文│李興帥 張興林 牛建蕊（臨沂大學）

左海莉（內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市九原區(qū)畜牧水產(chǎn)服務中心）

臧京帥（北京森康生物技術開發(fā)有限公司）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是危害當今養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。自1995年傳入至今，我國幾乎所有的省市都有PRRS的發(fā)生。流行病學和血清學調(diào)查結果表明，我國豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的感染率非常高。PRRSV還是豬呼吸道疾病綜合征（PRDC）的一個主要原發(fā)性病原。在飼養(yǎng)管理水平低、衛(wèi)生條件差的豬場常與PCV2、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌、豬偽狂犬病毒、豬附紅細胞體、鏈球菌等混合或繼發(fā)感染，這樣的豬群死亡率高，且多數(shù)豬場伴發(fā)母豬繁殖障礙。PRRSV感染后引起的病理及組織學變化往往不易與其他傳染病區(qū)分，所以PRRS的確診必須依賴于實驗室手段。與傳統(tǒng)診斷方法相比，熒光定量PCR檢測技術具有很多突出的優(yōu)點，引物與探針可以大量合成并長期保存，檢測速度快（僅需2～4小時），結果可靠，不易污染，避免散毒，而且敏感性要高于常規(guī)的PCR檢測方法，通過探針設計還能區(qū)分不同的毒株亞型，因而具有廣闊的應用前景。因此，本研究擬采用TaqMan熒光RT-PCR方法建立敏感性、特異性較好的PRRSV（美洲型）的檢測方法。

一、材料與方法

1.材料和主要試劑。

（1）菌毒株和質粒。PRRSV美洲經(jīng)典毒株VR-2332、PRRSV歐洲型毒株LV、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬瘟病毒（HCV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬鏈球菌（SS-2）、豬弓形體（TOX）、pGEM-T載體和TOP10感受態(tài)細胞均由本實驗室保存。

（2）病料來源。采集某發(fā)病豬場6頭病死豬不同組織臟器（包括肺、淋巴結、肝、腎、脾和豬肉等）。

（3）主要試劑。Taq DNA聚合酶、反轉錄酶M-MLV、RNA酶抑制劑、病毒RNA提取試劑盒、基因組提取試劑盒、體外轉錄試劑盒、DEPC水等試劑為南京諾唯贊公司產(chǎn)品；DTT為sigma公司產(chǎn)品。

2.引物和探針設計。選擇PRRSV（美洲型）N基因和3'端非編碼區(qū)的特定序列作為靶區(qū)域，在多重序列比對的基礎上，進行引物和探針設計，序列如下：

上游引物：5'-GCATGATGGGCT GGYATTC-3'；

下游引物：5'-CCCACACGGTCG CCCTAAT-3'；

探針：5'-［FAM］-ATGTGTGG TKAAYGGCACTGATTGACA-［TAM RA］-3'。

3.陰性對照和陽性對照的制備。

（1）陰性對照。陰性對照為PRRSV（美洲型）陰性豬組織樣品。用0.01摩爾/升的pH＝7.2 PBS緩沖鹽水制成20%懸液，高壓滅菌后分裝用作陰性對照。

（2）陽性對照。陽性對照為體外轉錄的非感染性RNA片段。將RTPCR擴增獲得的PRRSV美洲經(jīng)典毒株VR-2332長度為1640bp的ORF5-3'UTR基因克隆于pGEM-T載體，轉化TOP10感受態(tài)細胞，提取質粒DNA，經(jīng)PCR鑒定后獲得陽性重組質粒。酶切線性化之后，進行體外轉錄；將體外轉錄產(chǎn)物用DNase除去DNA模板后經(jīng)病毒RNA試劑盒提取并測定，即得到制備PRRSV（美洲型）陽性對照品所需的母液，陽性對照的濃度約為106拷貝數(shù)。

◎圖1 靈敏度檢測結果和標準曲線

4.菌毒株、病料中病毒核酸的提取。使用病毒DNA/RNA提取試劑盒分別提取PRRSV美洲型經(jīng)典毒株VR-2332、PRRSV歐洲型毒株LV、PRV、HCV、PCV2的病毒核酸；使用細菌DNA提取試劑盒提取SS-2、TOX的核酸。核酸溶于20微升DEPC水中，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

5.熒光RT-PCR反應體系和擴增條件。本研究建立25微升的反應體積，使用的模板為1.3.2陽性對照品母液，并根據(jù)試驗具體需要進行101～106的10倍稀釋。引物濃度從0.2～0.8微米以0.2微米為間距遞增，探針濃度0.2微米和0.1微米兩個梯度進行優(yōu)化，擴增條件為42℃/30分鐘；92℃/3分鐘；92℃/10秒，55℃/10秒，72℃/30秒，40個循環(huán)，每次循環(huán)的退火延伸時收集熒光。

