎn)運(yùn)銨鹽的AMT蛋白家族有6個(gè)成員,即5個(gè)AMT1成員(AMT1;1-1;5)和1個(gè)AMT2[12]。根系對(duì)銨鹽的吸收由AMT1;1、AMT1;2、AMT1;3、AMT1;5等4個(gè)AMT蛋白負(fù)責(zé),均為高親和性銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其中AMT1;1、AMT1;3和AMT1;5在根表皮細(xì)胞表達(dá)而AMT1;2則在根系皮層和內(nèi)皮層細(xì)胞中表達(dá)。擬南芥四突qko(即amt1;1amt1;2amt1;3amt2;1)在以銨鹽為唯一氮源的生長(zhǎng)條件下表現(xiàn)出嚴(yán)重的生長(zhǎng)受阻,而且根系對(duì)銨鹽的高親和吸收活性僅為野生型中活性的5%～10%[13]。③植物對(duì)有機(jī)氮源吸收的研究聚焦于氨基酸方面,根系吸收氨基酸被認(rèn)為是通過(guò)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白APC(amino acid-polyamine-choline,氨基酸-多胺-膽堿)超家族中的3個(gè)亞家族成員:AAPs(amino acid permeases)、LHTs(lysine/histidine-like transporters)和ProTs(proline and glycine betaine transporters)完成[14]。不同家族之間以及家族之內(nèi),各轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)底物的特異性和親和性存在差異,比如擬南芥AAP1參與根系對(duì)谷氨酸和中性氨基酸的吸收,而AAP5在堿性氨基酸的攝取中發(fā)揮功能;LHT1轉(zhuǎn)運(yùn)中性和酸性氨基酸進(jìn)入根,而LHT6負(fù)責(zé)從根際空間吸收酸性氨基酸、谷氨酰胺和丙氨酸;ProTs則轉(zhuǎn)運(yùn)可作為滲透調(diào)節(jié)劑的脯氨酸和甘氨酸甜菜堿[15]。相對(duì)而言,植物根系對(duì)氨基酸的吸收尚有待深入研究。無(wú)論是無(wú)機(jī)氮源還是有機(jī)氮源的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,其基因的表達(dá)不僅受植物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)水平的調(diào)控,也受到土壤氮素水平、溫度、光照、土壤其他理化性質(zhì)的影響,反映了植物根系吸收土壤氮素的靈活性[16]。

1.2 氮素同化(nitrogen assimilation)

植物根系吸收的硝酸離子,一部分會(huì)儲(chǔ)存在根系細(xì)胞的液泡中,另一部分則在根中經(jīng)胞質(zhì)硝酸還原酶和質(zhì)體亞硝酸還原酶催化還原為銨鹽,并與根系吸收的銨鹽一起在根細(xì)胞內(nèi)同化合成氨基酸和蛋白質(zhì);其他大部分硝酸離子會(huì)隨木質(zhì)部液流運(yùn)輸,在地上部莖葉中還原為銨,再進(jìn)一步同化。銨鹽的同化主要通過(guò)谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)、谷氨酰胺-氧戊二酸轉(zhuǎn)氨酶(glutamine oxoglutarate aminotransferase,GOGAT)和天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase,AS)催化而生成氨基酸[17]。谷氨酰胺合成酶是氮同化過(guò)程的關(guān)鍵酶,根據(jù)亞細(xì)胞定位,可分為胞質(zhì)型GS1和質(zhì)體型GS2,其中GS1在根中發(fā)揮氮同化的主要作用,特別是在高硝酸鹽濃度時(shí);而GS2主要負(fù)責(zé)在葉肉細(xì)胞內(nèi)的氮同化和再同化光呼吸產(chǎn)生的銨[15]。無(wú)機(jī)氮同化過(guò)程產(chǎn)生的氨基酸和根系吸收的氨基酸均可被用于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成,同時(shí)地上部合成的氨基酸也可通過(guò)韌皮部運(yùn)回至根系,因此植物體內(nèi)存在著根系與地上部之間的氮素交流系統(tǒng),這種氮素交流的強(qiáng)度受到植物種類(lèi)、植物發(fā)育狀態(tài)和環(huán)境因子的影響[18]。

