李家瑩，杜昭換，劉清玄，涂向輝，姜忠麗

沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧 沈陽 110034

0 引言

糙米是指稻谷經(jīng)脫殼后，經(jīng)少量加工甚至不加工所獲得的全谷粒米。發(fā)芽糙米是在一定條件下，所含大量酶被激活和釋放，含豐富的γ-氨基丁酸、多酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)。γ-氨基丁酸是一種重要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有改善機體睡眠質(zhì)量、降血壓等生理功效。多酚類物質(zhì)是一組植物中化學(xué)物質(zhì)的統(tǒng)稱，具有多個酚類基團(tuán)，對慢性病、心腦血管疾病及動脈硬化起預(yù)防作用。黃酮類物質(zhì)是多酚類化合物的一種，是抗氧化劑，能清除體內(nèi)氧自由基，有效預(yù)防心腦血管疾病。

發(fā)酵乳是以牛乳、羊乳或復(fù)原乳為原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵劑保溫發(fā)酵而制得乳制品，主要起調(diào)節(jié)腸道菌群和促進(jìn)胃腸蠕動作用。本試驗將發(fā)芽糙米及助眠物質(zhì)山藥、百合、茯苓、酸棗仁等添加到牛奶中，利用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌等混合菌發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵，采用單因素試驗和正交試驗分析產(chǎn)品感官指標(biāo)，并對最佳配方的發(fā)酵乳進(jìn)行生物活性成分分析，研制出既符合大眾口味，又具有助眠功能的發(fā)酵乳。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

五常糙米購自于五常市興旺米業(yè)有限公司；全脂滅菌乳購自于蒙牛乳業(yè)（沈陽）有限責(zé)任公司；乳酸菌酸奶復(fù)合菌發(fā)酵粉（麥芽糊精、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌）購自于北京川秀國際貿(mào)易有限公司；山藥粉購自于源興堂（安徽）健康產(chǎn)業(yè)有限公司；茯苓粉購自于棗莊百澤貿(mào)易有限公司；百合粉購自于咸寧市旺業(yè)農(nóng)產(chǎn)品有限公司；酸棗仁購自于亳州關(guān)東場久中藥材種植有限公司。

無水乙醇購自于天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；福林酚購自于上海金穗生物科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自于合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品購自于上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；碳酸鈉購自于天津市大茂化學(xué)試劑廠；亞硝酸鈉購自于沈陽市東興試劑廠；硝酸鋁購自于福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉購自于天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；硼酸購自于天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；鄰苯二甲醛購自于酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司；β-巰基乙醇、甲醇、乙腈購自于上海麥克林生化科技有限公司；乙酸鈉購自于沈陽市東興試劑廠。

1.2 主要儀器、設(shè)備和用具

恒溫培養(yǎng)箱SLI-700購自于上?；厶﹥x器制造公司；鼓風(fēng)干燥箱HG-9146A購自于上海精宏實驗設(shè)備有限公司；紫外輻射光線分光光度計UV-1200S購自于翱藝儀器（上海）有限公司；烤箱OMG 3/9 5*6購自于河北歐美佳食品機械有限公司；恒溫振動培養(yǎng)箱ZQBW-70購自于天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；H1850系列離心機購自于湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；LC-16高效液相色譜儀購自于島津儀器（蘇州）有限公司；另準(zhǔn)備了酸奶發(fā)酵罐、鍋、搪瓷盤、紗布。

1.3 工藝流程

發(fā)芽糙米風(fēng)味發(fā)酵乳工藝流程圖1。

圖1 發(fā)芽糙米風(fēng)味發(fā)酵乳工藝流程圖

1.4 操作要點

1.4.1 發(fā)芽糙米的制備

選取色澤晶瑩、顆粒飽滿的糙米，洗凈后，在20 ℃下用無菌水浸泡8 h。瀝水后均勻攤于盤內(nèi)并蓋上紗布，加入適量無菌水，置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽。當(dāng)芽長為0.5～1 mm時發(fā)芽結(jié)束，迅速將發(fā)芽糙米放在75～85 ℃熱水10 min進(jìn)行滅菌處理，然后將發(fā)芽糙米瀝干放入鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，65 ℃條件下干燥4 h。選擇芽長0.5～1.0 mm的發(fā)芽糙米，加入適量清水，鍋中煮制10 min后，放入烤箱內(nèi)175 ℃烘烤15 min，取出備用[1]。

1.4.2 助眠粉的制備

參考張薇等[2]、李萍等[3]文獻(xiàn)，確定助眠粉比例為酸棗仁粉∶山藥粉∶茯苓粉∶百合粉=1∶1∶3∶4，首先將酸棗仁用粉碎機打成粉末，按照比例將上述粉末混合，放入蒸鍋中蒸10 min，熟化粉末和殺菌。

