周治東,張麗艷,霍云龍,李海平,何雪蒨,張躍平*

(1.福建海洋研究所,福建 廈門 361013; 2.福建省海島與海岸帶管理技術(shù)研究重點實驗室,福建 廈門 361013;3.福建省海陸界面生態(tài)環(huán)境聯(lián)合重點實驗室,福建 廈門 361005;4.自然資源部第三海洋研究所,福建 廈門 361005)

波紋巴非蛤(Paratapesundulatas,舊稱:Paphiaundulatas)是我國東南沿海地區(qū)一種重要的經(jīng)濟貝類,多棲息于低潮區(qū)至水深10 m左右的泥砂底質(zhì)中,俗稱“花甲”、“油蛤”等[1]。在我國,波紋巴非蛤自然分布于浙江南部、福建、廣東、海南和廣西沿岸海域[2-3],其滋味鮮美,營養(yǎng)豐富,紋理清晰,色澤明艷,深受廣大消費者喜愛[4-6]。近年來,隨著市場需求量的增加,波紋巴非蛤的采捕壓力過大,波紋巴非蛤自然資源遭受了毀滅性的破壞[7]。因此,我國已在福建、廣西等東南沿海地區(qū)大力發(fā)展波紋巴非蛤養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)[8-9]。然而,近年來福建閩南沿海波紋巴非蛤的淺海增養(yǎng)殖大量采用廣西外來苗種,種群結(jié)構(gòu)受人為活動的干擾嚴(yán)重,這種非自然的交流導(dǎo)致不同種群間進(jìn)行基因交流,致使本地波紋巴非蛤的種質(zhì)資源遭受破壞,遺傳多樣性保護(hù)迫在眉睫[10]。

迄今為止,國內(nèi)有關(guān)波紋巴非蛤形態(tài)學(xué)[7,10]、分子遺傳學(xué)[10]的研究較少,而有關(guān)微衛(wèi)星分子標(biāo)記的研究多集中在微衛(wèi)星引物開發(fā)方面[11]。本研究對采集于福建閩南地區(qū)及廣西北海地區(qū)的波紋巴非蛤種群樣品進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子遺傳學(xué)研究,探討不同群體間的形態(tài)差異和遺傳分化程度,以期為波紋巴非蛤遺傳特性研究、種質(zhì)資源的保護(hù)及養(yǎng)殖繁育提供理論和方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

波紋巴非蛤樣品于2020年12月至2021年12月采自福建閩南地區(qū)(廈門同安灣海域、云霄東山灣海域、惠安大港灣海域)及廣西北海(北部灣海域),以下簡稱廈門群體、云霄群體、惠安群體、北海群體,每個群體樣品數(shù)量不少于30枚(圖1)。隨機選取外殼完好的波紋巴非蛤個體進(jìn)行形態(tài)測量,測量完畢后每個群體隨機挑選24枚取其斧足及閉殼肌用95%的酒精固定,以備后續(xù)分子遺傳學(xué)研究。

圖1 4個群體波紋巴非蛤樣品外殼形態(tài)Fig. 1 Shell shape of four Paratapes undulatas populations

1.2 形態(tài)學(xué)測量方法

采用精度為0.01 mm的游標(biāo)卡尺對波紋巴非蛤的形態(tài)特征參數(shù)進(jìn)行測量:分別獲得殼長(Ls)、殼高(Hs)、殼寬(Ws)、韌帶長(Lh)、前腹緣距(Af)、后腹緣距 (Ab)6個形態(tài)學(xué)參數(shù)(圖2);用精確至0.001 g的電子天平稱取殼質(zhì)量(Ms),共計847個測量數(shù)據(jù)。

圖2 波紋巴非蛤形態(tài)學(xué)測量參數(shù)示意圖Fig. 2 Diagram of morphological measurement parameters of Paratapes undulatas

1.3 分子遺傳學(xué)實驗方法

采用天根海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒提取其基因組DNA,基因組DNA于4 ℃保存。本研究從已發(fā)表的波紋巴非蛤微衛(wèi)星引物中篩選出10對擴增結(jié)果穩(wěn)定且多態(tài)性較好的引物[10-12](表1),用于后續(xù)分析。

PCR反應(yīng)體系為25 μL,包括17.15 μL雙蒸水、2.5 μL 10×PCR Buffer、1 μL模板DNA(50 ng/μL)、2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)、1 μL反向引物、1 μL熒光標(biāo)記的M13-R、0.1 μL含有M13-R的正向引物、0.25 μL Taq酶。PCR反應(yīng)程序:95 ℃變性5 min;95 ℃ 45 s;退火(54～64 ℃)45 s;72 ℃ 45 s;循環(huán)30次;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后,將PCR產(chǎn)物送青島派森諾基因科技有限公司進(jìn)行基因分型[13-16]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)計算分析

