李 倩，李 鈺，符文雅，肖 娟，黃 海，郭志強,4

（1.海南大學(xué)生命健康學(xué)院，南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南 海口 570228；2.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228；3.熱帶海洋生物資源利用與保護教育部重點實驗室，海南省熱帶海洋漁業(yè)資源保護與利用重點實驗室，海南熱帶海洋學(xué)院水產(chǎn)與生命學(xué)院，海南 三亞 572022；4.海南大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228）

金槍魚（Thunnus）肉質(zhì)鮮美，富含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、不飽和脂肪酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)，備受消費者喜愛，具有很高的市場需求[1]。黃鰭金槍魚（Thunnus albacares）是金槍魚的一種，具有游泳速度快、高代謝能力特點[2]。研究表明，在常規(guī)游泳速度條件下，黃鰭金槍魚的氧代謝率為776 mg/（kg·h），約為其他硬骨魚的6～8 倍[3]。此外，黃鰭金槍魚可以通過增強心血管系統(tǒng)，增大鰓表面積來實現(xiàn)高代謝率[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，糖原作為肌肉能量產(chǎn)生的關(guān)鍵底物，同時也是潛在的能量儲存庫，能夠維持多種魚類能量平衡[5-6]。魚體內(nèi)代謝受相關(guān)酶活性的影響，且代謝酶活性與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)[7-8]。因此，組織代謝能力高低可通過測定組織糖原含量、能量產(chǎn)生途徑中關(guān)鍵代謝酶活性和相關(guān)基因的表達(dá)來評估。

魚類的生長發(fā)育過程中，其體質(zhì)量與魚體代謝密切相關(guān)。Schultz 等[9]發(fā)現(xiàn)，高溫條件下大西洋銀漢魚（Menidia menidia）小魚相比大魚消耗更多能量。Churova等[10]研究發(fā)現(xiàn)，大西洋鮭（Salmo salar）肌肉組織碳水化合物代謝相關(guān)酶活性與體質(zhì)量呈正相關(guān)。此外，Vornanen 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，小型黑鯽（Carassius carassius）的糖原儲存含量明顯高于大型黑鯽。黃鰭金槍魚在其生長發(fā)育過程中，體質(zhì)量變化很大，最大可達(dá)225 kg，從小魚到大魚不同階段對能量的需求不同。同時，黃鰭金槍魚為維持持續(xù)的游泳需要消耗大量能量，其運動和能量代謝與骨骼肌密切相關(guān)[12]。骨骼肌是維持全身代謝和運動的重要組織，根據(jù)功能主要分為兩種類型：白色肌肉（下文簡稱“白肌”）和紅色肌肉（下文簡稱“紅肌”）[13]。白肌主要依賴于糖酵解支持的無氧代謝供能進行爆發(fā)性運動，紅肌主要依賴于有氧代謝供能進行持續(xù)肌肉收縮運動[14]，已經(jīng)在多種魚類的研究中被證實。Shibata 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，太平洋藍(lán)鰭金槍魚（Thunnus orientalis）通過增加白肌中無氧代謝基因的表達(dá)和紅肌中有氧代謝基因的表達(dá)來產(chǎn)生大量能量。Gao 等[16]對紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）紅肌和白肌組織研究發(fā)現(xiàn)，紅肌比白肌具更好的氧化酶水平。另外，Wu 等[17]也在羅非魚（Oreochromis niloticus）的肌肉組織中發(fā)現(xiàn)，白肌主要參與爆發(fā)性的肌肉收縮運動，紅肌主要參與持續(xù)的肌肉收縮運動。

目前，國內(nèi)金槍魚人工養(yǎng)殖技術(shù)仍處于初步探索階段，僅見南海水產(chǎn)研究所開展相關(guān)研究[18]，且關(guān)于黃鰭金槍魚紅肌和白肌的能量代謝研究較少，也尚未見不同體質(zhì)量黃鰭金槍魚能量代謝差異的研究。基于此，本研究選取不同體質(zhì)量的黃鰭金槍魚紅肌和白肌組織作為研究對象，通過對不同肌肉組織中糖原含量、能量代謝相關(guān)酶活性和基因表達(dá)量進行測定，探討不同體質(zhì)量下黃鰭金槍魚肌肉組織能量代謝差異，了解不同生長階段黃鰭金槍魚的能量需求，為優(yōu)化金槍魚養(yǎng)殖方案，推動人工金槍魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃鰭金槍魚樣品于2022年5月以海釣的方式捕獲于南海中部海域（17°41'N～18°17'N，110°60'E～112°14'E），共收獲9 尾黃鰭金槍魚樣品。黃鰭金槍魚樣品捕獲上船后，用1 g/L的MS-222（上海麥克林生化科技有限公司）進行麻醉處理30 s，立即解剖樣品，采取紅肌和白肌組織（白肌取自腹部肌肉，紅肌取魚體腹部側(cè)線附近肌肉)。然后立即放入1.5 mL無菌離心管中并用液氮冷凍，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存待用。根據(jù)各樣本體質(zhì)量大小和性腺發(fā)育特征[19]，將樣品分為小魚（0.85±0.03）kg、中魚（9.77±0.15）kg 和大魚（19.63 ± 0.37）kg 三個體質(zhì)量組，樣品基本信息如表1所示。

