阮峻，李炫瑩，陳國材

骨髓炎（osteomyelitis，OM）是由病原微生物感染引起的骨組織壞死性疾病，金黃色葡萄球菌是其最常見的致病菌［1］。OM 的治療包括長療程的抗生素治療和壞死感染組織的手術清創(chuàng)。近年來，抗生素的過度使用導致耐藥菌株的出現(xiàn)，逐漸降低了抗生素的療效，且長期全身使用大劑量抗生素會導致嚴重的不良反應［2］。有研究報道，金黃色葡萄球菌毒力蛋白SpA 可直接與成骨細胞結合，抑制成骨細胞增殖，誘導其凋亡，進而抑制其礦化，并通過促進破骨細胞活化誘導骨吸收，導致病理性骨質(zhì)流失［3］。因此，研究細菌性OM 骨質(zhì)流失的分子機制對于治療OM 具有重要意義。楊梅苷是一種類黃酮化合物，廣泛存在于多種天然植物中，具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等生物活性［4］。楊梅苷還可通過促進血管生成來治療骨骼相關疾?。?］。Xi等［6］發(fā)現(xiàn)楊梅苷可以通過抑制破骨細胞生成來減少大鼠卵巢切除術誘導的骨質(zhì)流失。然而，楊梅苷能否改善細菌性OM引起的骨質(zhì)流失還鮮見報道。有研究報道，促進骨形成和血管生成是加速骨修復的重要方式［7］。血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）/基質(zhì)細胞衍生因子-1（stromal cellderived factor，SDF-1）/C-X-C 型趨化因子受體4（CX-C chemokine receptor 4，CXCR4）通路是重要的血管生成相關通路。Xiang 等［8］發(fā)現(xiàn)，激活VEGFA/SDF-1/CXCR4 通路可促進血管生成。Huang 等［9］發(fā)現(xiàn)，激活VEGFA/SDF-1/CXCR4 信號通路可促進內(nèi)皮細胞血管生成，進而加速糖尿病足小鼠傷口愈合。本研究旨在探討楊梅苷可否通過激活VEGFA/SDF-1/CXCR4 信號通路促進血管生成及骨形成，進而改善細菌性OM大鼠骨缺損。

1 材料與方法

1.1 動物 90 只SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，7周齡，購自貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（黔）2018-0001。所有大鼠飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK（粵）2022-0002；飼養(yǎng)條件為每日光照、黑暗12 h 交替進行，溫度23～25 ℃，濕度（50±5）%。本實驗符合動物實驗的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器 楊梅苷購自北京凱詩源生物科技有限公司；VEGFA/SDF-1/CXCR4信號通路抑制劑PX-478購自MedChemExpress LLC；金黃色葡萄球菌ATCC 25923 懸液購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、IL-17 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自上海酶研生物科技有限公司；骨堿性磷酸酶（bone alkaline phasphatase，BALP）、骨鈣素（osteocalcin，BGP）、Ⅰ型膠原C 端肽（Cterminal telopeptide of typeⅠcollagen，CTX-Ⅰ）ELISA 試劑盒購自上海富雨生物科技有限公司；巧克力培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；蘇木精伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒購自北京Solarbio 公司；兔抗大鼠CD31 抗體、VEGFA抗體、SDF-1抗體、CXCR4抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗和山羊抗兔IgG H&L 二抗（Alexa Fluor?647）購自英國Abcam。TG16G臺式高速離心機（湖南凱達科學儀器有限公司）；BX51 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；iMark680 多功能酶標儀、ChemiDoc?XRS凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 方法

1.3.1 分組、造模與干預 將大鼠按照隨機數(shù)字表法分為假手術組、OM組、楊梅苷組、PX-478組、楊梅苷+PX-478組，每組18只。除假手術組外，其余大鼠參照文獻［10］通過雙側脛骨近端骨缺損來制備細菌性OM 大鼠模型（72 只）。將大鼠麻醉，使其仰臥在手術臺上，隨后用剪刀在膝關節(jié)下沿脛骨內(nèi)側切一小口，剝開骨膜，使脛骨上端暴露，在膝關節(jié)下方2 mm 處取骨前內(nèi)側面骨皮質(zhì)形成骨缺損，最后插入含有金黃色葡萄球菌懸液的棉條。假手術組除不插入含有金黃色葡萄球菌懸液的棉條外，其余操作步驟相同。大鼠均用骨蠟封閉殘腔，縫合創(chuàng)口。