1.3 氮素再吸收(nitrogen resorption)

氮素同化后產(chǎn)生的絕大部分氨基酸會(huì)用于蛋白質(zhì)的合成,既發(fā)揮酶的催化功能也作為氮的儲(chǔ)藏。葉片中存在大量非活性的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)和谷氨酰胺合成酶GS2很可能就是一種氮素的貯藏形式[15]。氮素再吸收就是分解源器官(如衰老葉片)中的儲(chǔ)藏蛋白,以氨基酸或酰脲的形式將氮素轉(zhuǎn)運(yùn)至幼嫩器官或儲(chǔ)藏器官。1年生模式植物和作物中的大量研究表明,氮素再吸收的最主要轉(zhuǎn)運(yùn)形式是氨基酸和小肽。衰老葉片氮素再吸收有3個(gè)連續(xù)的環(huán)節(jié),即蛋白質(zhì)降解(degradation of leaf proteins)、氨基酸相互轉(zhuǎn)變(interconversion of amino acids)和氨基酸向韌皮部的裝載(phloem loading of amino acids)[19]。①蛋白質(zhì)的降解主要通過(guò)自噬途徑和蛋白水解酶完成,在擬南芥葉片衰老階段,大量蛋白水解酶基因和自噬基因的表達(dá)上調(diào),暗示了二者在氮素再吸收中的作用。②蛋白質(zhì)降解生成的氨基酸并不是隨機(jī)運(yùn)輸?shù)?研究表明衰老階段韌皮部液流中含量最多的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)形式是谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸、絲氨酸等特定氨基酸,因此存在其他氨基酸向這些特殊氨基酸的轉(zhuǎn)變反應(yīng)。這種反應(yīng)被認(rèn)為發(fā)生在葉肉細(xì)胞和篩管伴胞的線粒體和細(xì)胞質(zhì)內(nèi),主要催化酶為谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase,GDH)、谷氨酰胺合成酶1(glutamine synthetase 1,GS1)和天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase,AS)等[17]。③篩管是運(yùn)輸氨基酸回流的通道,雖然推測(cè)氨基酸從葉肉細(xì)胞進(jìn)入篩管既可通過(guò)胞間連絲介導(dǎo)的共質(zhì)體途徑也可通過(guò)質(zhì)外體途徑,但擬南芥和大多數(shù)作物中的研究表明氨基酸進(jìn)入篩管是質(zhì)外體裝載過(guò)程,即氨基酸首先從薄壁細(xì)胞或維管束鞘細(xì)胞以被動(dòng)運(yùn)輸方式進(jìn)入葉片質(zhì)外體,隨后由定位于韌皮部伴胞細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將質(zhì)外體的氨基酸運(yùn)入韌皮部,這一環(huán)節(jié)通常認(rèn)為是氮素由源(比如衰老葉片)向庫(kù)(儲(chǔ)藏器官)轉(zhuǎn)運(yùn)的限速環(huán)節(jié)[20-21]。