表1 不同體質(zhì)量組黃鰭金槍魚統(tǒng)計表Table 1 Statistical table of Thunnus albacares of different body mass groups

1.2 肌肉組織酶活性測定

稱量各體質(zhì)量組紅肌和白肌組織樣本，按照質(zhì)量∶體積=1 g∶9 mL 的比例，加入提取液進行機械破碎以制備勻漿，在4 ℃、10 000 r/min 條件下離心10 min，取上清勻漿液。采用考馬斯亮藍(lán)法測定上清液中蛋白（TP）濃度，采用動力學(xué)方法用檸檬酸合成酶（CS）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）、磷酸果糖激酶（PFK）、乳酸脫氫酶（LDH）、蘋果酸脫氫酶（MDH）和糖原試劑盒（南京建成生物工程研究所和北京索萊寶科技有限公司）測定不同體質(zhì)量組紅肌和白肌組織相關(guān)酶的活性以及糖原含量。其中CS、MDH、SDH、LDH 酶活性和蛋白濃度測定溫度條件為37 ℃；HK、PK 和PFK酶活性測定溫度條件為25 ℃；糖原含量在沸水浴條件下進行測定。

1.3 基因表達(dá)分析

用Trizol 試劑根據(jù)試劑盒說明提取肌肉組織的總RNA，然后用瓊脂糖凝膠電泳、Nano Drop 2000C超微量分光光度計檢測RNA 濃度和純度。用諾唯贊生物試劑反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，放置于-40 ℃用于測定基因表達(dá)量。依據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中黃鰭金槍魚基因組數(shù)據(jù)［Thunnus albacares-NCBI-NLM（nih.gov）］用Primer Premier5軟件設(shè)計相關(guān)基因引物，并由擎科生物公司合成具體的基因引物序列如表2所示。最后以β-actin作為內(nèi)參基因，使用SYBR qPCR試劑盒進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，并用2-ΔΔCt法計算基因表達(dá)量。

表2 實時熒光定量PCR引物序列Table 2 Real-time quantitative PCR primer sequence

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

所有實驗均進行三次重復(fù)，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean ± SE）表示，使用IBM SPSS Statistics 23 軟件進行分 析，GraphPad Prism 9.0 作圖。當(dāng)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時使用單因素方差分析（One-Way ANOVA）和獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布時采用Kruskal-Wallis 和Mann-Whitney 檢驗，以P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）方法對體質(zhì)量和肌肉類型進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同體質(zhì)量黃鰭金槍魚糖原含量差異分析

如圖1所示，與小魚組相比，紅肌糖原含量在中魚組和大魚組顯著增加，且在大魚組達(dá)到最大值（F=168.435，P＜0.001）。白肌糖原含量在中魚組最高，在大魚組最低，且在三個體質(zhì)量組中，紅肌的糖原含量均極顯著高于白?。ㄐ◆~F=5.876，P=0.009；中魚F=2.115，P＜0.001；大魚F=0.846，P＜0.001）。

圖1 不同體質(zhì)量(小、中、大)黃鰭金槍魚糖原含量Fig.1 Glycogen content in Thunnus albacares with different body mass(small,middle,and large)

