謝小林，王 勇，陳 猛，周 蓮，李成江，劉玉敏，朱紅惠

（1.廣東省科學(xué)院微生物研究所/華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物組學(xué)與精準(zhǔn)應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省微生物菌種保藏中心，廣州 510070；2.廣東博沃特生物技術(shù)有限公司，韶關(guān) 512026；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510642）

木霉菌是一類廣泛分布于土壤和植物體的真菌，目前已報(bào)道的木霉菌超過(guò)250 個(gè)種[1]，據(jù)報(bào)道對(duì)18個(gè)屬29 種植物病原真菌有拮抗作用[2]，因其具有適應(yīng)性好、定殖能力強(qiáng)和生防效果突出等特點(diǎn)，在植物病害防治上有著巨大的生防應(yīng)用潛力[3-5]。常見(jiàn)生防木霉菌包括哈茨木霉T.harzianum、綠色木霉T.viride、擬康氏木霉T.pseudokoningii、棘孢木霉T.Asperellum和長(zhǎng)枝木霉T.longibrachiatum等。

哈茨木霉作為一種目前在生物防治領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的農(nóng)用微生物菌種，具有抑制由尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌和炭疽菌等造成枯萎病、腐爛病、炭疽病等常見(jiàn)植物病害的良好效果[6-11]。木霉防治植物病原菌的主要表現(xiàn)為搶占生態(tài)位點(diǎn)，重寄生作用，分泌抑菌次級(jí)代謝產(chǎn)物和穿透病原菌并汲取其營(yíng)養(yǎng)[14-16]。近些年，由于化肥農(nóng)藥的過(guò)度使用，已造成水土污染、農(nóng)藥殘留和植物病害頻發(fā)的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題。生防微生物是一種改善土壤生態(tài)環(huán)境和防治植物病害的較好選擇[12,13]。哈茨木霉具有活性高、繁殖力強(qiáng)，價(jià)格低廉和生產(chǎn)方便的優(yōu)勢(shì)，在工業(yè)化生產(chǎn)上往往采用固態(tài)發(fā)酵方式來(lái)生產(chǎn)農(nóng)用微生物菌劑[17,18]。眾多學(xué)者對(duì)綠色木霉[19]、擬康氏木霉[20]、棘孢木霉[21,22]和長(zhǎng)枝木霉[23,24]等常見(jiàn)木霉菌的固態(tài)發(fā)酵工藝水平研究的報(bào)道較多且技術(shù)相對(duì)成熟，而關(guān)于哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵工藝條件優(yōu)化的研究報(bào)道相對(duì)較少，且總體發(fā)酵水平偏低，在工業(yè)化生產(chǎn)中往往存在菌種混亂、功能不強(qiáng)、雜菌率高和發(fā)酵水平低等凸出的問(wèn)題，嚴(yán)重阻礙了其工業(yè)化生產(chǎn)。因此，獲得優(yōu)良的哈茨木霉生防菌種、簡(jiǎn)易化操作程序和高水平發(fā)酵工藝對(duì)我國(guó)提高哈茨木霉工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)和促進(jìn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展有很大的幫助。

目前，工業(yè)化生產(chǎn)常用農(nóng)業(yè)廢棄物或農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品如麩皮、豆粕、谷殼、玉米粉、秸稈、果蔬殘?jiān)冗M(jìn)行農(nóng)用微生物菌劑的固態(tài)發(fā)酵。王巧河等[25]以廢菌棒為主要基質(zhì)，主要成分為食用菌渣中的木材、麩皮和豆粕，通過(guò)固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化，有效提高哈茨木霉菌體數(shù)，優(yōu)化后的產(chǎn)量為5.91×109CFU/g。曾慶才等[26]以養(yǎng)豬墊料為發(fā)酵物，通過(guò)固態(tài)發(fā)酵對(duì)哈茨木霉進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化，產(chǎn)量達(dá)3.86×109CFU/g。張昊楠等[27]利用制藥污泥發(fā)酵哈茨木霉，優(yōu)化后發(fā)酵菌體數(shù)量為3.27×109CFU/g。上述研究主要集中在固態(tài)發(fā)酵后哈茨木霉的菌體數(shù)量上，發(fā)酵水平均不高（低于百億級(jí)），其中發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量變化情況也并未作相關(guān)研究。本研究通過(guò)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)從番茄根際土壤分離篩選獲得一株生防哈茨木霉BWT1.221，從不同物料構(gòu)比、發(fā)酵條件方面進(jìn)行了哈茨木霉的固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化，分析了哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵菌物烘干前后菌體有效活菌數(shù)及菌體數(shù)量占比，目的是提高哈茨木霉的固態(tài)發(fā)酵水平，有效延長(zhǎng)哈茨木霉微生物菌劑的保存貨架期，以期為哈茨木霉工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：哈茨木霉BWT1.221 分離自番茄根際土壤，已保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，菌株保藏號(hào)為GDMCC No: 62833。

