仲健新　李建國　武崇高　焦泰至　何志蘭　陳雅寒　楊成德

摘 要 為了明確引起甘藍花葉病的病毒種類，利用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）高通量測序技術(shù)，并結(jié)合分子生物學方法查找甘藍樣品中的病毒序列，發(fā)現(xiàn)存在蕪菁花葉病毒（turnip mosaic virus，TuMV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、蠶豆萎蔫病毒2（broad bean wilt virus2，BBWV2）、煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）和蕓薹黃化病毒（brassica yellows virus，BrYV）等5種病毒。采用RT-PCR技術(shù)進行驗證，結(jié)果顯示樣品檢測到BrYV、TuMV和CMV共3種病毒。對獲得的BrYV外殼蛋白基因（coat protein，cp）進行測序和系統(tǒng)進化分析，獲得1條576 bp的BrYV cp基因全長序列，與GenBank中BrYV分離物cp基因核苷酸序列同源率為88.0%～96.4%，氨基酸序列同源率為90.1%～95.8%?；赾p基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，BrYV-GL為BrYV-C基因型，與中國內(nèi)蒙古油菜BrYV（GenBank登錄號EF079907）分離物cp基因序列聚集在一起，親緣關(guān)系較近。BrYV cp基因共檢測到4個潛在重組事件，可為后續(xù)甘藍花葉病的研究和防治提供參考。

關(guān)鍵詞 甘藍；蕓薹黃化病毒（BrYV）；外殼蛋白（CP）；RT-PCR

甘藍（Brassica oleracea L.var. capitata L.）是十字花科蕓薹屬植物，葉球中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，具有產(chǎn)量高、對生長環(huán)境適應(yīng)性和抗逆性強等特點，在中國各蔬菜種植區(qū)廣泛分布[1-2]。2018年全國種植面積約98.3萬 hm 占世界的41%，產(chǎn)量3? 384萬 t，占世界的49%（FAO）。近年來，由于種植規(guī)模的不斷擴大，甘藍病毒病發(fā)生嚴重，成為制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素之一[3]。據(jù)報道，侵染甘藍的病毒主要有：蕪菁花葉病毒（turnip mosaic virus，TuMV）、蕪菁黃化病毒（turnip yellows virus，TuYV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、甘藍曲葉病毒（cabbage leaf curl virus，CaLCuV）、蕓薹黃化病毒（brassica yellows virus，BrYV）、花椰菜花葉病毒（cauliflower mosaic virus，CaMV）、煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、蕪菁黃花葉病毒（turnip yellow mosaic virus，TYMV）、蠶豆萎蔫病毒2（broad bean wilt virus2，BBWV2）和長葉車前花葉病毒（ribgrass mosaic virus，RMV）等，蘿卜隱狀病毒2（raphanus sativus cryptic virus2，RsCV2）和萵苣花葉病毒（lettuce mosaic virus，LMV）只在甘藍種子中被檢測到[4-14]。其中蕓薹黃化病毒（brassica yellows virus，BrYV）屬于馬鈴薯卷葉病毒屬（Polerovirus），黃癥病毒科（Luteoviridae），是一種新發(fā)現(xiàn)的多角體病毒，2015年首次在中國煙草中被發(fā)現(xiàn)和鑒定，可自然侵染豇豆、草莓和煙草等多種植物，引起黃化和卷葉癥狀[15-17]。BrYV基因組由一個正義單鏈RNA組成，包含7個開放閱讀框（ORF0，ORF1，ORF2，ORF3a，ORF3，ORF4和ORF5），其中P3是其外殼蛋白基因（coat protein，cp）[15，18-20]。根據(jù)序列比較和系統(tǒng)發(fā)育分析，已經(jīng)鑒定到3種BrYV基因型（BrYV-A、BrYV-B和BrYV-C）[21]。