楊梅苷組按照50 mg/（kg·d）［11］的劑量通過腹腔注射楊梅苷；PX-478組腹腔注射25 mg/（kg·d）PX-478［12］；楊梅苷+PX-478組通過腹腔注射50 mg/（kg·d）楊梅苷及25 mg/（kg·d）PX-478；均連續(xù)治療12 周。OM 組、假手術組通過腹腔注射等體積生理鹽水。

1.3.2 指標觀察以及樣本采集 藥物治療結束24 h后，觀察并計數(shù)達到甲級創(chuàng)口愈合程度的大鼠數(shù)量［10］；麻醉后測量各組大鼠肛溫，用采血針從腹主動脈采血3 mL 用于ELISA；采血完成后，處死大鼠，采用隨機數(shù)字表法每組抽取6只大鼠病灶周圍骨組織用于細菌負荷測定，另隨機每組抽取6只大鼠病灶周圍骨組織用于病理切片觀察和免疫熒光染色，每組剩余6 只大鼠病灶周圍骨組織保存在-80 ℃冰箱中，用于Western blot實驗。

1.3.3 ELISA 法檢測血清炎性因子以及骨代謝指標 采用ELISA 試劑盒檢測血清IL-6、IL-1β、IL-17 以及BALP、BGP、CTX-Ⅰ水平。

1.3.4 細菌負荷檢測 將病灶周圍組織用研磨儀進行勻漿后，用巧克力培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，最后計數(shù)細菌菌落。

1.3.5 HE染色檢測大鼠病灶周圍骨組織病理變化 取大鼠病灶周圍組織固定于4%多聚甲醛中，用10% EDTA（pH=7.4）脫鈣21 d，經(jīng)脫水、包埋、切成5 μm 橫切面的石蠟切片，HE染色后在光學顯微鏡下觀察病灶周圍組織病理變化。

1.3.6 免疫熒光染色檢測病灶周圍骨組織CD31 陽性表達情況 取病灶周圍組織石蠟切片，將石蠟包埋的切片裝在載玻片上經(jīng)脫蠟、脫水、洗滌后，與CD31 一抗在4 ℃下孵育過夜。用PBS 洗滌后，將切片與山羊抗兔IgG H&L 二抗（Alexa Fluor?647）在37 ℃下孵育1 h，用DAPI染核。用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，最后隨機讀取6 個區(qū)域觀察CD31 陽性表達，Image J 軟件分析CD31 陽性表達區(qū)域的面積和區(qū)域總面積，計算CD31陽性區(qū)域面積百分比。CD31陽性區(qū)域面積百分比（%）=CD31陽性區(qū)域面積/區(qū)域總面積×100%。

1.3.7 Western blot 檢測病灶周圍骨組織VEGFA/SDF-1/CXCR4 信號通路蛋白表達 取-80 ℃保存的病灶周圍組織研磨后加入RIPA 裂解液獲取總蛋白，將蛋白質(zhì)定量后進行SDS-PAGE 電泳，4 ℃下以100 V 轉到PVDF 膜上，然后用5%脫脂奶粉封閉膜1 h，將膜與一抗VEGFA（1∶2 000）、SDF-1（1∶1 000）、CXCR4（1∶1 000）和GAPDH抗體（1∶1 000）在4 ℃下孵育過夜，TBST 洗滌后加入二抗（1∶2 000），加ECL 顯色劑，凝膠成像系統(tǒng)分析目的蛋白，Image J 軟件計算蛋白灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值比值作為蛋白相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)在進行正態(tài)性和方差齊性檢驗后以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。計數(shù)資料用頻數(shù)表示，各組間比較用χ2檢驗，采用Bonferroni方法進行多重比較，校正后的檢驗水準α=0.05/10=0.005。