將各性狀測量值處理成5個比例數(shù)據(jù)(Hs/Ls、Ws/Ls、Lh/Ls、Ms/Ls、Af/Ab)作為校正值對各群體的形態(tài)學(xué)差異進(jìn)行計算分析。采用SPSS 13.0軟件計算和分析,利用聚類分析、主成分分析和判別分析等方法對4個群體的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行比較。其中聚類分析采用歐式距離的最長距離系統(tǒng)聚類法;主成分分析將5個比例性狀計算得到兩個綜合性指標(biāo),即兩個互不關(guān)聯(lián)的主成分;判別分析對所有樣本進(jìn)行逐個判別,計算判別準(zhǔn)確率及綜合判別率[17-20]。

1.4.2 分子遺傳學(xué)數(shù)據(jù)分析

使用GeneMarker 2.2.0對熒光PCR基因分型數(shù)據(jù)進(jìn)行讀取,并輔以人工矯正。使用PopGene軟件統(tǒng)計每個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量指數(shù)、觀測雜合度以及期望雜合度[21]。使用F-stat 2.9.3軟件計算每對群體間遺傳分化指數(shù),同時進(jìn)行1 000次置換檢驗分析其顯著性[22]。使用Population 1.2軟件計算群體之間的遺傳距離,并使用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)基于遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[23]。使用LEA包對進(jìn)行Structure分析[24]。通過BOTTLENECK 1.2.02軟件采用無限等位基因模型(IAM)、逐步突變模型(SMM)和雙相模型(TPM)3種模型檢測各群體是否經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)[25]。若等位基因頻率分布為L型,說明所檢測的群體近期沒有經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)事件。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)研究結(jié)果

2.1.1 形態(tài)參數(shù)測量比較

4個波紋巴非蛤群體的表觀形態(tài)特征參數(shù)測量結(jié)果如表2所示。對測量數(shù)據(jù)進(jìn)行F檢驗表明:各群體除殼長外的6個度量形態(tài)特征均與殼長呈顯著正相關(guān)(P<0.01);且群體間各個度量形態(tài)特征數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.01)。

表2 4個波紋巴非蛤群體各參數(shù)測量結(jié)果Tab. 2 Summary of measurements of various parameters of four Paratapes undulatas populations

2.1.2 聚類分析

對4個群體樣本的5個形態(tài)特征校正值進(jìn)行聚類分析結(jié)果表明,北海與惠安群體形態(tài)特征最為接近,二者首先聚類,后與云霄群體聚類,而廈門群體則自成一支(圖3)。

圖3 波紋巴非蛤4個群體形態(tài)特征的聚類分析Fig. 3 Cluster analysis of four Paratapes undulatas populations

2.1.3 主成分分析

對4個群體樣本的5個比例性狀進(jìn)行主成分分析,得到兩個主成分PCI和PC2,由表3可知,:PC1的貢獻(xiàn)率為36.134%,PC2的為21.443%,二者累積貢獻(xiàn)率僅為57.577%。在PC1中,Ms/Ls的貢獻(xiàn)最大,第二為Ws/Ls;在PC2中 ,Hs/Ls和Af/Ab貢獻(xiàn)最大。這兩個主成分的累計貢獻(xiàn)率未達(dá)到85.0%,說明波紋巴非蛤不同群體間的形態(tài)差異難以用幾個相互獨立的因子來解釋。

表3 波紋巴非蛤形態(tài)特征的主成分的負(fù)荷值和貢獻(xiàn)率Tab. 3 Contribution and load of principal components on morphological characteristics of Paratapes undulatas

PC1與PC2的散點圖如圖4所示。由圖4可見4個群體中北海與惠安群體有較多的重疊區(qū)域,說明二者在形態(tài)參數(shù)上較為接近,云霄群體與廈門群體均獨立分布,較少與其余樣品重疊,區(qū)分明顯。該結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致。

圖4 4個波紋巴非蛤群體的第一、二主成分的散布圖Fig. 4 Scatter diagram for PC1 and PC2 of four Paratapes undulatas populations

2.1.4 判別分析

利用逐步判別分析法篩選出5個性狀比例的特征值,建立4個群體的判別函數(shù),5個變量X1、X2、X3、X4、X5分別代表Hs/Ls、Ws/Ls、Lh/Ls、Ms/Ls與Af/Ab。表3為判別函數(shù)的各項系數(shù)及常數(shù)項。4個群體的判別公式如下:

Y廈門=1 134.881X1+899.281X2+373.775X3

-207.158X4+185.212X5-587.362

(1)

