袁禹惠，龔 埜，黃 巖，李松林,2

（1.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)試驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306）

n-3 長鏈多不飽和脂肪酸（LC-PUFA）中的C22:6n-3（DHA）和C20:5n-3（EPA）是海水魚的必需脂肪酸[1]，在維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性方面起著重要作用[2]。DHA大量存在于脊椎動(dòng)物神經(jīng)組織的磷脂中，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)及感覺器官的正常發(fā)育至關(guān)重要[3-4]；EPA 可作為環(huán)氧合酶(COX)-2 和5-脂氧合酶(5-LOX)的底物，轉(zhuǎn)化為炎癥性較低的類二十烷酸[5-6]。然而，因脂肪酸酯化形成磷脂的酰化酶和轉(zhuǎn)酰酶不具備底物的特異性，DHA 和EPA 在參與磷脂合成過程中存在一定的競爭性[2]。因此，飼料n-3 LC-PUFA 總量及適宜的DHA 與EPA 質(zhì)量比（下稱“DHA/EPA”）對(duì)于海水魚正常生長發(fā)育均至關(guān)重要。已證實(shí)飼料DHA/EPA 在尖吻鱸（Lates calcarifer）[7]、大黃魚（Larmichthys crocea）[8]等海水魚中的重要性。目前，在海水仔稚魚研究中，主要通過生物餌料營養(yǎng)強(qiáng)化的方式確定其適宜DHA/EPA[9-11]，但該營養(yǎng)強(qiáng)化方式難以形成營養(yǎng)素濃度梯度，且生物餌料通常營養(yǎng)不均衡。因此，探究海水仔稚魚適宜DHA/EPA應(yīng)以微顆粒飼料為載體。

斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）是我國東南沿海重要的養(yǎng)殖魚類，有關(guān)其營養(yǎng)學(xué)研究主要集中在幼魚階段[12-14]。已有n-3 LC-PUFA 對(duì)斜帶石斑魚稚魚生長發(fā)育影響的研究[15]，但未見關(guān)于適宜DHA、EPA 比例的報(bào)道。本研究通過調(diào)整微顆粒飼料中DHA/EPA，探究DHA/EPA 變化對(duì)斜帶石斑魚稚魚生長性能、脂肪酸組成及消化酶活力的影響，為開發(fā)高效的斜帶石斑魚微顆粒飼料提供支撐。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

以白魚粉、蝦粉、磷蝦粉和水解魚粉為主要蛋白源，以DHA 純化油、EPA 純化油、花生四烯酸（20:4n-6，ARA）純化油、棕櫚酸甘油酯及大豆卵磷脂為主要脂肪源，通過調(diào)整DHA、EPA 純化油含量，配制5 種等氮（粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)58%）等脂（粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%）的微顆粒飼料，其中DHA/EPA分別為0.82、1.28、1.67、2.00 和2.33。飼料配方詳見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料配方及營養(yǎng)組成（干基）Table 1 Formulation and chemical composition of experimental diets(dry matter basis) %

將所有原料粉碎，過孔徑150 μm 篩網(wǎng)，隨后按照配方比例，通過逐級(jí)放大的方式進(jìn)行充分混勻，與充分混合后的脂肪源（DHA 純化油、EPA 純化油、ARA 純化油、棕櫚酸甘油酯及大豆卵磷脂）混勻，加水混合，利用單螺桿擠壓制粒機(jī)造粒，于50 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥，破碎，過篩，分為2個(gè)規(guī)格：規(guī)格250～380 μm 飼料用于投喂孵化后29～45 日齡的斜帶石斑魚稚魚，規(guī)格380～550 μm 飼料用于45 日齡后稚魚養(yǎng)殖。飼料于-20 ℃保存?zhèn)溆茫舅峤M成由氣相色譜儀測定（表2）。

表2 實(shí)驗(yàn)飼料脂肪酸占總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Mass fraction of fatty acid to total fatty acid of the experimental diets

