李 婕，曹學思，楊愛君，陳 欣，陳蓓蕾

廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東 廣州 510000

0 引言

黃曲霉毒素是由黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A.parasiticu）產生，具有很強的致癌、致畸、致突變作用的小分子代謝產物，它有B1、B2、G1、G2、M1和M2等6 種類型[1]。二呋喃環(huán)和香豆素是基本結構，可溶在如氯仿、乙腈、甲醇等有機溶劑中[2，3]。AFM1（黃曲霉毒素M1）較多殘留在動物的乳治、腎臟、肝臟和尿液中，以乳中最常見[4]，毒性與AFB1（黃曲霉毒素B1）相似。WHO（世界衛(wèi)生組織）將它列為ⅡB類致癌物[5]。FDA（美國食品藥品監(jiān)督管理局）規(guī)定，牛乳中AFM1殘留量有0.5 μg/kg的限量要求，我國也要求牛乳中AFM1含量限值要低于0.5 μg/kg[6]。

目前測定牛乳中黃曲霉毒素M1殘留量的方法有：色譜法、免疫化學法、光電化學法、光電發(fā)光法及ELISA檢測法等。在眾多檢驗方法中，AFM1殘留量的ELISA檢測法較便捷，迫切需要將此方法的不確定度具體量化，有助于檢測人員關注關鍵環(huán)節(jié)，使結果準確性提高[7]。本文用ELISA檢測法對乳粉中AFM1殘留量進行檢測，并量化試驗中帶入的不確定度。

1 檢驗原理

黃曲霉毒素M1ELISA檢測法的檢測原理是：試劑盒應用直接競爭酶聯(lián)免疫吸附原理。試劑盒孔洞內有AFM1特異抗體，在酶聯(lián)耦合物、樣品、標準品中的AFM1會競爭性與此特異抗體相結合。在規(guī)定反應時間后，洗液沖洗掉未結合部分。再加入顯色液進行顯色反應，最后加入終止液終止該反應過程。試驗所得孔板通過酶標儀測量吸光光度值。所得吸光光度值結果錄入計算機軟件，得到工作標準曲線，通過該曲線計算對應樣品的AFM1濃度結果。

2 材料與方法

2.1 儀器和材料

METTLER電子天平；SIGMA離心機；Thermo酶標儀；BRAND單、多道移液器；AHYG恒溫振蕩器；CRYSTAL旋渦振蕩器；Romer Labs AFM1 ELSA檢測試劑盒。

2.2 試驗步驟

2.2.1 試驗樣品預處理

（1）稱取待測樣乳粉；

（2）稀釋并均勻溶解待測樣乳粉；

（3）冷藏靜置并離心待測樣；

（4）取離心上清液與甲醇溶液按4∶1均勻混合，混合液待用。

2.2.2 樣品檢測

將ELISA檢測試劑提前復熱至室溫。

（1）在檢測用孔杯中加入酶聯(lián)偶合物試劑液；

（2）在上述孔杯內依次均勻移入標準品和樣品，并靜置反應60 min；

（3）60 min后，用洗劑重復洗各孔杯5 次，拍干孔杯內洗液；

（4）再加入底物顯色液，避光反應20 min；

（5）20 min后，加入酸類終止液終止反應，制成檢測微孔板；

（6）用酶標儀測量各孔吸光光度值并記錄，代入計算機軟件得出待測樣的濃度結果；

（7）判定結論：0 ng/kg標準品OD值需＞0.5，否則說明試劑已失效。

使用軟件計算結果時，其標準品曲線的線性相關系數(shù)（R）需為-0.990～-1.000。

3 結果計算數(shù)學模型

式中：W—待測乳粉中AFM1含量，單位μg/kg；

C—待測乳粉樣液中AFM1濃度，單位μg/L；

m—待測乳粉的稱量重量，單位kg；

f—待測乳粉樣液的稀釋倍數(shù)，f=10.8。

3.1 試驗結果

本試驗用同一萬分之一的電子天平，平行稱取同一質控樣乳粉（質控樣特性值：0.608 μg/kg，特性值區(qū)間0.385～0.830 μg/kg）6 份。根據(jù)上述試驗樣品預處理方法進行樣品預處理，根據(jù)樣品檢測步驟進行樣品檢測。所得檢驗微孔板，經同一酶標儀平行測定。在計算機運算軟件中代入各吸光度值，得到如下試驗結果（表1）。測定結果平均值為：0.480 μg/kg。