2 植物葉片衰老與氮素再吸收

氮素再吸收通常發(fā)生在整體植株或特定組織/器官進(jìn)入由發(fā)育年齡引發(fā)的自然衰老或因環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的提前衰老時(shí)[17,22]。衰老(senescence)作為一種以發(fā)育年齡為內(nèi)因的程序性過(guò)程,可以發(fā)生在細(xì)胞、組織、器官和整體植株等不同水平[23]。葉片衰老是葉片正常生長(zhǎng)發(fā)育的最后一個(gè)生物學(xué)階段[24]。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的葉片作為光合器官,也是活躍同化氮素的主要場(chǎng)所;隨著進(jìn)入衰老階段,葉片的光合能力和氮素同化代謝逐漸衰弱,而葉綠素、蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)等大分子的分解逐漸增強(qiáng),因此形態(tài)上的失綠是葉片衰老最明顯的特征,而代謝上則主要是葉綠素的降解和葉綠體結(jié)構(gòu)的解離,使葉片轉(zhuǎn)變?yōu)閮粝蛲廨敵鰻I(yíng)養(yǎng)成分的源器官,最終導(dǎo)致葉片的死亡[23]。葉片衰老雖然發(fā)生在器官水平,但與整體植株的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān):當(dāng)1年生植物進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段,比如大田作物小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)等開(kāi)花進(jìn)而孕育籽粒時(shí),會(huì)啟動(dòng)葉片的衰老進(jìn)程,同時(shí)整體植株趨向自然死亡;而對(duì)多年生落葉樹(shù)木而言,葉片自然衰老通常伴隨著每年秋季葉片顏色由綠變黃或變紅以及葉片凋落,表明樹(shù)木結(jié)束當(dāng)年的生長(zhǎng)期而進(jìn)入休眠期[25]。雖然在適宜的生長(zhǎng)條件下,葉片的衰老主要依賴于發(fā)育年齡,但各種內(nèi)源因素(激素含量、營(yíng)養(yǎng)物積累等)和外源環(huán)境因子(光周期、溫度、水肥供應(yīng)、病蟲(chóng)害等)可以影響衰老的啟動(dòng)與進(jìn)程[24],特別是在非生物環(huán)境脅迫條件下,植物往往通過(guò)提前啟動(dòng)成熟葉片的衰老來(lái)再吸收其中儲(chǔ)藏的營(yíng)養(yǎng)資源(比如氮素)以保證其幼葉發(fā)育或完成種子生產(chǎn),因此環(huán)境脅迫引發(fā)的葉片衰老進(jìn)程也與植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力相關(guān)聯(lián)[22]。

1年生植物/作物葉片衰老所輸出的氮磷等營(yíng)養(yǎng)成分主要用于新器官(如新葉和種子)的生長(zhǎng)發(fā)育,特別是以籽粒為收獲對(duì)象的1年生農(nóng)作物,在其生殖生長(zhǎng)階段的花序生長(zhǎng)、種子發(fā)育以及籽粒產(chǎn)量主要依賴從衰老葉片中再吸收的營(yíng)養(yǎng)[19],比如水稻、小麥、大麥(Hordeumvulgare)等作物營(yíng)養(yǎng)器官中,最高可達(dá)90%的氮素會(huì)被再吸收轉(zhuǎn)運(yùn)至籽粒[2]。大量大田研究也表明,作物衰老葉片的氮素再吸收效率決定了籽粒的產(chǎn)量[26],而且在作物發(fā)育的適當(dāng)階段促進(jìn)葉片的衰老可以促使更多的營(yíng)養(yǎng)成分向籽粒輸送,從而提高籽粒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,比如具有更高的蛋白含量和某些微量元素的含量等[27]。另一方面,延緩葉片衰老意味著葉片光合功能保持更長(zhǎng)時(shí)間,有利于光合同化物的生產(chǎn),可以提高植株生物量的積累,特別是對(duì)綠葉蔬菜作物來(lái)說(shuō),延緩葉片衰老還有利于保持蔬菜的采后品質(zhì)以及延長(zhǎng)儲(chǔ)運(yùn)時(shí)間,降低采后損失[28]。因此,闡明植物(作物)葉片衰老和營(yíng)養(yǎng)再吸收以及利用的調(diào)控機(jī)理,可在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中根據(jù)所收獲植物器官的差別(比如是葉片還是籽粒),有針對(duì)性地調(diào)控葉片的衰老進(jìn)程(即在特定階段延緩或促進(jìn)農(nóng)作物的葉片衰老),從而更精準(zhǔn)地為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務(wù)。