Y云霄=1 141.218X1+871.409X2+389.677X3

-27.383X4+165.181X5-585.651

(2)

Y惠安=1 119.267X1+880.459X2+393.719X3

+144.492X4+167.024X5-597.905

(3)

Y北海=1 148.237X1+882.468X2+393.311X3

-42.030X4+165.234X5-592.944

(4)

判別分析結(jié)果如表4所示:判別準(zhǔn)確率P1為43.3%～93.5%;判別準(zhǔn)確率P2為44.8%～88.0%;4個群體的綜合判別率為 66.1%。

表4 波紋巴非蛤4個群體的判別分析結(jié)果Tab. 4 Discriminant results of four populations of Paratapes undulatas

2.2 分子遺傳學(xué)研究結(jié)果

2.2.1 遺傳多樣性

本研究采用10對微衛(wèi)星分子引物對4個波紋巴非蛤群體96個個體進(jìn)行遺傳多樣性分析。由表5可以看出,4個群體的遺傳差異較小,平均等位基因數(shù)范圍為6.40～6.60對,平均有效等位基因數(shù)范圍為3.18～3.51對,平均多態(tài)信息含量范圍為1.29～1.40,平均觀測雜合度范圍為0.39～0.50,平均期望雜合度范圍為0.62～0.70。

表5 波紋巴非蛤4個群體的遺傳多樣性參數(shù)Tab. 5 Genetic diversity parameters of four Paratapes undulatas populations

綜合各遺傳多樣性指數(shù)來看,4個群體中惠安群體的遺傳多樣性最高(平均期望雜合度為0.68,平均多態(tài)信息含量指數(shù)為1.40),云霄群體的遺傳多樣性最低(平均期望雜合度為0.62,平均多態(tài)信息含量指數(shù)為1.29)。

2.2.2 遺傳結(jié)構(gòu)

4個波紋巴非蛤群體間的遺傳分化指數(shù)范圍為0.00～0.03,均呈現(xiàn)較低的狀態(tài),表明各群體的遺傳分化水平較弱。群體間遺傳距離范圍為0.08～0.11,云霄群體與其余3個群體間的遺傳距離均為最低(0.08),廈門群體與北海群體間的遺傳距離最大,為0.11,廈門群體與惠安群體間的遺傳距離為0.09(表6)。

表6 波紋巴非蛤4個群體間遺傳分化指數(shù)與遺傳距離Tab. 6 Genetic differentiation index and genetic distance among four populations of Paratapes undulatas

基于4個波紋巴非蛤群體之間的遺傳距離構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5),可知北海群體首先與惠安群體聚類,再與廈門和云霄群體聚類,未檢測到與地理位置相對應(yīng)的譜系結(jié)構(gòu)。

圖5 基于遺傳距離構(gòu)建的四個波紋巴非蛤群體NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 NJ phylogenetic tree of four Paratapes undulatas populations based on genetic distance

2.2.3 自由交配估計

運用Structure軟件,根據(jù)等位基因頻率不相關(guān)假設(shè)(allele frequencies independent assumption)[26],進(jìn)一步確認(rèn)波紋巴非蛤群體遺傳結(jié)構(gòu)。首先假設(shè)自由交配組群(K)可能為1～9,對每個假設(shè)自由交配組群進(jìn)行50次獨立重復(fù)運算,最后使用最小二乘法估算出最佳自由交配組群(最小交叉熵值)為K= 1(圖6)。

圖6 波紋巴非蛤四個群體的交叉熵值Fig. 6 Cross entropy of four Paratapes undulatas population

2.2.4 瓶頸效應(yīng)檢測分析

利用BOTTLENECK軟件檢測波紋巴非蛤4個群體近期是否經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)事件(表7)。首先基于IAM、TPM和SMM 3種不同模型進(jìn)行Wilcoxon檢驗。結(jié)果顯示在TPM模型下,所有波紋巴非蛤群體均未出現(xiàn)偏離突變-漂變平衡的現(xiàn)象,而在IAM模型下北海群體存在偏離現(xiàn)象,在SMM模型下廈門與云霄群體出現(xiàn)偏離現(xiàn)象。其次,Mode shift檢驗結(jié)果顯示,4個群體的等位基因分布頻率均呈正常的L型分布。TPM是介于IAM和SAM之間的模型,其突變大多為逐步突變,TPM和SMM模型描述的位點突變模式更接近微衛(wèi)星的突變機理,因此TPM模型更適合微衛(wèi)星數(shù)據(jù)的分析[27]。綜上所述,4個波紋巴非蛤群體近期未經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)事件。