小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）深度測序技術(shù)于2009年被Jan和Ana等首次提出并在被病毒感染的甘薯中進行應(yīng)用，該方法可以作為一種常規(guī)手段來檢測各類DNA或RNA病毒[22]。目前，siRNA已成為新病毒檢測的強有力工具，在未知病毒種類、序列以及特征信息等情況下，通過高通量測序結(jié)合生物信息學分析，獲得病毒的基因組序列[23]?？梢酝ㄟ^組裝來快速檢測和發(fā)現(xiàn)病毒，同時該方法具有適應(yīng)性強、靈敏度高和適應(yīng)范圍廣等特點，對病毒信息的了解更加全面，從而有助于未知病毒種類的發(fā)現(xiàn)[24]。目前siRNA測序技術(shù)在植物病毒鑒定中應(yīng)用廣泛，如陳雅寒等[25]在表現(xiàn)萎黃癥狀的杏樹樣品中發(fā)現(xiàn)存在亞洲李屬病毒1（asian prunus virus1，APV1）和亞洲李屬病毒3（asian prunus virus3，APV3）；龔明霞等[26]在廣西辣椒病毒病樣中發(fā)現(xiàn)10種病毒，其中小米椒內(nèi)源RNA病毒1（capsicum frutescens endornavirus1，CFEV1）、辣椒潛隱病毒2（pepper cryptic virus2，PCV2）、煙草輕型綠花葉病毒（tobacco mild green mosaic virus，TMGMV）和辣椒黃脈病毒（pepper vein yellows virus，PeVYV）在廣西辣椒上為首次發(fā)現(xiàn)，CFEV1在中國為首次發(fā)現(xiàn)。

本研究中利用siRNA技術(shù)對甘肅省蘭州市臨洮縣采集到的2株甘藍樣品葉片進行深度測序，通過生物信息學方法進行病毒序列分析，然后采用RT-PCR方法進一步對檢測結(jié)果進行驗證，并對甘藍BrYV分離物的cp全長序列進行擴增和遺傳進化分析，旨在進一步研究其發(fā)生及危害情況，為抗BrYV甘藍蔬菜品種選育和制定BrYV的防控措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

2020年7月在甘肅省臨洮縣采集到2株表現(xiàn)為花葉和皺縮等疑似病毒病的甘藍樣品，放入密封袋中，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.1.2 主要試劑及設(shè)備 主要試劑：Omega Plant RNA Kit（R6827）、TaKaRa Prime ScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）、TaKaRa Ex Taq○RDNA Polymerase和TaKaRa Mini BEST Agarose GEL DNA Extraction Kit試劑盒等。

主要設(shè)備：Centrisart○RD-16C通用臺式離心機（sartorius，德國）、iBrightTM? 1000系列成像系統(tǒng)（Invitrogen，美國）、2010 Geno/Grinder高通量動植物組研磨機（SPEX，美國）、Thermal Cycler PCR儀（MiniAmp，美國）和Unano-2000微量核酸分析儀（UMI，中國）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品總RNA提取及siRNA測序 按照Plant RNA Kit（R6827）說明書進行病葉總RNA提取，提取的RNA用35 μL RNase Free ddH2O溶解，利用Unano-2000微量核酸分析儀測定RNA濃度，RNA樣品于-80 ℃保存，備用。

RNA送至北京百邁客生物科技有限公司完成siRNA的分離、高通量測序以及cDNA文庫的構(gòu)建，測序平臺為Illumina Hiseq 2500。

1.2.2 樣品病毒序列分析 對測序后獲得的原始reads進行過濾，去除測序獲得片段的接頭和低質(zhì)量的序列，選取長度18～26 bp的sRNA，利用Bowtie 軟件與 GenBank Virus RefSeq核酸數(shù)據(jù)庫比對，初步鑒定甘藍樣品感染病毒的情況。使用Vevet 軟件對篩選后的有效sRNA進行序列組裝拼接獲得contigs，利用NCBI Nr（non-redundant protein sequences）、NCBI Nt（non-redundant nucleotide sequences）、GenBank Virus RefSeq Nucleotide和GenBank Virus RefSeq Protein等數(shù)據(jù)庫對獲得的contigs進行比對和分類注釋，篩選和鑒定引起甘藍花葉病的病毒種類。采用Blast算法比對，設(shè)定閾值e-value=1×10-5[27]。