試劑：蔗糖、尿素、硫酸銨等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純（AR）；葡萄糖、蛋白胨、瓊脂等實(shí)驗(yàn)試劑均為生化試劑（BR），采購(gòu)于廣東環(huán)凱生物科技有限公司。麩皮、玉米粉、豆粕、黃豆粉和米糠均來(lái)自某糧食加工廠。

儀器：恒溫培養(yǎng)箱（SHP-080），廣東環(huán)凱生物科技有限公司；恒溫?fù)u床（HZQ-X300C），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)（BSC-1304ⅡA2），蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；干燥烘箱（LDO-9246A），上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；小型粉碎機(jī)（FTT-2500T），東莞市房太電器有限公司；電子游標(biāo)卡尺（MNT-150T），上海美耐特實(shí)業(yè)有限公司；電子天平（JJ200），常熟市雙杰測(cè)試儀器廠。

哈茨木霉培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基或斜面培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉16～20 g，自然水1 L。

種子液培養(yǎng)基（PDB，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，自然水1 L。

1.2 哈茨木霉BWT1.221 與植物病原菌的平板對(duì)峙試驗(yàn)及抑制率測(cè)定

將哈茨木霉BWT1.221 與植物病原菌分別轉(zhuǎn)接于PDA 固體平板上，于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃靜置培養(yǎng)5 d后，分別用打孔器（Φ=10 mm）沿菌落邊緣打1 塊菌餅，放入PDA 固體培養(yǎng)基中線對(duì)稱兩側(cè)（一個(gè)生防菌菌餅對(duì)應(yīng)一個(gè)病原菌菌餅），菌餅離PDA 培養(yǎng)基中線25 mm，共設(shè)置3 個(gè)重復(fù)處理，空白對(duì)照一側(cè)不接入哈茨木霉BWT1.221，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，測(cè)量對(duì)照與處理病原菌菌落直徑并計(jì)算哈茨木霉BWT1.221 拮抗植物病原菌的抑制率。

抑制率測(cè)定：參照文獻(xiàn)[28]方法測(cè)量。使用電子游標(biāo)卡尺分別測(cè)定病原菌空白對(duì)照和各處理組病原菌菌落的直徑，每組重復(fù)測(cè)量3 次，菌落抑制率（%）＝（SCK-S1）/SCK×100，其中SCK 表示病原菌空白對(duì)照的直徑距離（mm），S1 表示PDA 平板接種有哈茨木霉BWT1.221 和病原菌中的病原菌直徑距離（mm）。

1.3 有效活菌數(shù)的計(jì)數(shù)方法

參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《GB 20287-2006 農(nóng)業(yè)微生物菌劑》進(jìn)行有效活菌體計(jì)數(shù)測(cè)定。本文中哈茨木霉BWT1.221 的有效活菌數(shù)指的是能夠存活的哈茨木霉BWT1.221 總菌體數(shù)量，發(fā)酵菌物烘干前后菌體自定義為哈茨木霉BWT1.221 經(jīng)過(guò)固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后在烘干前和烘干后的菌體。烘干前后哈茨木霉BWT1.221 的有效活菌數(shù)的測(cè)定方法為：準(zhǔn)確稱取10.00 g 發(fā)酵烘干前后哈茨木霉BWT1.221 發(fā)酵物，裝入已經(jīng)高壓滅菌（121 ℃，30 min）載有90 mL 自然水、25 個(gè)直徑為0.5 cm 玻璃珠和0.1%吐溫80 的250 mL 三角瓶中，于200 r/min 恒溫?fù)u床自然條件下充分振蕩30 min，獲得哈茨木霉BWT1.221 菌懸液（菌體充分打散），通過(guò)平板稀釋涂布方法計(jì)數(shù)有效活菌數(shù)，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.4 哈茨木霉BWT1.221 的活化和種子液的制備