2 結果

2.1 楊梅苷對大鼠創(chuàng)口愈合、細菌負荷以及肛溫的影響 OM 組較假手術組達到甲級創(chuàng)口愈合程度的大鼠數(shù)量減少（P＜0.005），肛溫、細菌負荷升高（P＜0.05）；楊梅苷組較OM 組達到甲級創(chuàng)口愈合程度的大鼠數(shù)量增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.005），肛溫、細菌負荷下降（P＜0.05），PX-478 組較OM 組達到甲級創(chuàng)口愈合程度的大鼠數(shù)量減少，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.005），肛溫、細菌負荷升高（P＜0.05）；楊梅苷+PX-478組較楊梅苷組達到甲級創(chuàng)口愈合程度的大鼠數(shù)量減少，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.005），細菌負荷、肛溫升高（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of wound healing and anal temperature between the five groups of rats表1 各組大鼠創(chuàng)口愈合以及肛溫比較

2.2 各組大鼠血清炎性因子水平比較 與假手術組比較，OM 組大鼠血清IL-6、IL-1β、IL-17 水平升高（P＜0.05）；與OM 組比較，楊梅苷組大鼠血清IL-6、IL-1β、IL-17水平下降（P＜0.05），PX-478組大鼠血清IL-6、IL-1β、IL-17水平升高（P＜0.05）；與楊梅苷組相比，楊梅苷+PX-478組大鼠血清IL-6、IL-1β、IL-17水平升高（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of serum levels of IL-6,IL-1β and IL-17 between the five groups of rats表2 各組大鼠血清IL-6、IL-1β、IL-17的比較（n=18，ng/L，±s）

Tab.2 Comparison of serum levels of IL-6,IL-1β and IL-17 between the five groups of rats表2 各組大鼠血清IL-6、IL-1β、IL-17的比較（n=18，ng/L，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術組比較，b與OM組比較，c與梅苷組比較，P＜0.05；表3、4同。

組別假手術組OM組楊梅苷組PX-478組楊梅苷+PX-478組F IL-6 47.32±6.34 73.84±9.56a 53.43±6.13b 97.87±11.32b 69.65±8.43c 95.779＊＊IL-1β 34.23±8.87 69.43±16.98a 44.97±6.56b 93.86±14.87b 57.56±6.57c 71.118＊＊IL-17 1.89±0.25 4.38±0.52a 2.15±0.36b 5.98±0.65b 3.91±0.45c 235.371＊＊

2.3 各組大鼠血清骨代謝指標變化 OM組較假手術組BALP、BGP 均降低，CTX-Ⅰ水平增高（P＜0.05）；與OM組相比較，楊梅苷組BALP、BGP水平均增高，CTX-Ⅰ水平降低（P＜0.05），而PX-478 組BALP、BGP 水平降低，CTX-Ⅰ水平增高（P＜0.05）；楊梅苷+PX-478組較楊梅苷組BALP、BGP水平均降低，CTX-Ⅰ水平升高（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of serum bone metabolism indexes between the five groups of rats表3 各組大鼠血清骨代謝指標的比較（n=18，μg/L，±s）

Tab.3 Comparison of serum bone metabolism indexes between the five groups of rats表3 各組大鼠血清骨代謝指標的比較（n=18，μg/L，±s）

組別假手術組OM組楊梅苷組PX-478組楊梅苷+PX-478組F BALP 8.47±0.94 5.68±0.68a 7.94±0.84b 3.31±0.25b 5.98±0.78c 139.029＊＊BGP 15.86±1.69 9.57±0.94a 14.86±1.57b 6.43±0.72b 10.53±1.76c 138.927＊＊CTX-Ⅰ0.55±0.04 1.39±0.15a 0.65±0.07b 1.97±0.23b 1.22±0.13c 306.237＊＊