1.2.3 樣品病毒RT-PCR檢測 cDNA合成：取1 μg RNA作為模板，加入1 μL Random 6 mars，1 μL dNTP Mixture，用RNase Free ddH2O補足至10 μL，65 ℃ 5 min；冰上迅速冷卻，后依次加入5×Prime ScriptⅡ Buffer 4 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、Prime ScriptⅡ RNase? ?1 μL、RNase Free ddH2O 4.5 μL，總體積20 μL；30 ℃ 10 min，95 ℃ 5 min，冰上冷卻。將所得cDNA于-20 ℃保存，備用。

用于以上病毒檢測的5對特異性引物見表1。所用引物均由西安擎科生物科技有限責任公司合成。RT-PCR反應(yīng)體系為：cDNA產(chǎn)物 ?2? μL、10×Ex Taq Buffer 2.5? μL、dNTP Mix 2.0? μL、10? μmol/L上下游引物各1? μL、Ex Taq酶 ?0.2? μL、用ddH2O補足至25? μL。反應(yīng)條件為： ?94 ℃變性3 min，然后是94 ℃ 30 s，X ℃退火 ?30 s（X值取自表1“退火溫度”），72 ℃延伸 ?1 min，共35個循環(huán)，最后 ?72 ℃ 10 min。所得PCR產(chǎn)物中加入4.2?? μL? 6×Loading Buffer，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外燈下觀察電泳結(jié)果并照相記錄。

1.2.4 BrYV cp全長序列克隆測序 將上述步驟擴增的BrYV cp基因序列經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，使用DNA回收試劑盒（TaKaRa）對產(chǎn)物進行切膠回收。純化產(chǎn)物與載體pMD19-T Vector（TaKaRa）連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，均勻涂布于含有50? μg/mL Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落過夜搖菌，菌落PCR篩選陽性克隆，鑒定為陽性的菌液提取質(zhì)粒。質(zhì)粒測序由西安擎科生物科技有限責任公司完成。

1.2.5 BrYV cp序列系統(tǒng)發(fā)育和同源性分析 測序后獲得的原始序列采用DNAMAN 6.0軟件進行校正和拼接，將得到的BrYV cp全長基因序列提交NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行BLASTn（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）序列比對分析。采用Vector NTI Advance11（Thermo Fisher Scientific，USA）和SDT軟件分析序列間核苷酸和氨基酸同源性，利用CLUSTAL W算法比對序列[30]；采用MEGA 7.0以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，自展校正值設(shè)置為1 000，顯示系統(tǒng)進化樹的閾值為50%。

1.2.6 BrYV cp 序列重組分析 采用RDP4軟件進行重組分析，利用RDP、BOOTSCAN、MACCHI、GENECONV、CHIMAERA、3SEQ和SISCAN等7種方法對獲得的BrYV分離物cp基因全長序列與從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得的14條BrYV cp基因核苷酸序列進行重組檢測分析，確定分離物的重組來源，分子類型選擇線性。參考Dhir等[31]的方法，以P≤0.05為標準，若序列被3種以上方法同時檢測到為有意義的重組事件；若序列被3種以下方法或者P>0.05檢測到可看作為假定的潛在重組事件。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品sRNAs測序結(jié)果

將甘藍葉片混合樣品提取總RNA，sRNAs進行測序，獲得12 568 877條原始數(shù)據(jù)，將原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量的reads、N含量超過10%的reads、去掉接頭后過長或過短的reads過濾去除掉，將sRNAs片段在18～26 bp的提取出來，共獲得 ?4 879 886條sRNA。將所得sRNAs與GenBank Virus RefSeq核酸數(shù)據(jù)庫進行比對。其中 ?1 566 293條sRNAs與BrYV相匹配，占匹配病毒總 ?sRNAs數(shù)的32.09%；1 461 095條sRNAs與TuMV相匹配，占匹配病毒總sRNAs數(shù)的 ?29.94%；798 143條sRNAs與CMV相匹配，占匹配病毒總sRNAs數(shù)的15.36%；557? 109條 ?sRNAs與BBWV 2相匹配，占匹配病毒總sRNAs數(shù)的11.42%；349? 867條sRNAs與TMV相匹配，占匹配病毒總sRNA數(shù)的7.17%（表2）。篩選結(jié)果表明，甘藍樣品中病毒種類主要是BrYV、CMV、TMV、TuMV和BBWV2共5種病毒。