表1 試驗結果匯總表（n=6）

3.2 試驗中不確定度的來源分析

本次試驗中，造成結果不確定度的因素主要有：

（1）重復性測定引入的不確定度，此為A類不確定度。

（2）試驗中使用各規(guī)格移液器，因溫度和移液器自身誤差這2 個因素代入的不確定度，此為B類不確定度。

（3）ELISA試劑盒的試劑穩(wěn)定性及其質量造成試劑空白帶入的不確定度，此為B類不確定度。

（4）酶標儀工作性能，如靈敏性、穩(wěn)定性等帶入的不確定度，此為B類不確定度。

（5）天平稱量試驗乳粉時帶入的不確定度，此為B類不確定度。

（6）標準曲線帶入的不確定度，此為B類不確定度。

圖1 試驗中不確定度的來源分析

3.3 各項不確定度的量化分析計算

3.3.1 試驗重復性測定帶入的不確定度

由表1可知，本次試驗的標準偏差：

3.3.2 移液器容量誤差帶入的標準不確定度

（1） 200 μL移液器的容量誤差帶入的標準不確定度本次試驗的工作環(huán)境是室溫20±5 ℃，2.1×10-4/℃是水在20 ℃的膨脹系數(shù)。取矩形分布，則本次試驗中使用200 μL移液器移取100 μL待測乳粉，由于溫度效應，引起溶劑體積變化的標準不確定度為：

1.119 ×10-3/℃是甲醇在20 ℃的膨脹系數(shù)，本試驗工作環(huán)境是室溫為20±5 ℃，取矩形分布，則本次試驗中使用200 μL移液器移取100 μL甲醇溶液，溫度效應引起溶液體積變化的標準不確定度為：

查詢編號LE 202200065的移液器計量證書：可調移液器20～200 μL容量相對誤差測量結果擴展不確定度U=0.5%，k=2。本次試驗因使用200 μL移液器產生的標準不確定度為：（取矩形分布）

使用200 μL移液器移取水溶液樣品時由（u溫）和（u容）兩項因素帶進的標準不確定度為：

使用200 μL移液器移取甲醇溶液時由（u溫2）和（u容）帶進的標準不確定度為：

本試驗有3步涉及應用200 μL移液器進行溶液移取。其中水溶液的移取為2 步：100 μL乳樣的u（溫2）、u（容）在該過程互為獨立。加樣過程中本次試驗因200 μL移液器由這幾個因素帶進的標準不確定度為：

200 μL移液器在本次試驗帶進的相對標準不確定度：

（2）1 mL移液器的容量誤差帶入的標準不確定度

本次試驗的工作環(huán)境是室溫20±5 ℃，2.1×10-4/℃是水在20℃的膨脹系數(shù)。取矩形分布，本次試驗中使用1 mL移液器移取400 μL待測乳樣，溫度效應引起溶劑體積變化的標準不確定度為：

查詢編號LE 202200066的移液器計量證書中：可調移液器0.1～1 mL容量相對誤差測量結果擴展不確定度U=0.3%，k=2，本次試驗因使用1 mL移液器產生的標準不確定度為：（取矩形分布）

本試驗總共1 步涉及應用1 mL單道移液器進行溶液移取，u（溫）、u（容）在該過程互為獨立，加樣過程中本次試驗因1 mL移液器由這兩個因素帶進的標準不確定。那么，1 mL移液器在本次試驗過程中的使用，由其帶進的相對標準不確定度為：

（3） 10 mL移液器容量誤差帶入的標準不確定度

本次試驗的工作環(huán)境是室溫20±5 ℃，2.1×10-4/℃是水在20 ℃的膨脹系數(shù)。取矩形分布，本次試驗中使用10 mL移液器移取二級水，溫度效應引起溶劑體積變化的標準不確定度為：

查詢編號LE 202216773的移液器計量證書：可調移液器1～10 mL容量相對誤差測量結果擴展不確定度U=0.2%，k=2，本次試驗因使用10 mL移液器產生的標準不確定度為：（取矩形分布）