首先，將哈茨木霉BWT1.221 凍干管從保藏于4℃低溫冰箱中取出，移液槍吸取100 μL 無(wú)菌水于凍干管中溶解后，轉(zhuǎn)移至裝有PDA 培養(yǎng)基的平板中進(jìn)行涂布，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌體活化。待培養(yǎng)好后用打孔器打取菌餅，用接種環(huán)轉(zhuǎn)移至裝有PDA 培養(yǎng)基的平板上進(jìn)行復(fù)壯（恢復(fù)真菌繁殖性能）培養(yǎng)48 h。然后，將復(fù)壯培養(yǎng)后的哈茨木霉BWT1.221 菌餅用接種環(huán)移至載有300 mL PDB 培養(yǎng)基的1 L 三角瓶中，于28 ℃、200 r/min 恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)48 h，制備獲得種子液。

1.5 哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1 不同物料成分 物料成分分別設(shè)為全部麩皮、麩皮∶玉米粉=1∶1、麩皮∶豆粕粉=1∶1、麩皮∶黃豆粉=1∶1、麩皮∶米糠=1∶1 和米糠∶玉米粉=1∶1。參照文獻(xiàn)[29]方法，即分別在500 mL 三角瓶中裝入以上不同物料成分，按初始料水比=1∶0.7 加入自然水，均勻混拌、潤(rùn)料30 min，經(jīng)高壓滅菌冷卻后，添加5%哈茨木霉BWT1.221 種子液，充分搖蕩混合均勻后，靜態(tài)直立放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，待菌絲長(zhǎng)滿后充分搖碎物料，繼續(xù)發(fā)酵2 d 后放倒平行培養(yǎng)（直立三角瓶?jī)A斜90°進(jìn)行培養(yǎng)，增加物料碎屑與哈茨木霉菌體的表面接觸），每個(gè)處理重復(fù)3 次，發(fā)酵7 d 后進(jìn)行哈茨木霉BWT1.221 烘干前后菌體有效活菌數(shù)計(jì)數(shù)，菌體計(jì)數(shù)方法參照1.3（以下同）。

1.5.2 不同物料比例 以麩皮和玉米粉作為發(fā)酵基質(zhì)，麩皮:玉米粉的物料比例分別設(shè)為0.25∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1。按以上物料比例進(jìn)行哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵，其中初始料水比為1∶0.7，然后參照1.5.1 所述方法（以下同），進(jìn)行潤(rùn)料、滅菌、搖碎、接菌、發(fā)酵和烘干粉碎，發(fā)酵7 d 后，測(cè)定烘干前后菌體有效活菌數(shù)，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.5.3 不同料水比 料水比分別設(shè)為1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8、1∶0.9、1∶1。按以上料水比進(jìn)行哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵，其中麩皮∶玉米粉=0.25∶1，進(jìn)行潤(rùn)料、滅菌、搖碎、接菌、發(fā)酵和烘干粉碎，發(fā)酵7 d 后，測(cè)定烘干前后菌體有效活菌數(shù)，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.5.4 速效碳源 速效碳源（蔗糖）比例分別設(shè)為0、1%、2%、3%、4%、5%、6%（占干物料比重）。按以上速效碳源（蔗糖）比例添加進(jìn)行哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵，其中麩皮∶玉米粉=0.25∶1，料水比為1∶0.7，進(jìn)行潤(rùn)料、滅菌、搖碎、接菌、發(fā)酵和烘干粉碎，發(fā)酵7 d 后，測(cè)定烘干前后菌體有效活菌數(shù)，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.5.5 速效氮源 速效氮源（尿素）比例分別設(shè)為0、0.1%、0.2%、0.5%，速效氮源（硫酸銨）比例分別設(shè)為0.1%、0.5%、1%、2%。上述速效氮源比例均為占干物料比重。按以上速效氮源（尿素）比例和速效氮源（硫酸銨）比例添加進(jìn)行哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵，其中麩皮∶玉米粉=0.25∶1，料水比為1∶0.7，進(jìn)行潤(rùn)料、滅菌、搖碎、接菌、發(fā)酵和烘干粉碎，發(fā)酵7 d 后，測(cè)定烘干前后菌體有效活菌數(shù)，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.5.6 發(fā)酵物料組成正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)1.5.4 和1.5.5 單因素試驗(yàn)結(jié)果，以哈茨木霉BWT1.221 烘干前后菌體有效活菌數(shù)作為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)3 因素3 水平的正交實(shí)驗(yàn)，共進(jìn)行13 組（分組無(wú)重復(fù)），每組進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如表1 所示。

