譚鼎,李平,陳榮,郭雪峰,車麗妍,田冰,李濤

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300)

大腸桿菌疾病(colibacillosis)發(fā)病率高、傳染性強(qiáng),抗生素的濫用導(dǎo)致大腸桿菌耐藥性逐漸增強(qiáng),易引起規(guī)模性發(fā)病,危害公共安全。目前,暫無針對性疫苗,防控難度極大。這些問題在“限抗”轉(zhuǎn)型背景下難以得到及時(shí)有效地解決,對養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展造成了極大威脅[1]。乳酸菌是定植在腸道內(nèi)的有益菌,通過調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生態(tài)平衡來調(diào)控腸道的生理結(jié)構(gòu)、維護(hù)腸道屏障完整性,促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收,抑制有害菌生長,通常被用于預(yù)防和治療腸道感染疾病和抗生素依賴性腹瀉[2-3]。

現(xiàn)有研究表明,植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌皆對大腸桿菌有較好的拮抗作用,可緩減并修復(fù)因大腸桿菌感染而造成的腸黏膜損傷[4],但目前關(guān)于唾液乳桿菌體內(nèi)、體外抑菌能力的研究尚少。本試驗(yàn)旨在分離鑒定出一種能抑制大腸桿菌的雞源唾液乳桿菌,通過體外試驗(yàn)評價(jià)唾液乳桿菌對大腸桿菌的抑菌作用,同時(shí)構(gòu)建大腸桿菌感染模型,并對感染模型組灌服雞源唾液乳桿菌進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證,通過組織形態(tài)學(xué)HE染色觀察唾液乳桿菌對腸黏膜的保護(hù)作用,為大腸桿菌感染性疾病的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新疆黑雞購自圖木舒克市冠翔畜牧養(yǎng)殖服務(wù)中心;大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC25922)由塔里木大學(xué)陳偉教授課題組惠贈(zèng);5周齡SPF級小鼠(雌雄各半)購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要試劑

MRS肉湯(MRS Broth)、MRS瓊脂和LB肉湯培養(yǎng)基均購自青島海博有限公司;DNA Marker DL 2 000、EasyTaq Mix酶和細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒均購自北京全式金生物科技有限公司;革蘭氏染色試劑盒、核酸染色劑和無菌生理鹽水均購自Solarbio公司。

1.1.3 主要儀器

超凈工作臺(SW-CJ-2FD)購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;凝膠成像系統(tǒng)(721BR08598)、梯度PCR儀(C1000)、電泳儀(042BR18884)均購自Bio-Rad公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的分離鑒定

在超凈工作臺上將黑雞唾液拭子置于盛有5 mL MRS肉湯的試管中,37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h進(jìn)行增菌,無菌條件下劃線于含0.8%CaCO3的改良MRS固體培養(yǎng)基上,挑取有溶鈣圈的單菌落進(jìn)行革蘭染色并鏡檢觀察。

使用細(xì)菌全基因組DNA試劑盒提取乳桿菌的DNA,參照文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)細(xì)菌16srRNA基因通用引物27 F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492 R:5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′,目的片段大小為1 500 bp,由蘇州金唯智生物科技有限公司合成;擴(kuò)增體系為25 μL:滅菌雙蒸水8.5 μL、EasyTaq Mix 12.5 μL、上游引物和下游引物各1 μL、DNA模板2 μL;PCR擴(kuò)增程序?yàn)?預(yù)變性95 ℃ 300 s,變性94 ℃ 30 s,退火54 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 60 s,循環(huán)35次;終延伸72 ℃ 10 min,陽性擴(kuò)增產(chǎn)物由蘇州金唯智生物科技有限公司測序,所獲序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比對分析,根據(jù)比對結(jié)果鑒定細(xì)菌種類并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.2 唾液乳桿菌體外抑菌能力測定

將大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25922)菌種接種于LB肉湯培養(yǎng)基中,在37 ℃條件下培養(yǎng),取200 μL菌液涂布于MRS培養(yǎng)基平板,每個(gè)平板放置5個(gè)牛津杯,在牛津杯中加入200 μL的唾液乳桿菌菌液,對照組加入200 μL無菌生理鹽水,將平板置于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑的最大值與最小值,取平均值為抑菌圈直徑。

1.2.3 唾液乳桿菌體內(nèi)抑菌能力檢測

1.2.3.1 唾液乳桿菌稀釋液的制備

將雞源唾液乳桿菌分離株和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC25922)分別接種于MRS和LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h后,取1.5 mL菌液于離心管中,8 000 rpm離心1 min,棄上清,菌體用無菌生理鹽水重懸并稀釋至1.5×108CFU/mL備用。