1.2 養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在上海海洋大學(xué)&廣東恒興飼料實(shí)業(yè)股份有限公司聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室控溫循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中開展，實(shí)驗(yàn)用斜帶石斑魚稚魚（22 日齡）購自湛江市商業(yè)育苗廠。使用初孵鹵蟲投喂2 d 后，搭配微顆粒配合飼料進(jìn)行轉(zhuǎn)餌，培養(yǎng)至稚魚后，投喂配合飼料比例90%以上。30日齡時(shí)，稚魚禁食24 h，按照每桶300尾的密度平均分置到15個(gè)600 L養(yǎng)殖桶中。同時(shí)，隨機(jī)取100尾用于計(jì)算初始體質(zhì)量（70.2±0.2）mg，隨機(jī)取30 尾魚用于測量初始體長（1.21±0.03）cm，重復(fù)測定3次。設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)重復(fù)。養(yǎng)殖期4周，每天07:00、10:00、13:00、16:00和18:00 5次表觀飽食投喂。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)期間自然光照。養(yǎng)殖用水經(jīng)海綿和珊瑚沙過濾、紫外線燈消毒后的系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)水，每日換水量5%。實(shí)驗(yàn)過程中連續(xù)曝氣，溶解氧質(zhì)量濃度≥6 mg/L，pH為7.2±0.2，水溫（28±1）℃，鹽度為30±1，氨氮質(zhì)量濃度＜0.1 mg/L。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，稚魚禁食24 h 后，統(tǒng)計(jì)成活率（SR，%）、終末體質(zhì)量（FBM，g），計(jì)算特定生長率（SGR，%/d）：SR=終末魚數(shù)/初始魚數(shù)；SGR=（ln終末體質(zhì)量-ln初始體質(zhì)量）/飼養(yǎng)時(shí)間。

每桶隨機(jī)取魚30尾，測定全魚基本營養(yǎng)成分及脂肪酸組成；取魚10 尾，剖取胃及腸道測定消化酶活力，剖取肌肉用于脂肪酸分析。所有樣品用液氮速凍后置于-80°C冰箱保存。

1.4 生化分析

據(jù)AOAC[16]方法測定實(shí)驗(yàn)飼料及全魚的基本營養(yǎng)成分。待測樣品水分含量通過105 ℃烘箱烘干至恒重測定，粗蛋白質(zhì)含量用凱氏定氮法測定，粗脂肪含量利用索氏抽提法測定。全魚及肌肉樣品冷凍干燥后進(jìn)行脂肪酸甲酯化處理，參照Metcalfe等[17]方法，利用氣相色譜儀測定脂肪酸相對(duì)含量。

1.5 消化酶活力測定

用組織粉碎機(jī)將所取組織樣品（胃和腸道）按質(zhì)量（g）體積（mL）比1∶9 在預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4）中充分研磨，以3 000 r/min 離心10 min（4 ℃），取上清液用于消化酶活力測定。以牛血紅蛋白為底物，采用福林酚法測定胃蛋白酶活力[18]，每mg 組織蛋白每分鐘分解牛血紅蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸相當(dāng)于1個(gè)活力單位U（37 ℃）。以苯甲酰精氨酰對(duì)硝基苯胺（BAPNA）為底物，參照Holm等[19]方法測定胰蛋白酶活力，每mg組織蛋白每分鐘分解BAPNA 產(chǎn)生1 μg 硝基苯胺相當(dāng)于1 個(gè)活力單位U（37 ℃）。以可溶性淀粉為底物參照Métais等[20]方法測定淀粉酶活力，每mg組織蛋白在37 ℃、30 min 能完全水解淀粉1 mg 稱為一個(gè)活力單位U。采用聚已烯醇橄欖油法測定脂肪酶活力[21]，每mg組織蛋白在37 ℃、每min水解脂肪產(chǎn)生1 μg分子脂肪酸為一個(gè)活力單位U。利用考馬斯亮藍(lán)法測定組織可溶性蛋白含量[22]，用于比活力計(jì)算。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SEM）表示。利用SPSS19.0 軟件，將數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)處理之間差異顯著（P＜0.05）時(shí)，采用Duncan's檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 飼料DHA/EPA 對(duì)斜帶石斑魚稚魚生長性能的影響