本試驗總共1 步涉及應用10 mL單道移液器進行二級水移取，u（溫）、u（容）在該過程互為獨立，加樣過程本次試驗因10 mL移液器由這兩個因素帶進的標準不確定度為：

10 mL移液器在此次試驗帶進的相對標準不確定度為：

3.3.3 試劑空白引入的不確定度

黃曲霉毒素M1ELISA檢測試劑是正規(guī)廠家按照國標要求生產的檢驗用試劑，因而由試劑空白造成的標準不確定度u（空）在本文中忽略不計。

3.3.4 由酶標儀性能帶入的相對標準不確定度

本次試驗使用同一酶標儀對試驗微孔板進行樣品測試，因此，不計因靈敏度造成的不確定度。查詢書編號NG 202301468的酶標儀計量證書：酶標儀的吸光度示值誤差的擴展不確定度U=0.012，k=2，本次試驗因使用該酶標儀所引入的標準不確定度為：（根據(jù)矩形分布）

3.3.5 樣品稱量帶進的不確定度

試驗使用同一臺萬分之一電子天平，分別稱取6 個平行的1 g待測乳粉樣品，因而不計靈敏度造成的不確定度。查詢證書編號LJ 202310184的電子天平計量證書：天平最大秤量示值誤差的測量結果擴展不確定度U=0.08 mg（70 g），k=2。本次試驗因使用該電子天平稱量待測樣乳粉帶入的標準不確定度為：（根據(jù)矩形分布）

本次樣品稱量帶入的相對標準不確定度為：

3.3.6 標準曲線帶入的不確定度

根據(jù)上述ELISA黃曲霉毒素M1試劑盒試驗步驟進行檢驗操作，將檢驗操作所得同一孔杯板用同一酶標儀進行兩次上機測量，讀取兩組試劑盒已知濃度標樣的對應吸光度A值。并用該組吸光光度值生成標準曲線，結果見表2。

表2 工作曲線測定結果表

錄入電腦的數(shù)據(jù)處理工作文檔進行計算，以標準溶液濃度的對數(shù)值Log（Conc.）為X軸，Logit（A/A0）值為Y軸。得標準曲線回歸方程：Y=2.468 1-1.185 9X，R=-0.998 3。通過該標準曲線可得，待測樣品奶粉還原稀釋液濃度對數(shù)平均值：LogX樣=1.663 9，X樣=46.12 ng/L 。得工作曲線的標準偏差為：

式中：Yi—表2中Logit（A/A0）各數(shù)值；

Xi—表2中Log（Conc.）各值；

a—表2中截距值2.468 1；

b—表2中斜率值-1.185 9；

n=12

計算本次試驗因標準曲線帶入的標準不確定度為：

式中：S（曲）：工作曲線的標準差；

b：表2中斜率，b=-1.185 9；

k：樣品的測量次數(shù)——2，；

n：標準品的測量總次數(shù)——12；

g0：LogX樣值——1.663 9；

g：表2中Log（Conc.）的平均值；

gi：表2中Log（Conc.）各值。

可得：

可得：本次試驗中工作（表3）曲線帶進的相對標準不確定度：

表3 各項不確定度匯總

4 各項不確定度結果對比分析

各項不確定度見表3。對本次乳粉中黃曲霉毒素M1殘留量ELISA法測定結果的不確定度影響較大的是由標準曲線擬合引入的相對標準不確定度。

4.1 合成標準不確定度

將上述各項不確定度量化計算結果合并，本次試驗的標準不確定度為：

其中0.480 μg/kg是上述本次試驗實測樣品AFM1含量平均值。

4.2 擴展不確定度

測定結果符合正態(tài)分布，按照置信水平95%，包含因子k=2，本次試驗乳粉樣品中黃曲霉毒素M1測定的擴展不確定度：

5 結論

本文試驗采用ELISA法測定乳粉樣品中黃曲霉M1含量結果應表示為0.480±0.023 μg/kg，k=2。其中對不確定度影響較大的因素是由標準曲線引入的不確定度。將來檢驗工作中，可酌情增加加標樣或質控樣測試次數(shù)，以減少其不確定度對測定結果帶來影響。