1.2.3.2 唾液乳桿菌對小鼠腸黏膜保護(hù)作用檢測

5周齡小鼠經(jīng)過7 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)后,隨機(jī)分為4組,每組8只;空白對照組灌胃無菌生理鹽水200 μL/(只·天),連續(xù)21 d;炎性對照組灌胃大腸桿菌菌液200 μL/(只·天),連續(xù)7 d;唾液乳桿菌組灌胃雞源唾液乳桿菌菌液200 μL/(只·天),連續(xù)21 d;拮抗組先灌胃雞源性唾液乳桿菌菌液200 μL/(只·天),14 d之后,繼續(xù)灌胃大腸桿菌菌液200 μL/(只·天),連續(xù)7 d。試驗(yàn)期間,小鼠自由飲水。

當(dāng)炎性對照組飲食量減少,眼瞼分泌物增多,動(dòng)作遲緩,反應(yīng)遲鈍,臀部及肛門周圍有明顯污跡時(shí),進(jìn)行樣品采集。小鼠禁食12 h(正常飲水),對各試驗(yàn)組進(jìn)行空腹稱重,并取適量新鮮腸內(nèi)容物保存于無菌離心管中。

參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)tuf基因特異性引物,F:5′-TTATCTGAATACGACTTCCCTG-3′,R:5′-GTTGTCTTAACAATGTCATCCTT-3′,目的片段大小為296 bp,由上海生工有限公司合成;擴(kuò)增體系為25 μL:滅菌雙蒸水8.5 μL、EasyTaq Mix 12.5 μL、上游引物和下游引物各1 μL、DNA模板2 μL;PCR擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性95 ℃ 300 s,變性94 ℃ 30 s,退火53 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 45 s,循環(huán)35次;終延伸72 ℃ 10 min;上述引物與體系用于腸道內(nèi)容物中唾液乳桿菌的檢測。

將小鼠安樂死,取2 cm小腸組織保存在固定液中,制作切片HE染色并用顯微鏡觀察,對絨毛高度和隱窩深度進(jìn)行測量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用CaseViewer軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,通過LSD法進(jìn)行多重比較,P<0.01為差異極顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

將樣品純培養(yǎng)后,單個(gè)菌落形態(tài)完整,微微凸起,表面光滑,呈乳白色,有溶鈣環(huán)(圖1A);將挑選的細(xì)菌涂片染色,菌體革蘭氏染色后為藍(lán)紫色桿狀,兩端鈍圓(圖1B)。

A:分離株菌落形態(tài); B:分離株革蘭氏染色結(jié)果(10×100)。

2.2 分離株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果

以分離株DNA為模板,以細(xì)菌16srRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,在1 500 bp左右出現(xiàn)明顯條帶(圖2),與預(yù)期大小相符;經(jīng)測序后與GenBank數(shù)據(jù)庫比對分析,與唾液乳桿菌5547株(MT463556.1)同源性為100%,表明分離株為唾液乳桿菌。選取與分離株同源性高的唾液乳桿菌16srRNA序列,運(yùn)用MEGA7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,結(jié)果顯示分離菌株的16srRNA基因序列與Ligilactobacillussalivarius2875(MT611 837.1)株遺傳進(jìn)化相距最近,置信度為100%(圖3),說明二者在進(jìn)化上親緣關(guān)系非常近。

M:DL-2 000 Marker;1:陰性對照;2:16s rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖3 分離株基于16s rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.3 唾液乳桿菌體外抑菌能力測定結(jié)果

如表1、圖4所示,體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明,雞源唾液乳桿菌對大腸桿菌具有明顯的生長抑制作用,抑菌圈平均直徑為17.59 mm。

表1 唾液乳桿菌抑制大腸桿菌抑菌圈直徑

1:生理鹽水抑制大腸桿菌抑菌圈;2～5:唾液乳桿菌抑制大腸桿菌抑菌圈。

2.4 小鼠腸道內(nèi)唾液乳桿菌檢測結(jié)果

以各組小鼠糞便中細(xì)菌DNA為模板,用tuf基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,唾液乳桿菌組在296 bp左右出現(xiàn)目的條帶,對照組無特異性條帶(圖5),表明雞源性唾液乳桿菌可以適應(yīng)宿主的自然選擇并發(fā)揮其益生作用。

M:DL-2 000 Marker;1:唾液乳桿菌組;2:拮抗組;3:炎性對照組;4:空白對照組。

2.5 小鼠腸腔組織切片結(jié)果

小鼠腸黏膜組織切片結(jié)果顯示,與空白對照組、炎性對照組和拮抗組相比,唾液乳桿菌組腸絨毛細(xì)長、排列整齊、連續(xù)性和完整性較好,腸腔最小(圖6),表明唾液乳桿菌對小鼠腸絨毛具有伸長和保護(hù)作用。