表3 可見：隨著飼料DHA/EPA 的升高，各組間稚魚成活率無顯著變化（P＞0.05），終末體質(zhì)量及特定生長率先升后降（P＜0.05）。其中，1.67組中石斑魚稚魚終末體質(zhì)量及特定生長率顯著高于其余各組（P＜0.05））。

表3 飼料DHA/EPA對(duì)斜帶石斑魚稚魚生長性能的影響Table 2 Effects of dietary DHA/EPA on growth performance of larval Epinephelus coioides

2.2 飼料DHA/EPA對(duì)斜帶石斑魚稚魚體成分的影響

表4 可見：隨著飼料中DHA/EPA 的升高，石斑魚稚魚全魚粗蛋白含量先升后降，1.67 組稚魚粗蛋白含量顯著高于其他各組（P＜0.05），但該組稚魚全魚水分含量顯著低于其他各組（P＜0.05）；稚魚全魚粗脂肪的含量隨著飼料中DHA/EPA 的升高而升高，2.33組顯著高于其他組（P＜0.05）（表4）

表4 飼料DHA/EPA對(duì)斜帶石斑魚稚魚體成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（濕基）的影響Table 4 Mass fraction of nutrients to whole body(wet basis)of larval Epinephelus coioides fed on different DHA/EPA diets %

2.3 飼料DHA/EPA 對(duì)斜帶石斑魚稚魚全魚及肌肉脂肪酸組成的影響

各處理間全魚及肌肉脂肪酸數(shù)據(jù)詳見表5 及表6。全魚及肌肉中EPA含量隨著飼料DHA/EPA的升高顯著降低，而DHA 含量卻顯著升高（P＜0.05）。同時(shí)，飼料DHA/EPA 的升高顯著提高了石斑魚稚魚肌肉以及全魚中m(DHA)/m(EPA)（P＜0.05），未顯著影響全魚及肌肉組織中n-3 LC-PUFA 的含量（P＞0.05）。

表5 不同飼料DHA/EPA斜帶石斑魚稚魚全魚脂肪酸占總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 5 Mass fraction of fatty acid to total fatty acid in whole body of larval Epinephelus coioides fed on different DHA/EPA diets

表6 不同飼料DHA/EPA斜帶石斑魚稚魚肌肉脂肪酸占總脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 6 Mass fraction of fatty acids to total fatty acid in muscle of larval Epinephelus coioides fed on different DHA/EPA diets

2.4 飼料DHA/EPA 對(duì)斜帶石斑魚稚魚消化酶活力的影響

表7 可見：隨著飼料DHA/EPA 的升高，石斑魚稚魚胃蛋白酶、腸胰蛋白酶、腸脂肪酶活力呈先升后降的變化趨勢，1.67組胃蛋白酶、腸胰蛋白酶升至最高（P＜0.05），1.28、1.67、2.00 組腸道脂肪酶活力顯著高于其他組（P＜0.05）；而隨飼料DHA/EPA 的升高，石斑魚稚魚腸道淀粉酶活力呈降低趨勢，2.33組降至最低（P＜0.05）。

表7 不同飼料DHA/EPA斜帶石斑魚消化酶活力Table 7 Digestive enzyme activity of larval Epinephelus coioides fed on different DHA/EPA diets U/mg

3 討論

n-3 LC-PUFA 對(duì)于海水魚正常生長發(fā)育具有重要的作用。仔稚魚因其生長快速，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)需求更高，且對(duì)營養(yǎng)素感知更為敏感[23]。在真鯛（Pagrus major）[24]及金頭鯛（Sparus aurata）[10]等海水仔稚魚的研究中發(fā)現(xiàn)，DHA 的促生長作用優(yōu)于EPA。然而，對(duì)于牙鲆（Paralichthys olivaceus）[25]和大菱鲆（Scophthalmus maximus）[26]而言，DHA/EPA變化對(duì)其生長無顯著影響。飼料DHA/EPA 的升高卻顯著降低了金頭鯛仔稚魚的生長[27]。本研究中，盡管飼料DHA/EPA 對(duì)于斜帶石斑魚稚魚存活率無顯著影響，但1.67 組稚魚生長性能顯著高于其他各組，表明斜帶石斑魚稚魚對(duì)飼料中DHA/EPA 有特定需求。