6.靈敏度和特異性試驗。將滅活的PRRSV VR-2332（10-4.75TCID50/0.1毫升）作10倍稀釋后，提取病毒核酸后進行熒光RT-PCR的檢測，評價檢測方法的靈敏度，為實現(xiàn)對臨床樣品中病毒RNA量的相對定量，我們進一步對連續(xù)10倍稀釋的病毒RNA樣品進行檢測，采用熒光PCR儀軟件對Ct值和樣品中病毒RNA的量進行線性回歸分析，建立標準曲線，計算相關系數(shù)；對PRRSV（美洲型）、PRRSV（歐洲型）和PRV、HCV、PCV2、SS-2、TOX等常見豬病原進行熒光RT-PCR的檢測，評價其特異性。

7.臨床樣品的檢測。使用PRRSV（美洲型）RT-PCR檢測某發(fā)病豬場6頭病死豬（標記為1、2、3、4、5、6）不同的組織臟器（肺、淋巴結、肝、腎、脾和豬肉等）載毒量情況并進行分析。

二、結果

1.熒光RT-PCR反應體系的優(yōu)化。最優(yōu)熒光RT-PCR反應體系為2.5毫米dNTP2微升、上游引物（10微米）0.5微升、下游引物（10微米）0.5微升、探針（10微米）0.25微升、5×緩沖液（pH＝9）5微升、25毫米MgCl2 2微升、Taq酶（5單位/微升）0.5微升、MLV反轉錄酶（200單位/微升）0.5微升、RNA酶抑制劑（40單位/微升）0.25微升、模板10微升，補DEPC處理水至25微升。

2.靈敏度分析。對滅活的P R R S V V R-2 3 3 2 細胞毒培養(yǎng)物（10-4.75TCID50/0.1毫升）作10倍系列稀釋后進行檢測，檢測極限為105倍稀釋，近1個TCID50；對Ct值和樣品中病毒RNA的量進行線性回歸分析，建立標準曲線，結果顯示病毒RNA的量與試驗測得的Ct值呈線性相關，R2＝1，表明建立的方法可用于病毒RNA相對定量。結果數(shù)據(jù)詳見圖1。

3.特異性分析。對PRRSV（美洲型）、PRRSV（歐洲型）和PRV、HCV、PCV2、SS-2、TOX等常見豬病原進行熒光RT-PCR的檢測，由圖2可知，建立的方法與歐洲型PRRSV和其他細菌病毒均無交叉反應，特異性良好。

4.臨床樣品的檢測結果。病死豬的檢測結果詳見表1。由于本方法可以對病毒RNA進行相對定量，根據(jù)標準曲線Y＝-3.659X+35.08（X代表Ct值，Y代表病毒RNA的相對含量），可知Ct值越小，病毒含量相對越高。由表1可知，感染PRRSV（美洲型）后，同一頭豬的不同組織臟器中的含毒量不同。綜合分析發(fā)現(xiàn)，各組織中含毒量由高到低排序為肺、脾、腎、淋巴結、肝、豬肉。

表1 臨床樣品的檢測結果

三、討論

PRRSV分為美洲型和歐洲型兩種亞型，其核酸序列中最保守的區(qū)域是ORF1b和ORF7序列，很多學者根據(jù)這兩段保守性序列進行引物設計，建立了熒光RT-PCR檢測方法，并且通過設計不同的引物進行通用型檢測（同時檢測美洲型PRRSV和歐洲型PRRSV）或者特異性檢測（僅檢測其中一種病毒）。我國目前流行的PRRSV主要是美洲型病毒，因此，我們建立了特異性檢測美洲型PRRSV的熒光RT-PCR快速檢測技術。

在本研究中，通過對30多株在我國流行美洲型PRRSV序列的比對，在保守性核酸片段PRRSV N基因（ORF5）和3'UTR為靶序列基礎上設計合成了一對引物和探針，發(fā)現(xiàn)這對引物和探針擴增效率佳。使用建立的方法對常見的豬呼吸道疾病和繁殖障礙類疾病病原進行特異性試驗，檢測結果顯示，建立的PRRSV美洲型熒光RT-PCR方法檢測PRRSV（歐洲型）和PRV、HCV、PCV2、SS-2、TOX等豬常見的病毒細菌病均為陰性，說明該方法與其他病原無交叉反應，特異性良好。對PRRSV美洲型毒株VR-2332，應用建立的方法通過對倍比稀釋的細胞毒培養(yǎng)物進行檢測，結果表明，本方法的靈敏度可達1個TCID50。對臨床已知樣品的檢測結果也表明，熒光RTPCR方法檢測效果好，并且能檢測出豬肉中的微量RNA病毒。

本研究建立了特異性檢測美洲型PRRSV的熒光RT-PCR快速檢測技術，其引物探針保守性很高，能快速、準確、特異性地檢測臨床樣本中的PRRSV，還可以檢測病死豬肉中的微量PRRSV，在疫病防控和豬肉產(chǎn)品安全執(zhí)法檢驗中具有重要意義。同時可對豬場實時監(jiān)測，并有助于我國控制和凈化PRRS。