與1年生農(nóng)作物不同,多年生木本落葉植物(落葉樹(shù)木)每年秋季的葉片衰老過(guò)程中,伴隨著葉綠素的降解,葉片內(nèi)的部分氮素營(yíng)養(yǎng)會(huì)再吸收回枝條、莖干甚至根系[24]。生長(zhǎng)于福建濱海同一地區(qū)的4種紅樹(shù)植物表現(xiàn)出不同的衰老葉片氮素再吸收效率:拒鹽紅樹(shù)秋茄(Kandeliaobovata)和木欖(Bruguieragymnorrhiza)的氮素再吸收效率較高,分別為73%和83%,而泌鹽紅樹(shù)白骨壤(Avicenniamarina)和桐花樹(shù)(Aegicerascorniculatum)則較低,分別為66%和42%[29];生長(zhǎng)于墨西哥中部山區(qū)的兩種落葉櫟樹(shù)(Quercuscastanea和Q.deserticola)表現(xiàn)出不同的葉片氮素再吸收效率,分別為87.9%和82.4%[30];生長(zhǎng)于干熱河谷區(qū)的林齡為9、15和26 a的新銀合歡(Leucaenaleucocephala),或生長(zhǎng)于濱海沙地的林齡為4 、8、13 a的尾巨桉(Eucalyptusgrandis×E.urophylla),其葉片對(duì)氮素養(yǎng)分的再吸收率均表現(xiàn)出隨林齡的增大而下降的趨勢(shì)[31-32];以重慶石灰?guī)r地區(qū)15種常綠木本植物和14種落葉木本植物為對(duì)象的研究結(jié)果則表明常綠植物基于單位質(zhì)量葉片養(yǎng)分含量計(jì)算的氮素平均再吸收效率為39.42%,高于落葉植物的24.08%[33];我國(guó)太行山地區(qū)闊葉人工林樹(shù)種刺槐(Robiniapseudoacacia)的葉片氮素再吸收效率為34%～53%,而針葉樹(shù)側(cè)柏(Platycladusorientalis)的養(yǎng)分再吸收不明顯[34];在養(yǎng)分虧缺條件下生長(zhǎng)的日本落葉松(Larixkaempferi) 其葉片氮素再吸收效率可達(dá) 76.3% ,但在營(yíng)養(yǎng)充分條件下為56.8%[35]。這些研究說(shuō)明樹(shù)木葉片的氮素再吸收效率不僅與樹(shù)種、樹(shù)木年齡、樹(shù)種功能類(lèi)型(落葉或常綠、針葉或闊葉)等有關(guān),也受生長(zhǎng)環(huán)境、土壤氮素水平、水分供應(yīng)等環(huán)境因子的影響[36]。同時(shí)在全球尺度上,衰老葉片的氮素再吸收效率與植物生長(zhǎng)區(qū)域的緯度顯著正相關(guān)(即隨著緯度的升高而升高),但與年平均氣溫、年平均降水量顯著負(fù)相關(guān)(即隨年平均氣溫和降水量的升高而降低)[37]。

葉內(nèi)氮素再吸收回到枝條等器官不僅有助于增強(qiáng)植物對(duì)外界寒冷/干旱脅迫的抵抗能力,而且這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在第2年春季可以再動(dòng)員轉(zhuǎn)運(yùn),用于芽、葉、花的萌生,從而有利于提高植物的生存競(jìng)爭(zhēng)能力[38]。利用15N標(biāo)記手段檢測(cè)春季根系對(duì)氮素的吸收,發(fā)現(xiàn)許多落葉樹(shù)種包括楊樹(shù)(Populustrichocarpa)[39]、歐洲花楸(Sorbusaucuparia)[40]、蘋(píng)果(Malusdomestica)[41]等,其春季枝條內(nèi)儲(chǔ)藏氮素的再利用要比根系對(duì)氮素的活躍吸收早20～30 d發(fā)生,說(shuō)明其春季地上部的初生長(zhǎng)(新葉和花的萌生)依賴于對(duì)枝條內(nèi)所儲(chǔ)藏氮素營(yíng)養(yǎng)的再利用,而不依賴于春季的根際肥料施用。新近有關(guān)橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)的研究表明,落葉期再吸收的氮素主要貯藏在主干和根系,其15N分配率為 59.58%左右,以主干木質(zhì)部的15N分配率最高;這些貯藏氮在翌年春季會(huì)有超過(guò)一半再分配用于新生器官的生長(zhǎng)發(fā)育,并且上一季的適量施肥對(duì)貯藏氮的分配率有一定的提高作用[42]。這些結(jié)果說(shuō)明落葉樹(shù)種在春季的最初長(zhǎng)勢(shì)可能主要取決于枝條或根系中的貯藏氮素營(yíng)養(yǎng),而這一營(yíng)養(yǎng)積累又與上一年秋季落葉前葉內(nèi)氮素營(yíng)養(yǎng)的再吸收過(guò)程緊密正相關(guān)。因此,通過(guò)提高樹(shù)木衰老葉片的氮素再吸收效率促使更多氮素營(yíng)養(yǎng)從衰老葉片轉(zhuǎn)運(yùn)回枝條或其他貯藏組織,不僅減少了樹(shù)木因落葉導(dǎo)致的體內(nèi)氮素?fù)p失,而且在某種程度上降低了樹(shù)木下一季生長(zhǎng)對(duì)外源氮肥的需求,這對(duì)大面積落葉人工林來(lái)說(shuō)具有節(jié)省化肥施用、降低經(jīng)營(yíng)成本的潛在應(yīng)用價(jià)值。