2.4 各組大鼠病灶周圍骨組織病理改變以及CD31陽性表達變化 假手術組無骨壞死，無急性或慢性骨內(nèi)和骨膜炎癥；OM組存在嚴重骨壞死以及大量炎性細胞浸潤；楊梅苷組炎性細胞浸潤以及骨壞死明顯減輕；PX-478組表現(xiàn)出嚴重的骨內(nèi)炎癥伴髓內(nèi)膿腫，炎性細胞浸潤加重；楊梅苷+PX-478組與OM 組結果相似，見圖1。假手術組、OM組、楊梅苷組、PX-478 組、楊梅苷+PX-478 組CD31 陽性區(qū)域面積百分比（%）分別為6.54±0.69、4.23±0.47、6.23±0.67、2.35±0.26、4.67±0.48，差異有統(tǒng)計學意義（n=6，F(xiàn)=59.302，P＜0.05），OM 組較假手術組下降（P＜0.05）；與OM組相比較，楊梅苷組升高，而PX-478 組降低（P＜0.05）；楊梅苷+PX-478 組較楊梅苷組CD31 陽性區(qū)域面積降低（P＜0.05），見圖2。

Fig.1 Pathological changes of bone tissue around lesion in rats of each group(HE staining,×100)圖1 各組大鼠病灶周圍骨組織病理變化（HE染色，×100）

Fig.2 Positive expression of CD31 in bone tissue around lesion of rats in each group(immunofluorescence staining,×200)圖2 各組大鼠病灶周圍骨組織CD31陽性表達（免疫熒光染色，×200）

2.5 各組大鼠VEGFA/SDF-1/CXCR4信號通路相關蛋白表達變化 OM 組較假手術組VEGFA、SDF-1、CXCR4 蛋白水平均下調(diào)（P＜0.05）；與OM 組比較，楊梅苷組VEGFA、SDF-1、CXCR4 蛋白水平均上調(diào)（P＜0.05），而PX-478 組VEGFA、SDF-1、CXCR 蛋白水平下調(diào)（P＜0.05）；楊梅苷+PX-478組較楊梅苷組VEGFA、SDF-1、HEY蛋白水平均降低（P＜0.05），見圖3、表4。

Fig.3 Expressions of VEGFA,SDF-1 and CXCR4 proteins in bone tissue around lesion of rats in each group圖3 各組大鼠病灶周圍骨組織中VEGFA、SDF-1、CXCR4蛋白表達

Tab.4 Comparison of VEGFA,SDF-1 and CXCR4 protein expression in bone tissue around lesion of rats between the five groups表4 各組大鼠病灶周圍骨組織中VEGFA、SDF-1、CXCR4蛋白表達的比較（n=6，±s）

Tab.4 Comparison of VEGFA,SDF-1 and CXCR4 protein expression in bone tissue around lesion of rats between the five groups表4 各組大鼠病灶周圍骨組織中VEGFA、SDF-1、CXCR4蛋白表達的比較（n=6，±s）

組別假手術組OM組楊梅苷組PX-478組楊梅苷+PX-478組F VEGFA 1.69±0.19 0.91±0.10a 1.52±0.13b 0.60±0.06b 0.97±0.09c 82.357＊＊SDF-1 1.22±0.14 0.68±0.07a 1.13±0.11b 0.33±0.03b 0.75±0.07c 92.101＊＊CXCR4 1.47±0.15 0.86±0.09a 1.37±0.13b 0.39±0.04b 0.90±0.09c 135.945＊＊