表1 發(fā)酵物料組成正交因子水平表Table 1 The composition factors of fermentation material

1.5.7 不同發(fā)酵溫度 發(fā)酵溫度分別設(shè)為22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃。按以上不同發(fā)酵溫度進(jìn)行哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵，其中麩皮∶玉米粉=0.25∶1，料水比為1∶0.7，蔗糖為5%，尿素和硫酸銨分別為0.15%和0.8%，進(jìn)行潤(rùn)料、滅菌、搖碎、接菌、發(fā)酵和烘干粉碎，發(fā)酵7 d 后，測(cè)定烘干前后菌體有效活菌數(shù)，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.5.8 不同發(fā)酵時(shí)間 發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)為4、5、6、7、8、9 和10 d。按以上不同發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵，其中麩皮∶玉米粉=0.25∶1，料水比為1∶0.7，蔗糖為5%，尿素和硫酸銨分別為0.15%和0.8%，發(fā)酵溫度為28 ℃，進(jìn)行潤(rùn)料、滅菌、搖碎、接菌、發(fā)酵和烘干粉碎，發(fā)酵7 d 后，測(cè)定烘干前后菌體有效活菌數(shù)，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.6 發(fā)酵物烘干和粉碎參數(shù)

將充分發(fā)酵完畢后的哈茨木霉BWT1.221 潮濕發(fā)酵物經(jīng)恒溫烘箱烘干，烘干參數(shù)為：在28 ℃恒溫烘箱中烘干24 h；其后使用小型粉碎機(jī)將烘干后的發(fā)酵物進(jìn)行粉碎，粉碎參數(shù)為：粉碎機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)2000 r/min，每隔10 s 粉碎1 次，其間冷卻后繼續(xù)粉碎，共粉碎3 次。

1.7 發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比

試驗(yàn)中發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比的定義為哈茨木霉BWT1.221 經(jīng)固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后烘干粉碎的發(fā)酵菌體有效活菌數(shù)占烘干前發(fā)酵菌體（除去水分因素）有效活菌數(shù)的百分比。

發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比（%）=[烘干后菌體有效活菌數(shù)（×109CFU/g）/烘干前菌體有效活菌數(shù)（×109CFU/g）]×[（1-烘干菌體含水比例（%））/（1-發(fā)酵物料含水比例）（%））]×（1-添加含水率）×100。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS v.19.0.1 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用One-way ANOVA 中Duncan 進(jìn)行多種比較分析。采用SPSS v.19.0.1 進(jìn)行正交設(shè)計(jì)和方差分析。采用OriginPro 2021 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈茨木霉BWT1.221 對(duì)不同植物病原菌的抑制效果

通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)，對(duì)病原菌直徑測(cè)量和抑制率計(jì)算（表2）結(jié)果表明，哈茨木霉BWT1.221 對(duì)常見(jiàn)的植物病原菌腐皮鐮刀菌、香蕉炭疽菌、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、禾谷鐮孢菌均具有抑制效果，其中哈茨木霉BWT1.221 對(duì)尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌的抑制效果最好，分別為61.06%和60.87%，與其他病原菌均達(dá)差異性顯著（P＜0.05），對(duì)禾谷鐮孢菌的抑制效果相對(duì)較低。