2.2 不同體質(zhì)量黃鰭金槍魚無氧代謝關(guān)鍵酶活性和基因表達(dá)量差異

與無氧代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶HK、PK、LDH 和PFK的酶活性測定和相關(guān)基因hk、pk、ldh和pfk的表達(dá)結(jié)果如圖2 所示。紅肌和白肌中HK 活性均在大魚組最高，且顯著高于小魚組和中魚組（紅肌F=72.627，P＜0.001；白肌F=168.730，P＜0.001）。除小魚組外，中魚和大魚組白肌的HK 活性顯著高于紅?。ㄖ恤~F=1.249，P=0.022；大魚F=2.638，P=0.007）（圖2(A)）。紅肌和白肌中PK 活性均在大魚組最高（紅肌F=17.466，P=0.003；白肌F=51.567，P＜0.001），且大魚組白肌PK 活性顯著高于紅?。‵=2.067，P=0.018）（圖2(C)）。紅肌和白肌中LDH 活性均在在大魚組最高，在小魚組最低（F=9.127，P=0.015），小魚組和中魚組紅肌和白肌LDH活性差異不顯著（小魚F=5.285，P=0.986；中魚F=0.606，P=0.309），但大魚組白肌LDH 活性顯著高于紅?。‵=4.747，P=0.020）（圖2(E)）。紅肌中PFK 活性差異不顯著（F=2.374，P=0.174），與小魚組相比，大魚組白肌中PFK 活性增加。除小魚組外，白肌中PFK 活性均顯著高于紅肌，并且在中魚組差異最大（F=1.614，P=0.006）（圖2(G)）。

圖2 不同體質(zhì)量（小、中、大）黃鰭金槍魚無氧代謝關(guān)鍵酶活性和基因表達(dá)Fig.2 Activities of key enzymes and gene expression in anaerobic metabolism of Thunnus albacares with different body mass(small,middle,and large)

對應(yīng)基因的表達(dá)結(jié)果顯示，紅肌中大魚組hk基因表達(dá)量顯著高于其他兩組（H=7.101，P=0.029），白肌中中魚組hk基因表達(dá)量最高，并且極顯著高于紅?。╖=-3.991，P＜0.001）（圖2(B)）。紅肌pk基因表達(dá)量在三個體質(zhì)量組中差異不顯著（H=3.067，P=0.216），白肌中pk基因表達(dá)量在中魚組表達(dá)量最高，并且極顯著高于紅?。╖=-4.160，P＜0.001）（圖2(D)）。三個體質(zhì)量組中紅肌ldh基因的表達(dá)量無明顯差異（H=0.470，P=0.790），白肌中l(wèi)dh基因的表達(dá)量在大魚組最高，并且顯著高于紅?。╖=-3.235，P=0.001）（圖2(F)）。紅肌中中魚組和大魚組pfk基因的表達(dá)量顯著高于小魚組，且在中魚組表達(dá)量最高（H=8.031，P=0.018），白肌中pfk基因表達(dá)量與體質(zhì)量變化整體差異顯著（H=6.568，P=0.037），且在三個體質(zhì)量組中紅肌和白肌pfk基因表達(dá)量均無明顯差異（圖2(H)）。

2.3 不同體質(zhì)量黃鰭金槍魚有氧代謝關(guān)鍵酶活性和基因表達(dá)量差異

與有氧代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶CS、SDH 和MDH 的酶活性和cs、sdh和mdh三個基因的表達(dá)量結(jié)果如圖3所示。紅肌和白肌兩種組織中CS活性均在大魚組最高，且顯著差異（紅肌F=1529.123，P＜0.001；白肌F=17.047，P=0.003）。所有體質(zhì)量組中紅肌CS活性均顯著高于白肌（小魚F=2.180，P=0.022；中魚F=0.813，P＜0.001；大魚F=12.463，P=0.004），（圖3(A)）。與小魚組和中魚組相比，大魚組紅肌和白肌組織中SDH 活性最高（紅肌F=212.623，P＜0.001；白肌F=81.969，P＜0.001）。小魚組和中魚組SDH 活性在紅肌和白肌之間沒有差異，大魚組紅肌SDH 活性顯著高于白肌SDH 活性（F=0.883，P=0.011）（圖3(B)）。紅肌和白肌組織中MDH活性均在大魚組最高，在小魚組最低，且差異顯著（紅肌F=43.606，P＜0.001；白肌F=14.848，P=0.005）。紅肌MDH 活性僅在小魚組顯著高于白肌（F=0.122，P=0.031），中魚組和大魚組無明顯差異（圖3(C)）。

圖3 不同體質(zhì)量(小、中、大)黃鰭金槍魚有氧代謝關(guān)鍵酶活性和基因表達(dá)Fig.3 Activities of key aerobic enzymes and gene expression in Thunnus albacares with different body mass(small,middle,and large)