3 討論

金黃色葡萄球菌是引起人類慢性感染的常見病原體，OM是該病原體引起的原發(fā)性慢性感染疾病之一［13］。OM 可發(fā)展為骨壞死和骨破壞［14］，改善骨缺損可以緩解金黃色葡萄球菌誘發(fā)的OM，而促進血管生成和骨形成是修復骨缺損的重要途徑［3，7］。楊梅苷是一種黃酮類化合物。Ying等［11］發(fā)現(xiàn)楊梅苷對糖尿病骨質(zhì)疏松癥大鼠具有骨保護作用。Xi 等［6］發(fā)現(xiàn)，楊梅苷可通過抑制破骨細胞形成，減少骨質(zhì)流失，緩解大鼠骨質(zhì)疏松癥。在本研究中，OM 大鼠病灶周圍骨組織存在嚴重的骨壞死和大量炎性細胞浸潤現(xiàn)象，且OM 大鼠較假手術組達到甲級創(chuàng)口愈合程度的大鼠數(shù)量減少，細菌負荷、肛溫升高，表明OM模型構建成功；楊梅苷治療后，OM 大鼠病灶周圍骨組織炎性細胞浸潤以及骨壞死現(xiàn)象改善，達到甲級創(chuàng)口愈合程度的大鼠數(shù)量呈增加趨勢，細菌負荷、肛溫下降，提示楊梅苷對OM大鼠起到積極影響。

既往研究表明，促炎細胞因子和趨化因子在細菌感染期間通過募集和激活浸潤的免疫細胞來維持骨吸收和骨形成之間的平衡［15］。IL-1β、IL-6和IL-17是病理條件下骨代謝的重要標志物［16］。IL-1β是一種有效的促炎細胞因子，通過在骨感染期間誘導炎癥部位的破骨細胞分化來參與骨吸收［17］。IL-6和IL-17已被證明在慢性脛骨骨髓炎患者血清中呈高表達，下調(diào)IL-6、IL-17 水平可降低機體炎癥反應，恢復關節(jié)功能，提高機體免疫力［13］。BALP、BGP是骨形成常見指標，在促進骨形成方面起關鍵作用；CTX-Ⅰ是常見的骨吸收指標，升高BALP、BGP水平以及降低CTX-Ⅰ水平可修復骨損傷［18］。CD31是內(nèi)皮細胞的特異性標志物，可用于評估血管生成［19］。有研究報道，升高CD31 水平可促進血管生成，進而促進成骨，修復骨缺損［7］。本研究結果與上述研究結果一致。在本研究中，OM大鼠血清中BALP、BGP水平降低，病灶周圍骨組織CD31 陽性表達下降，且IL-6、IL-1β、IL-17 水平和CTX-Ⅰ水平升高，表明OM 大鼠病灶周圍骨形成受損；而楊梅苷處理后，血清炎性因子水平和CTX-Ⅰ水平降低，BALP、BGP水平升高，CD31 陽性表達增加，提示楊梅苷可促進骨形成以及血管生成，改善細菌性OM大鼠骨缺損。

VEGFA、SDF-1、CXCR4 是血管生成的關鍵基因。Shen等［20］發(fā)現(xiàn)抑制VEGFA/SDF-1/CXCR4信號通路的活化可以抑制血管生成。Huang 等［9］發(fā)現(xiàn)激活VEGFA/SDF-1/CXCR4信號通路可以促進內(nèi)皮細胞血管生成，進而加速傷口愈合。Ding 等［21］也發(fā)現(xiàn)激活VEGFA/SDF-1/CXCR4信號軸可以促進血管生成，加速老年小鼠骨折愈合。在本研究中，OM 大鼠病灶周圍骨組織中VEGFA、SDF-1、CXCR4 蛋白水平下降，表明VEGFA/SDF-1/CXCR4 信號通路被抑制；而楊梅苷可上調(diào)VEGFA、SDF-1、CXCR4蛋白水平，提示楊梅苷可能通過激活VEGFA/SDF-1/CXCR4信號軸來改善細菌性OM大鼠骨缺損。為了進一步證明以上推測，本研究用VEGFA/SDF-1/CXCR4信號通路抑制劑PX-478處理OM大鼠，結果發(fā)現(xiàn)，PX-478 逆轉了楊梅苷對細菌性OM 大鼠骨缺損的改善作用。

綜上所述，楊梅苷可能通過激活VEGFA/SDF-1/CXCR4信號通路，促進骨形成以及血管生成，進而改善細菌性OM 大鼠骨缺損。然而，楊梅苷治療是否呈現(xiàn)劑量相關性，是否可以通過調(diào)節(jié)其他血管生成通路產(chǎn)生同等積極作用，需要進一步探索。