表2 哈茨木霉BWT1.221 對(duì)不同植物病原菌的生長(zhǎng)影響及抑制作用Table 2 Effect of T.harzianum BWT1.221 on growth and inhibition of plant pathogen

2.2 不同物料成分對(duì)哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵有效活菌數(shù)的影響

選取不同物料成分，比例均按1:1 混合進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果表明麩皮和玉米粉混合物發(fā)酵效果最佳（如圖1），烘干前和烘干后有效活菌數(shù)分別為3.19×109和3.34×109CFU/g，與其他物料成分均達(dá)差異性顯著（P＜0.05），發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比為61.59%；發(fā)酵效果最差的為單種物料麩皮，烘干前和烘干后有效活菌數(shù)分別為0.87×109和1.05×109CFU/g，但發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比最高，為71.27%。

2.3 不同物料比例對(duì)哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵有效活菌數(shù)的影響

以麩皮和玉米粉作為基礎(chǔ)發(fā)酵物料，通過(guò)不同物料比例進(jìn)行哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵結(jié)果如圖2，在麩皮:玉米粉=0.25:1 的比例下發(fā)酵效果最佳，烘干前和烘干后有效活菌數(shù)分別為4.00×109和4.28×109CFU/g，顯著高于其他物料比例處理（P＜0.05），發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比為62.94%。

圖2 不同物料比例對(duì)哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of different material proportions on solid fermentation of T.harzianum BWT1.221

2.4 不同料水比對(duì)哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵有效活菌數(shù)的影響

在一定的料水比例范圍內(nèi)，隨著料水比例的增加哈茨木霉BWT1.221 有效活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后降低的現(xiàn)象（圖3）。當(dāng)料水比為1∶0.7 時(shí)發(fā)酵菌數(shù)最高，烘干前和烘干后有效活菌數(shù)分別為4.23×109和4.51×109CFU/g，與料水比為1∶0.8 時(shí)差異不顯著（P＞0.05），但與其他料水比均差異顯著（P＜0.05），發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比為62.67%。

2.5 不同速效碳源（蔗糖）添加量對(duì)哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵有效活菌數(shù)的影響

速效碳源對(duì)哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵的影響結(jié)果如圖4 所示，在一定蔗糖添加量范圍內(nèi)隨著添加量的增加菌體數(shù)量不斷提高，當(dāng)蔗糖添加量達(dá)到5%時(shí)開(kāi)始緩慢提高，蔗糖添加量5%與6%之間菌體數(shù)量變化差異不顯著（P＞0.05），但與其他蔗糖添加量均呈差異性顯著（P＜0.05），烘干前有效活菌數(shù)分別為7.97×109和8.06×109CFU/g，烘干后分別為8.15×109和8.27×109CFU/g，發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比分別為60.18%和60.33%。

圖4 速效碳源蔗糖對(duì)哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of available carbon source on solid fermentation of T.harzianum BWT1.221

2.6 不同速效氮源（尿素和硫酸銨）添加量對(duì)哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵有效活菌數(shù)的影響

本試驗(yàn)研究了速效氮源尿素和硫酸銨添加量對(duì)哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵的影響，結(jié)果表明（如圖5），菌體數(shù)量變化均隨尿素和硫酸銨添加量增加而呈先升高后下降趨勢(shì)。尿素添加量0.1%時(shí)烘干前和烘干后有效活菌數(shù)分別為4.50×109和4.85×109CFU/g，硫酸銨添加量1%時(shí)，烘干前和烘干后有效活菌數(shù)分別為5.87×109和6.18×109CFU/g，與其他尿素或硫酸銨添加量均呈差異性顯著（P＜0.05），發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比分別為63.40%和61.93%；當(dāng)尿素和硫酸銨添加量分別達(dá)0.2%、1%后烘干前后菌體有效活菌數(shù)和菌體數(shù)量占比均驟降，這說(shuō)明在一定程度上高濃度速效氮源添加量會(huì)抑制哈茨木霉的生長(zhǎng)。綜上，速效氮源尿素和硫酸銨的添加量分別為0.1%和1%。