表7 基于3種模型的波紋巴非蛤4個群體的瓶頸效應(yīng)檢測Tab. 7 Bottleneck effect detection of four Paratapes undulates populations based on three models

3 討論

3.1 4個自然種群波紋巴非蛤形態(tài)差異比較分析

貝類養(yǎng)殖已成為海洋經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)中重要的一環(huán),其遺傳學(xué)相關(guān)研究也越來越受到生物學(xué)家的重視[28]。研究表明,在基因交流阻隔的情況下,同一種類生物的不同地理群體也會出現(xiàn)較明顯的遺傳差異[29]。我們分析了福建閩南地區(qū)及廣西北海地區(qū)的波紋巴非蛤地理群體的多種形態(tài)學(xué)參數(shù),可知惠安與北海群體的形態(tài)差異最小,且與云霄、廈門群體之間均存在著一定的形態(tài)差異。這種差異一方面可能是由地理因素、環(huán)境條件決定的,但聚類分析與主成分分析結(jié)果均表明惠安地區(qū)與北海地區(qū)的差異遠(yuǎn)比云霄和廈門小。造成這一結(jié)果的原因可能是惠安大港灣近岸海域近年來大量引進(jìn)北海地區(qū)波紋巴非蛤種苗,從事水產(chǎn)增養(yǎng)增殖活動。這些人為商業(yè)活動可能使群體間種質(zhì)交叉增多,向當(dāng)?shù)刈匀缓^(qū)釋放,從而大大增加了群體間基因雜交的概率[30]。另外,形態(tài)差異除了種質(zhì)本身的特性外,與餌料種類、水文水質(zhì)、底質(zhì)類型等因素也有較大關(guān)系[31-32]。

3.2 4個自然種群波紋巴非蛤分子遺傳學(xué)比較分析

傳統(tǒng)的貝類遺傳學(xué)研究集中在其形態(tài)指標(biāo)上,但形態(tài)參數(shù)可能存在誤差,并不能完全準(zhǔn)確地反映物種的群體特性,因此需要結(jié)合分子生物學(xué)方法,獲得更加真實穩(wěn)定的遺傳學(xué)研究結(jié)果[33]。我們用分子生物學(xué)手段調(diào)查了福建閩南地區(qū)及廣西北海的波紋巴非蛤群體樣本,其遺傳多樣性均呈現(xiàn)較高的水平(多態(tài)信息含量指數(shù)>0.5),與駱軒等的研究結(jié)果[10]基本持平,說明波紋巴非蛤群體仍具有較高的環(huán)境適應(yīng)能力和進(jìn)化潛力。波紋巴非蛤能維持如此高的遺傳多樣性,除了與其有大量的有效補充群體外,還與其未經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)有關(guān)。3種突變模式對波紋巴非蛤的瓶頸效應(yīng)檢驗均未發(fā)現(xiàn)雜合過?，F(xiàn)象,等位基因頻率均呈正常的L型分布,在群體擴張的過程中等位基因丟失的概率較小,較多的遺傳突變得以保存[34]。隨著波紋巴非蛤資源的不斷破壞和國內(nèi)外需求的不斷增加,養(yǎng)殖無法僅依靠海區(qū)捕撈的天然苗種得到滿足,人工繁育大量興起[35]。在后期養(yǎng)殖過程中,波紋巴非蛤作為主要的海水養(yǎng)殖貝類在不同養(yǎng)殖區(qū)間被頻繁的人為引種、貿(mào)易及增殖放流。而在形態(tài)學(xué)和分子遺傳學(xué)聚類分析時,發(fā)現(xiàn)廈門群體均獨立形成一支,遺傳分化指數(shù)和遺傳距離廈門群體也略高于其他群體,這可能與廈門海域有不少國家級自然保護(hù)區(qū),禁止捕撈和灘涂養(yǎng)殖,該群體可能保留了更多的原始遺傳信息有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究中4個波紋巴非蛤群體間遺傳分化微弱,自由交配估計檢驗也顯示所有群體為1個自由交配組群;NJ系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果未檢測到與地理位置相對應(yīng)的譜系結(jié)構(gòu)。相較于沿岸流輸送波紋巴非蛤浮游期幼蟲進(jìn)行群體間的基因交流,不同地區(qū)間的人為引種、貿(mào)易及增殖放流等活動可能是造成波紋巴非蛤不同種群間基因頻繁交流的主要原因,其中廈門群體則保留了更多的原始遺傳信息。綜合形態(tài)學(xué)和分子遺傳學(xué)結(jié)果來看,在滿足養(yǎng)殖需求的前提下,仍需要保護(hù)本地波紋巴非蛤的種質(zhì)資源,防止外來群體的“生態(tài)入侵”。