1.5 試驗設(shè)計

1.5.1 單因素試驗

查閱發(fā)酵乳制作相關(guān)文獻(xiàn)及前期多次預(yù)試驗結(jié)果，確定助眠粉比例為酸棗仁粉、山藥粉、茯苓粉、百合粉按1 ∶1 ∶3 ∶4，發(fā)酵乳發(fā)酵溫度42 ℃，發(fā)酵時間10 h[4]。牛奶按100 mL計，發(fā)芽糙米添加量5 g、助眠粉添加量1.5 g、白砂糖添加量6 g、發(fā)酵劑添加量0.2 g為發(fā)酵乳的理想發(fā)酵參數(shù)，以感官為評價指標(biāo)，分別考察發(fā)芽糙米添加量、助眠粉添加量、白砂糖添加量、發(fā)酵劑添加量對發(fā)酵乳品質(zhì)影響?？紤]單一因素對發(fā)酵乳影響時，其他參數(shù)固定不變，以感官評價確定最優(yōu)參數(shù)。發(fā)芽糙米添加量設(shè)置為1、3、5、7、9 g/100 mL；助眠粉添加量設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/100 mL；白砂糖添加量設(shè)置為2、4、6、8、10 g/100 mL；發(fā)酵劑添加量設(shè)置為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/100 mL。

1.5.2 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用正交試驗對發(fā)酵乳配方進(jìn)行優(yōu)化。選取發(fā)芽糙米添加量、助眠粉添加量、白砂糖添加量為考察變量，以感官為評價指標(biāo)，進(jìn)行L9（33）正交試驗（表1）。

表1 正交因素水平表 單位：g/100 mL

1.6 感官評價標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳（GB 19302-2010）》對風(fēng)味發(fā)酵乳的感官要求，及樊秀花等[5]對發(fā)芽糙米酸奶的感官評定要求，制定感官評價標(biāo)準(zhǔn)（表2）。選擇有品鑒經(jīng)驗且具食品相關(guān)知識10 人，組成感官評定小組，進(jìn)行感官評價。檢驗方法：取適量試樣置于50 mL燒杯中，在自然光下觀察色澤和組織狀態(tài)。聞氣味，用溫開水漱口，品嘗滋味。

表2 感官評價標(biāo)準(zhǔn)

1.7 生物活性成分的測定

1.7.1 γ-氨基丁酸的測定

γ-氨基丁酸測定采用高效液相色譜法。首先配制10、20、50、100、200 μg/mLγ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。參照劉宗樂等[6]研究配制pH值=10.4的硼酸緩沖液及OPA衍生液。提取參照《稻米中γ-氨基丁酸的測定 高效液相色譜法（NY/T 2890—2016）》。檢測時，取1 mL硼酸緩沖液，加入0.2 mL OPA衍生液，再加入0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測液，衍生5 min后過膜進(jìn)樣，其衍生物保留時間如圖2所示，γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=53 788x+266 225，R2=0.999 1，如圖3所示。

圖2 50 mg/mL γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖

圖3 γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

液相色譜條件為：流速1.0 mL/min；波長228 nm；流動相A（乙腈）：流動相B（20 mmol/L乙酸鈉）=21∶79；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.7.2 總多酚的測定

多酚提取參考劉曉飛等[7]的方法并修改。取5 mL樣品，加入20 mL無水乙醇，65 ℃下恒溫振蕩90 min，7 000 r/min離心15 min，取上清液。再用相同方法提取沉淀物，最后合并上清液、離心，取上清液測量體積，備用。測定采用Folin-Ciocalteu法[8]，根據(jù)白瓊[9]的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.016x-0.002 6，R2=0.999 8，計算待測液中多酚含量，換算發(fā)酵乳中總多酚含量。

1.7.3 總黃酮的測定

總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線參照姜忠麗[10]等的方法。在510 nm下測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=11.968x-0.036 5，R2= 0.999 8，如圖4所示。提取參考張靜等[11]的方法并稍作修改。取10 mL樣品于離心管中，加入10 mL無水乙醇，振蕩5 min，7 000 r/min離心15 min。取上清液1 mL于25 mL容量瓶中，加入0.7 mL的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置5 min，加入0.7 mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻后靜置6 min，加入5 mL的1%氫氧化鈉溶液，用30%乙醇溶液定容至25 mL，靜置10 min。以加入0 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品并進(jìn)行上述定容操作的試劑為參比，在510 nm下測定吸光度，計算發(fā)酵乳中總黃酮含量。

圖4 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 白砂糖添加量對發(fā)酵乳感官的影響

隨著白砂糖添加量的增加，發(fā)酵乳感官評分出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象（圖5）。白砂糖添加量過低時，發(fā)酵乳味酸且凝乳效果不佳；白砂糖添加量過高時，發(fā)酵乳口感過甜。發(fā)酵乳在白砂糖添加量為6 g/100 mL時，感官評分達(dá)峰值。因此，發(fā)酵乳的白砂糖最優(yōu)添加量為6 g/100 mL。