圖5 速效氮源對(duì)哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of available nitrogen source on solid fermentation of T.harzianum BWT1.221

2.7 發(fā)酵培養(yǎng)基組分正交實(shí)驗(yàn)

通過(guò)對(duì)哈茨木霉BWT1.221 發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳氮源成分進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表3），最佳發(fā)酵組合為A2B3C1，即蔗糖添加量為5%，尿素添加量為0.15%，硫酸銨添加量為0.8%，菌體數(shù)量最高，烘干前和烘干后有效活菌數(shù)分別為10.20×109和10.78×109CFU/g，經(jīng)發(fā)酵菌體進(jìn)行平板稀釋涂布后觀察不存在雜菌污染（雜菌率≤0.01%）。因此，添加適量碳氮源，有利于獲得最佳菌體有效活菌數(shù)量。

表3 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of fermentation medium

2.8 不同發(fā)酵溫度對(duì)哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵有效活菌數(shù)的影響

發(fā)酵溫度是影響哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵的最關(guān)鍵因素之一。試驗(yàn)結(jié)果表明（圖6），隨著發(fā)酵溫度的升高，烘干前后菌體有效活菌數(shù)和菌體數(shù)量占比均呈先上升后降低的趨勢(shì)，28 ℃時(shí)達(dá)到最高，與其他溫度變化均呈差異性顯著（P＜0.05），烘干前和烘干后菌體有效活菌數(shù)分別為9.74×109和10.17×109CFU/g，發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比為61.42%。

圖6 不同發(fā)酵溫度對(duì)哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.6 Effects of different fermentation temperatures on solid fermentation of T.harzianum BWT1.221

2.9 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵有效活菌數(shù)的影響

發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)短也會(huì)影響哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵水平。在一定時(shí)間范圍內(nèi)，哈茨木霉BWT1.221固態(tài)發(fā)酵烘干前后菌體有效活菌數(shù)和菌體數(shù)量占比均呈先升高后下降的趨勢(shì)（圖7），發(fā)酵第7 d 時(shí)，菌體生長(zhǎng)狀態(tài)呈平穩(wěn)水平，而9 d 后其烘干前后菌體有效活菌數(shù)和菌體數(shù)量占比均呈下降趨勢(shì)。發(fā)酵7 d 的哈茨木霉BWT1.221 烘干前和烘干后有效活菌數(shù)分別為9.83×109和10.36×109CFU/g，發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比為62.00%。在哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用中，綜合考慮木霉產(chǎn)量和發(fā)酵成本，選擇7 d 作為一個(gè)發(fā)酵周期。

圖7 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.7 Effects of different fermentation time on solid fermentation of T.harzianum BWT1.221

3 討論

哈茨木霉作為具有拮抗尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌和炭疽菌等常見(jiàn)植物病原菌優(yōu)越性能的生防菌種，廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的病害防治。目前，由于市場(chǎng)上生防功能較強(qiáng)的哈茨木霉資源匱乏，所制備獲得的微生物菌劑中生防菌種存在功能弱、污染嚴(yán)重以及發(fā)酵水平低下等凸出問(wèn)題，本研究通過(guò)平板對(duì)峙法篩選獲得一株生防菌株哈茨木霉BWT1.221，結(jié)合不同發(fā)酵物料和發(fā)酵條件進(jìn)行單因素和正交實(shí)驗(yàn)，研究了該菌株發(fā)酵條件優(yōu)化中烘干前后菌體有效活菌數(shù)及菌體數(shù)量占比的變化情況，旨在提高哈茨木霉的固態(tài)發(fā)酵水平和為工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)提供有力的科學(xué)數(shù)據(jù)參考。