3 衰老葉片氮素再吸收的調(diào)控機(jī)理

葉片衰老是一個(gè)受到嚴(yán)格調(diào)控的程序化過(guò)程,在機(jī)理上體現(xiàn)為葉片細(xì)胞在基因表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)、代謝及結(jié)構(gòu)等層次的有序變化[43]。近年來(lái)有關(guān)植物葉片衰老的研究已深入到分子水平。在1年生模式植物和農(nóng)作物中,通過(guò)從T-DNA插入突變體庫(kù)或化學(xué)誘變突變體庫(kù)中篩選葉片衰老表型發(fā)生改變的突變體,成功鑒定了許多重要的參與葉片衰老的正負(fù)調(diào)控因子;利用差異表達(dá)技術(shù)或全基因組轉(zhuǎn)錄組分析,已經(jīng)從多種植物中篩選出大量的衰老相關(guān)基因(senescence associated genes,SAGs),其表達(dá)水平在葉片衰老的特定階段上調(diào),暗示SAGs在葉片衰老進(jìn)程中發(fā)揮一定功能。根據(jù)我國(guó)科學(xué)家創(chuàng)建的葉片衰老數(shù)據(jù)庫(kù)(Leaf Senescence Database, https://ngdc.cncb.ac.cn/lsd/index.php)[44],在87個(gè)物種中鑒定到SAGs,其中SAG數(shù)目較多(>100)的物種有擬南芥、香蕉(Musaacuminata)、毛果楊(P.trichocarpa)、中國(guó)白菜(Brassicarapa)、棉花(Gossypiumhirsutum)、玉米、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、毛白楊(P.tomentosa)、歐美雜交楊(P.tremula×P.tremuloides)、水稻、高粱(Sorghumbicolor)、大豆和小麥。但這些植物中大多數(shù)SAG的確切功能尚未得到實(shí)驗(yàn)確證。擬南芥中有3 920個(gè)SAGs,其中大約11%的基因的表達(dá)蛋白是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(TF),以NAC、WRKY、C2H2鋅指蛋白、AP2/EREBP和MYB等家族的數(shù)量較多,暗示這些家族的TF可能調(diào)控不同的下游靶基因和代謝環(huán)節(jié),由此組成一個(gè)極其復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)精細(xì)協(xié)調(diào)擬南芥葉片的衰老過(guò)程[45]。同時(shí),其他層次(比如表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄后水平、可變剪接、蛋白水平和代謝水平)的調(diào)控機(jī)理尚有待深入闡明[46]。另外,植物激素在葉片衰老中有重要調(diào)節(jié)作用[47],通常根據(jù)葉片衰老進(jìn)程中各類(lèi)激素的含量變化和外源施用對(duì)植物衰老的影響,將植物激素分為延緩衰老激素(包括生長(zhǎng)素、赤霉素和細(xì)胞分裂素等)和促進(jìn)衰老激素(包括脫落酸、乙烯、茉莉酸、水楊酸、獨(dú)腳金內(nèi)酯等)兩類(lèi),由于植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑存在交叉聯(lián)系,一種激素對(duì)葉片衰老的調(diào)節(jié)作用可能取決于物種、植株的發(fā)育階段或生長(zhǎng)環(huán)境條件和激素濃度等因素[23]。