圖5 白砂糖添加量對發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

2.1.2 助眠粉添加量對發(fā)酵乳感官的影響

助眠粉是由酸棗仁粉、山藥粉、茯苓粉、百合粉按照1∶1∶3∶4比例混合而成。隨著助眠粉添加量的增加，發(fā)酵乳感官評分出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象（圖6）。助眠粉添加量過低時，品嘗不到助眠粉的特有味道；助眠粉添加量過高時，粉末沉底且顆粒感過重，口感不佳。助眠粉添加量為1.5 g/100 mL時，達(dá)到感官最優(yōu)值。因此，發(fā)酵乳的助眠粉添加量為1.5 g/100 mL。

圖6 助眠粉添加量對發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

2.1.3 發(fā)芽糙米添加量對發(fā)酵乳感官的影響

隨著發(fā)芽糙米添加量的增加，感官評分先下降再上升之后再下降（圖7）。發(fā)芽糙米添加量過低時，發(fā)酵乳味道醇正，但沒有糙米特有味道；發(fā)芽糙米添加量過高時，入口糙米過多，影響口感。發(fā)芽糙米添加量為7 g/100 mL時，達(dá)到感官最優(yōu)值。因此，發(fā)酵乳的發(fā)芽糙米添加量7 g/100 mL。

圖7 發(fā)芽糙米添加量對發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

2.1.4 發(fā)酵劑添加量對發(fā)酵乳感官的影響

隨著發(fā)酵劑添加量的增加，感官評分先上升后下降，但變化趨勢不大（圖8），因此發(fā)芽糙米風(fēng)味發(fā)酵乳的發(fā)酵劑添加量為0.15 g/100 mL。

圖8 發(fā)酵劑添加量對發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

2.2 正交試驗結(jié)果

發(fā)芽糙米風(fēng)味發(fā)酵乳優(yōu)良口感的形成，可能與上述因素相互制約有關(guān)。因此在以上單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇影響最大的3個因素（即白砂糖添加量、助眠粉添加量、發(fā)芽糙米添加量）進(jìn)行正交試驗，優(yōu)化獲得最佳配方。正交試驗結(jié)果見表3。

表3 正交試驗結(jié)果

根據(jù)表3正交試驗的極差分析，各因素對產(chǎn)品的影響依次為：A（助眠粉添加量）＞B（發(fā)芽糙米添加量）＞C（白砂糖添加量）。

由表3可知，正交試驗中最高評分組合A1B2C2的感官評分為88.8分，高于最優(yōu)組合A1B1C2感官評分86.2分，因此選擇A1B2C2為最佳配比，即按100 mL計，助眠粉添加1 g、發(fā)芽糙米添加5 g、白砂糖添加6 g。

2.3 生物活性成分分析

經(jīng)測定，A1B2C2組合發(fā)酵乳中γ-氨基丁酸含量（0.096 76±0.001 43）mg/mL，總多酚含量（1.121 9±0.002 1）mg/mL，其中，總黃酮含量（0.407 1±0.001 3）mg/mL；A1B1C2組合發(fā)酵乳中γ-氨基丁酸含量（0.058 26±0.000 45）mg/mL，總多酚含量（0.982 9±0.000 8）mg/mL，其中，總黃酮含量（0.386 9±0.036 0）mg/mL；市售發(fā)酵乳中γ-氨基丁酸0 mg/mL，總多酚含量（0.543 4±0.000 7）mg/mL，其中，總黃酮含量（0.238 1±0.001 2）mg/mL。三種發(fā)酵乳的γ-氨基丁酸高效液相色譜圖見圖9～11。

圖9 A1B2C2 組合高效液相色譜圖

圖10 A1B1C2 組合高效液相色譜圖

圖11 市售發(fā)酵乳高效液相色譜圖

將A1B2C2、A1B1C2及市售發(fā)酵乳的生物活性成分含量對比，如表4所示。結(jié)合上述項目含量，A1B2C2明顯高于其他兩組，其γ-氨基丁酸含量（0.096 76±0.001 43）mg/mL，總多酚含量（1.121 9±0.002 1）mg/mL，總黃酮含量（0.407 1±0.001 3）mg/mL。

表4 三種發(fā)酵乳的生物活性成分對比 單位：mg/mL

3 結(jié)論

通過試驗確定發(fā)芽糙米風(fēng)味發(fā)酵乳最優(yōu)配方，即以100 mL牛奶計，添加助眠粉1 g、發(fā)芽糙米7 g、白砂糖6 g，接種0.2 g乳酸菌發(fā)酵劑，42 ℃發(fā)酵10 h。此時，發(fā)酵乳口感最佳，無沉淀、雜質(zhì)及乳清析出，口感細(xì)膩，糙米有嚼勁，酸甜適中。與市售酸奶相比，本產(chǎn)品生物活性成分γ-氨基丁酸、多酚類和黃酮類成分含量相對較高，具有很大商業(yè)潛力。