圖6 各組小腸組織切片圖(HE 20×)

利用CaseViewer軟件測量絨毛高度和隱窩深度,結(jié)果顯示與空白對照組和炎性對照組相比,唾液乳桿菌組腸絨毛高度最高,絨隱比最高(P<0.01);與炎性對照組相比,拮抗組腸絨毛高度和絨隱比極顯著高于炎性對照組(P<0.01)(圖7A、圖7B);組織切片分析結(jié)果顯示唾液乳桿菌組杯狀細(xì)胞數(shù)目多且排列整齊、隱窩深度最淺、絨隱比最大;炎性對照組腸絨毛嚴(yán)重破損,杯狀細(xì)胞排列混亂、隱窩深度增大;拮抗組顯著優(yōu)于炎性對照組(圖7C)。表明雞源唾液乳桿菌可以增加小鼠腸道絨隱比,并且可以緩減、修復(fù)大腸桿菌對腸黏膜的損傷,進(jìn)而拮抗其感染。

A:絨毛高度、隱窩深度數(shù)據(jù);B:絨隱比數(shù)據(jù);C:小腸組織切片(HE 100×),矩形表示絨毛高度,三角形表示隱窩深度,圓形表示杯狀細(xì)胞區(qū)域。

3 討論

唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)屬于乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)乳桿菌屬(Lactobacillus),是一種革蘭氏陽性菌,它存在于人類和畜禽的共生菌群中[7]。唾液乳桿菌的代謝產(chǎn)物中有過氧化氫、抑菌素、有機(jī)酸和短鏈脂肪酸等,可抑制或殺滅細(xì)菌[8]。本研究從新疆黑雞唾液中分離鑒定出唾液乳桿菌,通過牛津杯法發(fā)現(xiàn)該株唾液乳桿菌對大腸桿菌生長有顯著的抑制作用,這與王黎明等[9]研究結(jié)果一致,表明新疆黑雞源唾液乳桿菌對大腸桿菌的生長具有體外抑制作用。

腸道微生物體系在維持動(dòng)物體健康方面有重要的作用,腸道菌群的結(jié)構(gòu)和組成反映了微生物和宿主水平的自然選擇[10]。小鼠腸道主要微生物菌群為Bacteroidetes和Firmicutes等[11-13]。本研究結(jié)果顯示試驗(yàn)組小鼠腸道內(nèi)容物有雞源性唾液乳桿菌,而對照組幾乎沒有,表明雞源性唾液乳桿菌適應(yīng)宿主的自然選擇并發(fā)揮其益生作用。

腸黏膜由上皮細(xì)胞層(柱狀上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞等)、固有層和黏膜肌層組成。上皮細(xì)胞層和固有層向管腔突出形成腸絨毛,上皮細(xì)胞層向黏膜下層凹陷形成腸隱窩。腸黏膜是支持水、養(yǎng)分和離子轉(zhuǎn)運(yùn)的一種選擇性組織膜,可作為腸道微生物與基礎(chǔ)免疫系統(tǒng)之間的屏障。乳酸菌是定植在腸道內(nèi)的有益菌,憑借其多樣性和動(dòng)態(tài)平衡性維持腸道健康、調(diào)控腸道生理結(jié)構(gòu)、維護(hù)腸黏膜完整性,促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收、有益于宿主的生長和發(fā)育[14-15]。WU H Q等[16]研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌具有促進(jìn)腸上皮細(xì)胞再生、修復(fù)其病理性損傷和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用,可形成黏膜屏障、抑制病原微生物的定植。邵青玲等[17]研究表明,在飼料中添加多糖后,隱窩深度變淺,細(xì)胞成熟率和吸收功能增強(qiáng),腸黏膜修復(fù)能力增強(qiáng),絨毛高度與隱窩深度比值(絨隱比)大,小腸消化能力強(qiáng)。谷巍等[18]研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌通過增加腸道絨隱比增強(qiáng)小鼠免疫力,降低小鼠腹瀉率。本研究結(jié)果表明雞源性唾液乳桿菌可以促進(jìn)小鼠腸絨毛的生長、抑制腸隱窩的深度、增加絨隱比;炎性對照組的腸絨毛損傷嚴(yán)重,腸腔變大,隱窩加深;而拮抗組對此有明顯改善作用,緩減并修復(fù)了大腸桿菌對小鼠腸道黏膜的損傷,保護(hù)腸道健康。

4 結(jié)論

綜上所述,從新疆黑雞唾液中分離的唾液乳桿菌對大腸桿菌具有良好的體外抑制作用。對大腸桿菌感染的小鼠腸黏膜完整性和連續(xù)性具有很好的保護(hù)與修復(fù)作用,具有拮抗大腸桿菌感染的能力。