與1年生模式植物和作物相比,對(duì)木本植物的葉片衰老研究并不多。Bhalerao等[48]以歐洲山楊(P.tremula)自然條件生長(zhǎng)但無(wú)可見(jiàn)衰老表型的秋葉和溫室生長(zhǎng)完全展開(kāi)的P.tremula×tremuloides幼葉為材料,構(gòu)建兩個(gè)cDNA文庫(kù),分別獲得5 128和4 841個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)文庫(kù)具有完全不同的基因表達(dá)模式:在秋葉中,編碼金屬硫蛋白、早期光誘導(dǎo)蛋白和半胱氨酸蛋白酶的表達(dá)序列標(biāo)簽最為富集,而編碼其他蛋白酶和參與呼吸、脂類(lèi)和色素降解的蛋白以及脅迫相關(guān)的基因也顯著存在;另外,間接估計(jì)秋葉中質(zhì)體蛋白的合成速率低于幼葉中速率的10%。Andersson等[49]利用包含13 490個(gè)基因克隆的生物微芯片,對(duì)瑞典北部自然生長(zhǎng)的歐洲山楊葉片從8月17日到9月21日自然衰老7個(gè)時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)3 792個(gè)代表性基因具有顯著表達(dá)變化,其中包括與葉綠素降解、線粒體呼吸、脂肪酸氧化分解以及營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因(比如蛋白酶基因),表現(xiàn)出與擬南芥葉片衰老相關(guān)基因SAG相似的表達(dá)模式。Wen等[50]以亞熱帶地區(qū)生長(zhǎng)的落葉樹(shù)木楓香(Liquidambarformosana)為研究對(duì)象,利用RNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了4月綠葉和12月紅葉的轉(zhuǎn)錄組活性,并利用生物微芯片技術(shù)對(duì)連續(xù)3年(2011—2013)生長(zhǎng)季基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)WRKY基因家族成員(LfWRKY70、LfWRKY75和LfWRKY65)和NAC基因家族成員(LfNAC1和LfNAC100)以及其他一些轉(zhuǎn)錄因子(LfSPL14和LfMYB113)是葉片衰老的關(guān)鍵調(diào)控基因;通過(guò)對(duì)葉片衰老時(shí)的上調(diào)基因進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析,發(fā)現(xiàn)被LfWRKY75、LfNAC1和LfMYB113所調(diào)控的某些基因正是與葉片衰老中葉綠素降解和花青素合成相關(guān)的候選基因。與這一結(jié)果類(lèi)似,在1年生模式植物擬南芥中,AtWRKY75被鑒定為葉片衰老中依賴于年齡的正調(diào)控因子,其表達(dá)水平在葉片衰老中上調(diào),并且與水楊酸合成和活性氧H2O2清除相偶聯(lián)[51]。Li等[52]對(duì)大田生長(zhǎng)的3株毛白楊在16個(gè)時(shí)間點(diǎn)(2018年9月22日—11月17日)的葉片進(jìn)行RNA測(cè)序,發(fā)現(xiàn)14 776個(gè)差異表達(dá)基因,其中有3 459個(gè)基因?qū)儆谌~片衰老正相關(guān)基因,在葉片衰老進(jìn)程中表達(dá)上調(diào),其功能主要是參與糖、脂、氨基酸等的代謝途徑和調(diào)控激素響應(yīng)。這些楊樹(shù)葉片衰老正相關(guān)基因與擬南芥衰老相關(guān)基因(3 852個(gè))之間有1 029個(gè)同源基因是重疊的,暗示多年生植物葉片的秋季衰老和1年生植物葉片衰老具有高度的相似性。基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn),來(lái)自31個(gè)家族的115個(gè)衰老相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子為衰老節(jié)點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子,特別是衰老相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子在控制楊樹(shù)葉片衰老中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,其中PtNAC013/PtRD26轉(zhuǎn)錄因子被鑒定為節(jié)點(diǎn)正因子,可直接調(diào)控下游的多個(gè)衰老相關(guān)基因,包括其他NAC基因(即PtORE1和PtNAP)和參與葉綠素降解(PtSGR1)、葉綠體蛋白降解(PtCV)和賴氨素代謝(PtLKR)的基因以及參與茉莉酸合成(LOX2)、乙烯合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(ACS6和PtEIN3)的基因等。更有意思的是,PtRD26在衰老葉片中會(huì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生1個(gè)攜帶一段內(nèi)含子的可變剪接體PtRD26IR,其編碼蛋白作為負(fù)調(diào)控因子,可延遲楊樹(shù)葉片的各類(lèi)衰老過(guò)程(如年齡依賴的、黑暗誘導(dǎo)的以及PtRD26誘導(dǎo)的衰老)[53]。總之,目前對(duì)木本植物葉片衰老的研究多以組學(xué)手段挖掘衰老相關(guān)的差異表達(dá)基因,對(duì)可能的關(guān)鍵基因的功能驗(yàn)證以及精細(xì)的調(diào)控途徑解析尚不多見(jiàn),特別是與葉片衰老氮素再吸收相關(guān)的研究有待加強(qiáng)。