有氧代謝關(guān)鍵酶cs、sdh和mdh三個基因的表達(dá)量測定結(jié)果顯示，紅肌和白肌中cs基因的表達(dá)量在中魚組顯著高于小魚組和大魚組（紅肌H=10.051，P=0.007；白肌H=17.351，P＜0.001），并且在大魚組紅肌cs基因的表達(dá)量顯著高于白?。╖=2.102，P=0.034）（圖3(D)）。紅肌中sdh基因表達(dá)量在大魚組最高，且與小魚組差異顯著（H=9.462，P=0.009）；白肌中中魚組sdh基因表達(dá)量最高，顯著高于小魚組（H=17.983，P＜0.001），且在大魚組紅肌sdh基因的表達(dá)量與白肌sdh基因的表達(dá)量差異極顯著（Z=2.922，P=0.002）（圖3(E)）。與小魚組相比，中魚和大魚組紅肌和白肌mdh基因的表達(dá)量顯著增加（中魚H=9.145，P=0.010；大魚H=21.528，P＜0.001），但三個體質(zhì)量組紅肌和白肌之間mdh基因表達(dá)量無明顯差異（小魚Z=-1.807，P=0.076；中魚Z=-1.084，P=0.300；大魚Z=0.230，P=0.847）（圖3(F)）。

2.4 不同體質(zhì)量黃鰭金槍魚代謝酶活性和基因表達(dá)量方差分析

關(guān)鍵代謝酶活和基因表達(dá)測定方差分析結(jié)果如表3 所示。體質(zhì)量、肌肉類型以及體質(zhì)量×肌肉類型3 種效應(yīng)會顯著影響HK、PFK、CS、SDH 活性和糖原含量（P＜0.05）。PK活性的體質(zhì)量和肌肉類型的主效應(yīng)差異顯著（P＜0.05），體質(zhì)量×肌肉類型交互作用不顯著（P＞0.05）。LDH 活性的體質(zhì)量主效應(yīng)差異顯著（P＜0.05）。MDH活性的肌肉類型主效應(yīng)差異不顯著（P＞0.05），體質(zhì)量主效應(yīng)和體質(zhì)量×肌肉類型交互作用差異顯著（P＜0.05）。

表3 酶活性和基因表達(dá)測定的方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA results of enzyme activity and gene expression determinations

基因表達(dá)量與體質(zhì)量，肌肉類型和體質(zhì)量×肌肉類型交互作用對hk、ldh、pfk、cs、sdh和mdh的基因表達(dá)量差異均不顯著（P＞0.05）。pk基因的表達(dá)量與體質(zhì)量主效應(yīng)，肌肉類型主效應(yīng)和體質(zhì)量×肌肉類型交互作用差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

3.1 不同體質(zhì)量黃鰭金槍魚糖原含量差異

動物機體中，葡萄糖主要以糖原的形式儲存在肌肉組織，代謝時會迅速產(chǎn)生能量，供給肌肉收縮，因此肌肉組織的糖原的水平可以反映魚體糖代謝的狀態(tài)[20-22]。魚類的兩種肌肉組織具有不同的生理功能和代謝過程，白肌中糖代謝為分解代謝，糖酵解能力較高；紅肌中糖代謝為合成代謝，糖原合成較多[23-24]。此外，也有研究表明，白肌中葡萄糖代謝遠(yuǎn)高于紅肌[25]。在本研究中，紅肌中糖原含量在大魚組最高，且顯著高于白肌組織，表明紅肌比白肌具有更高的合成糖原能力，可為黃鰭金槍魚的持續(xù)游泳運動儲存能量[26]。另外，本研究也發(fā)現(xiàn)大魚組白肌組織中糖原含量下降，表明白肌中糖原分解，為后續(xù)肌肉的無氧糖酵解代謝提供充足的能量底物[27]。