功能微生物的固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化對(duì)于生防菌株在工業(yè)化生產(chǎn)的高量擴(kuò)繁和節(jié)本增效方面具有重要意義。發(fā)酵物料及培養(yǎng)條件的優(yōu)化是生防菌株固態(tài)發(fā)酵的關(guān)鍵步驟。在哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵物料的選擇對(duì)發(fā)酵水平有較大的影響，本研究采用來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉和營(yíng)養(yǎng)豐富[30]的麩皮、玉米粉等可利用農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品作為發(fā)酵基質(zhì)，經(jīng)過(guò)固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化后菌體數(shù)量提高3.23 倍，達(dá)到10.78×109CFU/g。與肖榮鳳等[31]利用養(yǎng)豬墊料及張昊楠等[27]利用制藥污泥進(jìn)行哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵的來(lái)源完全不同，其最終發(fā)酵的菌體數(shù)量分別為（4.33～4.46）×108和3.27×109CFU/g，明顯低于本研究發(fā)酵水平。王永東等[30]研究結(jié)果表明利用麩皮和玉米粉發(fā)酵哈茨木霉的最佳比例為3:1，與本研究最佳發(fā)酵比例不同，這可能是物料屬性（粗細(xì)、含水量等）、菌株特性和原料搭配等原因?qū)е隆?/p>

從本研究中可以看出，不同發(fā)酵條件對(duì)哈茨木霉BWT1.221 發(fā)酵水平有很大的影響。料水比是固態(tài)發(fā)酵的關(guān)鍵因子，低水分和高水分均會(huì)影響哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵烘干前后菌體有效活菌數(shù)和菌體數(shù)量占比。有研究表明，水分低時(shí)使得物料干燥無(wú)法滿足菌體萌發(fā)和菌絲的生長(zhǎng)，高水分容易造成物料成團(tuán)無(wú)法長(zhǎng)透整體，不容易產(chǎn)孢[26]。碳氮源的添加對(duì)哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)必不可少，碳源蔗糖和氮源尿素、硫酸銨均是市場(chǎng)上容易獲得的原料，王永東等[30]和茹水江[32]都認(rèn)為蔗糖是哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵最佳碳源，而且適當(dāng)?shù)奶荚幢壤軌虼龠M(jìn)菌體高產(chǎn)。氮源尿素和硫酸銨的添加量對(duì)哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵的影響較大，適當(dāng)?shù)奶砑幽軌虼龠M(jìn)菌體生長(zhǎng)，而過(guò)高的添加量則嚴(yán)重使得固態(tài)發(fā)酵烘干前后菌體有效活菌數(shù)和菌體數(shù)量占比驟降，這與周蓮等[29]對(duì)真菌固態(tài)發(fā)酵研究結(jié)果一致。低溫和高溫對(duì)哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵程度的影響巨大，低溫菌體生長(zhǎng)較慢，分生孢子產(chǎn)生量低，造成整體發(fā)酵菌體數(shù)量偏低；高溫對(duì)菌體生長(zhǎng)有抑制，由于生存環(huán)境產(chǎn)生逆境脅迫，大量菌體死亡，從而導(dǎo)致固態(tài)發(fā)酵烘干前后菌體有效活菌數(shù)和菌體數(shù)量占比也均呈現(xiàn)出較低的結(jié)果。隨著哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵中生存空間，營(yíng)養(yǎng)、水分及氧氣等生存物質(zhì)的不斷消耗，發(fā)酵到一定時(shí)間將不再繼續(xù)生長(zhǎng)。在固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，由于純菌種單獨(dú)發(fā)酵，嚴(yán)格控制發(fā)酵技術(shù)參數(shù)，基本無(wú)雜菌污染（雜菌率低于0.01%）。

本研究前期工作僅進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室初期的哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，生長(zhǎng)環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件均會(huì)產(chǎn)生影響。后期將集中對(duì)哈茨木霉高產(chǎn)分生孢子及抑菌物質(zhì)（次級(jí)代謝產(chǎn)物）的提取與分析進(jìn)行相關(guān)研究，將在工廠發(fā)酵車間進(jìn)行哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵小、中試試驗(yàn)以及在菌劑高塔噴霧和低溫超微粉碎技術(shù)實(shí)現(xiàn)突破，以期獲得產(chǎn)量大、貨架期長(zhǎng)的生防微生物菌劑產(chǎn)品，為農(nóng)作物的生物防治提供技術(shù)支撐。