分析植物衰老相關(guān)的研究可知,迄今經(jīng)實(shí)驗(yàn)確證的與葉片衰老營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子主要是NAC家族蛋白。在擬南芥和水稻中,其突變能導(dǎo)致植物葉片自然衰老延遲的基因推測(cè)可能對(duì)衰老葉片中營(yíng)養(yǎng)(氮素)的再吸收有正調(diào)控作用,如擬南芥AtNAP基因的功能缺失導(dǎo)致植株衰老延遲(即相對(duì)于同齡的野生型植株,突變體nap葉片有更高的葉綠素和氮素含量)[54]。在小麥中下調(diào)TtNAM-B1同源基因的轉(zhuǎn)錄水平可以延緩植株的自然衰老,導(dǎo)致旗葉中的蛋白含量提高而籽粒中蛋白含量降低,說(shuō)明從葉片到籽粒的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)受到一定抑制[55]。在水稻中超表達(dá)OsNAP使植株自然衰老提前,促使更多營(yíng)養(yǎng)向籽粒轉(zhuǎn)運(yùn),使籽粒的蛋白含量和其他7種元素的含量均顯著提高[27]。這些研究表明,某些NAC轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)控葉片衰老中氮素轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。Tang等[56]結(jié)合3年大田試驗(yàn)的基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study,GWAS)和功能驗(yàn)證,在水稻中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)雙親合硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OsNPF6.1HapB的優(yōu)異單體型植株,在低氮生長(zhǎng)條件下表現(xiàn)出更強(qiáng)的氮素吸收能力和籽粒產(chǎn)量的提高;而且鑒定到1個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子OsNAC42,能通過(guò)結(jié)合OsNPF6.1啟動(dòng)子上的CACG元件而激活OsNPF6.1的表達(dá),由此揭示了利用OsNAC42-OsNPF6.1信號(hào)節(jié)點(diǎn)來(lái)提高水稻氮素利用效率的分子育種途徑。最近,在柳枝稷(Panicumvirgatum)中發(fā)現(xiàn)1個(gè)核定位的CCCH型鋅指蛋白PvSSG,盡管不具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性,但表現(xiàn)為葉片衰老的抑制因子,超表達(dá)或抑制其基因的表達(dá),可延遲或加速葉片衰老;酵母雙雜交篩選到PvNAP1/2是PvSSG的互作蛋白,由于PvNAP1/2是葉片衰老的正調(diào)控因子,可直接轉(zhuǎn)錄激活下游的葉綠素代謝基因,表明PvSSG是通過(guò)與PvNAP1/2蛋白互作,減弱PvNAP1/2對(duì)其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用,從而對(duì)葉片衰老進(jìn)程起到“剎車(chē)”作用[57]。盡管這些研究并沒(méi)有考察所鑒定的對(duì)葉片衰老有正調(diào)控作用的基因是否也調(diào)控葉內(nèi)的氮素轉(zhuǎn)運(yùn),但基于氮素再吸收與葉片衰老的密切偶聯(lián)關(guān)系,推測(cè)這些衰老正調(diào)控因子應(yīng)會(huì)對(duì)氮素再吸收產(chǎn)生影響,但究竟是直接調(diào)控氮素再吸收的某一生理環(huán)節(jié)還是通過(guò)其他調(diào)控因子間接影響氮素轉(zhuǎn)運(yùn),尚有待解析。