3.2 不同體質(zhì)量黃鰭金槍魚無氧代謝酶活性及相關(guān)基因表達(dá)差異

HK、PK、LDH 和PFK 是無氧代謝途徑的關(guān)鍵酶，其活性可作為判別組織無氧代謝能力的指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，紅肌和白肌組織中HK、PK 和LDH 活性均在大魚組達(dá)到最大值，這與Davies 等[28]、Churova 等[29]的研究結(jié)果相似。同時，本研究發(fā)現(xiàn)大魚組中白肌的HK、PK 和LDH 活性均顯著高于紅肌，表明當(dāng)黃鰭金槍魚個體體質(zhì)量較大時，白肌組織具有較高的無氧代謝能力從而應(yīng)對高度劇烈運動時的能量需求。PFK 是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，本研究發(fā)現(xiàn)白肌組織中體質(zhì)量越大，PFK 活性越高，該結(jié)果與大西洋鱈（Gadus morhua）[30]的研究結(jié)果相似，表明體質(zhì)量會影響糖酵解酶PFK 活性，從而促進機體的無氧代謝能力。另外，筆者也發(fā)現(xiàn)體質(zhì)量是影響HK、PK、LDH 和PFK 活性表達(dá)的主要因素。研究表明，糖酵解酶可能在蛋白質(zhì)合成的所有階段受到基因調(diào)控[31]。若酶活性與基因表達(dá)水平變化趨勢同步，表明酶活性與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)有關(guān)[32]，不一致，則可能存在多種復(fù)雜調(diào)控機制[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，白肌hk和pk基因表達(dá)量在小魚組、中魚組與相應(yīng)的酶活性變化一致，而在大魚組變化不一致，該結(jié)果同樣體現(xiàn)在不同體質(zhì)量的虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[33]上，表明黃鰭金槍魚在一定體質(zhì)量范圍內(nèi)，HK 和PK 活性受hk和pk基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控調(diào)節(jié)。但魚體體質(zhì)量較大時，hk和pk基因的表達(dá)量出現(xiàn)下降，這可能與白肌中糖酵解水平下降有關(guān)。本研究中白肌組織中l(wèi)dh基因的表達(dá)量與白肌中LDH活性表達(dá)趨勢相一致，表明在個體發(fā)育過程中，白肌LDH 活性的差異與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)[28]。本研究還發(fā)現(xiàn)不同體質(zhì)量組pfk基因與酶的活性表達(dá)完全不一致，推測可能pfk與PFK 活性之間存在復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制[34]。

3.3 不同體質(zhì)量黃鰭金槍魚有氧代謝酶活性及相關(guān)基因表達(dá)差異

魚類在生長發(fā)育的過程中大部分依賴于有氧代謝提供能量[35]。CS、SDH 和MDH 是三羧酸循環(huán)途徑的關(guān)鍵酶，可以用來評定組織的有氧代謝能力。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著黃鰭金槍魚體質(zhì)量的增加，紅肌和白肌組織中CS、SDH 和MDH 活性顯著增加，在大西洋鱈（G.morhua）[36]和黑鮪（Euthynnus lineatus）[37]中有相似結(jié)果，表明黃鰭金槍魚體質(zhì)量的增加會促進有氧代謝酶CS 活性的表達(dá)。同時，本研究發(fā)現(xiàn)不同體質(zhì)量組黃鰭金槍魚紅肌組織CS活性顯著高于白肌組織，表明紅肌組織具有更高的有氧代謝能力，以應(yīng)對持續(xù)的肌肉收縮所需的能量[38]。另外，筆者也發(fā)現(xiàn)，體質(zhì)量差異是影響CS、SDH 和MDH 活性表達(dá)的主要因素。在本研究中，sdh、mdh的基因表達(dá)量與SDH、MDH 酶活性的表達(dá)相一致，并隨著體質(zhì)量的增加呈現(xiàn)先增加后穩(wěn)定趨勢，表明sdh、mdh基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控SDH、MDH 活性的表達(dá)。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)，cs基因表達(dá)量隨體質(zhì)量的增加呈現(xiàn)先增加后下降趨勢，與CS 活性表達(dá)不一致，此研究結(jié)果與Burness等[33]和Dalziel等[39]研究結(jié)果相似，可能是隨著黃鰭金槍魚體質(zhì)量的增加，魚體內(nèi)翻譯效率更高，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生更多的蛋白質(zhì)，從而維持CS活性所需基因表達(dá)量較少所致[40]。

4 結(jié)論

在本研究中，與小魚組相比，大魚組紅肌中糖原含量顯著升高，白肌中糖原含量顯著下降，并且在不同體質(zhì)量組中紅肌糖原含量均顯著高于白肌，表明不同體質(zhì)量黃鰭金槍魚肌肉組織糖代謝能力差異。體質(zhì)量的增加會促進肌肉組織中代謝酶活性的表達(dá)，其中白肌中無氧代謝關(guān)鍵酶（HK、PK、LDH、PFK）活性高表達(dá)，紅肌中有氧代謝關(guān)鍵酶（CS、SDH、MDH）酶活性高表達(dá)，并且體質(zhì)量是影響酶活性表達(dá)的主要因素。另外，對酶活基因表達(dá)定量分析，發(fā)現(xiàn)體質(zhì)量會影響基因表達(dá)，并且基因表達(dá)與酶活性之間存在復(fù)雜調(diào)控機制，此部分尚需進一步深入研究。