本研究中，各處理組石斑魚稚魚脂肪酸組成與飼料脂肪酸組成類似。然而，脂肪酸數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，全魚和肌肉中DHA的相對(duì)含量明顯高于飼料中DHA 含量，表明DHA 優(yōu)先被保留。類似結(jié)果已在金頭鯛[28]、歐洲鱸（Dicentrarchus labrax）[29-30]及虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[31]等研究中證實(shí)。然而，全魚和肌肉EPA 相對(duì)含量卻明顯低于飼料，表明EPA較DHA 更易被利用或分解[32]。EPA 相較于DHA 優(yōu)先被利用很可能是本研究中飼料DHA/EPA 升高導(dǎo)致全魚脂肪含量增加的重要原因之一。與DHA 變化趨勢類似，肌肉中ARA（20:4n-6）的相對(duì)含量明顯高于飼料。盡管LC-PUFA 在維持細(xì)胞膜的正常發(fā)育及其完整性中起重要作用[1]，DHA 以及ARA 在肌肉組織中優(yōu)先保留的特性意味著其作為必需脂肪酸在維持細(xì)胞正常功能中的作用。

消化系統(tǒng)在仔稚魚階段開始發(fā)育，仔稚魚對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)吸收能力與消化酶活力有關(guān)[33]，消化酶活力也可以作為衡量仔稚魚消化系統(tǒng)發(fā)育的重要指標(biāo)之一。本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中DHA/EPA 的變化顯著影響了消化酶活力。在仔稚魚發(fā)育過程中，胃蛋白酶表達(dá)晚于其他消化酶[34]，且胃蛋白酶的分泌在一定程度上反映出仔稚魚向幼魚轉(zhuǎn)變的過程[35]。因此，本研究中的胃蛋白酶變化趨勢意味著飼料中適宜的DHA/EPA 并可促進(jìn)斜帶石斑魚稚魚消化系統(tǒng)發(fā)育。一般而言，飼料蛋白質(zhì)含量及氨基酸組成會(huì)影響胰蛋白酶活力[36]，而本研究飼料的上述指標(biāo)卻不存在差異。因此，本研究胰蛋白酶活力變化是由飼料DHA/EPA 變化所致，表明適宜的DHA/EPA 看促進(jìn)胰腺發(fā)育。脂肪酶可水解甘油三脂為甘油二酯、單酰甘油及游離脂肪酸，其在中性脂消化中起重要作用[37-38]。本研究中，脂肪酶活力變化同樣體現(xiàn)了飼料DHA/EPA 變化對(duì)消化系統(tǒng)發(fā)育的影響。一般而言，淀粉酶活力降低是肉食性魚類仔稚魚階段消化系統(tǒng)發(fā)育成熟的重要指標(biāo)之一[39-40]，本研究中，淀粉酶活力隨飼料DHA/EPA的升高而降低。綜上，本研究中石斑魚稚魚消化酶活力的變化證實(shí)，適宜飼料DHA/EPA可有效促進(jìn)其消化系統(tǒng)的發(fā)育。

4 結(jié)論

飼料適宜的DHA/EPA 可顯著提高斜帶石斑魚稚魚的生長性能，影響機(jī)體組成及脂肪酸組成，促進(jìn)消化系統(tǒng)的發(fā)育。斜帶石斑魚稚魚微顆粒飼料DHA/EPA 應(yīng)保持在1.67，這為其高效微顆粒飼料的開發(fā)提供理論支撐。

感謝廣東恒興飼料實(shí)業(yè)股份有限公司謝瑞濤博士在養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)以及取樣過程中的幫助。