4 展 望

由于現(xiàn)有的關(guān)于樹(shù)木氮素再吸收的研究多從生理生化水平研究氮素營(yíng)養(yǎng)的季節(jié)性動(dòng)態(tài)和對(duì)樹(shù)齡、外界水肥供應(yīng)、脅迫因子的響應(yīng),從分子水平解析樹(shù)木葉片衰老氮素再吸收的調(diào)控機(jī)理尚不多見(jiàn),未來(lái)應(yīng)加強(qiáng)以下方面的研究:

1)功能鑒定調(diào)控樹(shù)木葉片衰老氮素再吸收的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子?？梢越梃b1年生植物中的研究成果,先從解析某些已知在樹(shù)木葉片衰老進(jìn)程中表達(dá)上調(diào)的特定NAC、WRKY家族成員入手[53],通過(guò)轉(zhuǎn)基因超表達(dá)和基因編輯敲除,分析其對(duì)葉片衰老進(jìn)程和衰老氮素轉(zhuǎn)運(yùn)的影響,相應(yīng)地考察氮素再吸收效率的變化,由此鑒定出具有提高植物氮素利用效率潛力的特定成員。

2)由于衰老葉片中氨基酸由質(zhì)外體向韌皮部的裝載是氮素再吸收的限速環(huán)節(jié),需要從眾多的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中鑒定出定位于篩管伴胞細(xì)胞膜且在氨基酸運(yùn)入韌皮部中發(fā)揮關(guān)鍵功能的特定成員?？梢允紫群Y選在葉片衰老中表達(dá)上調(diào)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,通過(guò)考察這些基因的啟動(dòng)子在葉片不同組織的活性和所編碼蛋白的亞細(xì)胞定位,獲得定位于篩管伴胞細(xì)胞膜的特定成員,進(jìn)而分析上調(diào)/下調(diào)該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)衰老葉片氨基酸再吸收的影響。

3)植物激素脫落酸和乙烯對(duì)葉片衰老進(jìn)程發(fā)揮促進(jìn)作用,不僅二者的內(nèi)源含量在葉片衰老中上升而且外施一定濃度的激素溶液均可誘導(dǎo)葉片的提前衰老變黃[58]。由于這兩類(lèi)激素在模式植物中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件已相當(dāng)清楚,可以通過(guò)在樹(shù)木中遴選各元件的同源基因,鑒定其是否在葉片衰老與氮素再吸收中發(fā)揮功能,并就其與上述特定NAC或WRKY轉(zhuǎn)錄因子和特定的韌皮部氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的可能互作關(guān)系進(jìn)行分析。

另外,參照1年生作物和模式植物中的研究,也應(yīng)關(guān)注樹(shù)木葉片衰老和氮素再吸收中表觀遺傳水平的調(diào)控、非編碼RNA(包括小分子核糖核酸miRNA和長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸lncRNA等)和小肽等的作用。通過(guò)功能鑒定并篩選樹(shù)木葉片衰老氮素再吸收過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子或節(jié)點(diǎn),將可能為分子育種提供可靠的靶標(biāo),有助于未來(lái)通過(guò)遺傳改良培育具有較高氮素利用效率的樹(shù)木新品種。