用velvet軟件對篩選后的sRNA進行序列拼接獲得1 295條contigs，利用數(shù)據(jù)庫進行比對和分類注釋（表2）。結(jié)果表明，注釋到NCBI Nr、NCBI Nt、GenBank Virus RefSeq Nucleotide 和Protein等4個病毒數(shù)據(jù)庫的contigs分別為114、58、41和50條。對這些比對結(jié)果進行分析，其中注釋為TuMV的contigs為14條，注釋為BrYV的contigs為10條，注釋為CMV的contigs為6條，注釋為BBWV 2和TMV的contigs各為2條。這與sRNA病毒種類初步篩選一致。

2.2 樣品病毒檢測結(jié)果

甘藍感染BrYV后，葉片表現(xiàn)出花葉和皺縮癥狀（圖1-A）。利用特異性引物以合成的cDNA作為模板進行RT-PCR檢測，結(jié)果表明2份疑似病毒病的甘藍樣品中，擴增得到3條特異性條帶（圖1-B），測序結(jié)果顯示BrYV cp序列片段大小為576 bp；TuMV特異性片段大小為377 bp；CMV cp序列片段大小為760 bp，BBWV2和TMV均未檢測到。

2.3 BrYVcp序列分析

對測序后所獲得的BrYV cp原始序列采用DNAMAN 6.0軟件進行校正與拼接，獲得1條576 bp的甘藍病毒樣品分離物cp基因全長序列，命名為GL。采用BLASTn工具比對發(fā)現(xiàn)GL分離物與14個序列同源，核苷酸序列同源率為88.0%～96.4%；氨基酸序列同源率為90.1%～95.8%。說明測序所獲得的BrYV分離物和GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的14個BrYV株系具有很高的核苷酸和氨基酸同源性。

2.4 BrYV? cp系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將BrYV-GL的全長cp基因核苷酸序列與從美國NCBI數(shù)據(jù)庫中所隨機檢索到的14個cp基因核苷酸序列，使用MEGA 7.0軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖2），自展校正值設(shè)定為 ?1 000，顯示系統(tǒng)發(fā)育樹時閾值為50%。結(jié)果表明， BrYV-GL cp基因與已報道的中國內(nèi)蒙古油菜BrYV（GenBank登錄號EF079907）分離物cp基因序列聚集在一起，親緣關(guān)系較近。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果表明臨洮BrYV-GL cp基因?qū)儆贐rYV-C基因型。

2.5 BrYV? cp重組分析

采用RDP4軟件中RDP、GENECONV、BOOTSCAN、MAXCHI、CHIMAERA、SISCAN和3SEQ等7種方法，對BrYV-GL序列與NCBI獲得的14條BrYV cp基因序列進行基因重組分析，結(jié)果顯示，BrYV cp基因中檢測到4個潛在的重組事件（表3）。重組事件1重組位點在 ?150～537 nt，獲得4種算法支持，被認為是有意義的重組事件。最低P值為4.883×10-8（SiScan），分別以BrYV-GL和以中國油菜分離物BrYV-BJS（GenBank登錄號HQ388351）為親本。剩余3個潛在重組事件重組位點分別為55～523 nt、41～113 nt和40～149 nt。

3 討? 論

本研究采用sRNA深度測序技術(shù)從甘肅臨洮采集的2份病樣中共發(fā)現(xiàn)5種病毒，雖然測序結(jié)果提供了BBWV2和TMV的contigs，但是RT-PCR沒有檢測到這些病毒，這與siRNA測序和比對的過程中存在假陽性有關(guān)[25]。在測序過程中可能會有多個核苷酸依次加入。當遇到同聚物時，很難測量其實際長度，導致插入和刪除等測序錯誤。在比對過程中，同一DNA片段可能被map到多個位置，導致數(shù)據(jù)錯誤[32]；所參考的文獻中的引物特異性不強，與目的片段有多處結(jié)合位點導致了套峰的情況。因此，本研究在根據(jù)sRNA測序結(jié)果進行病毒的鑒定和分類中存在一定誤差。

BrYV為近年來發(fā)現(xiàn)的一種桿狀新病毒，通過蚜蟲以持久循回非增殖的方式進行傳播，現(xiàn)已在中國普遍流行[33]。Zhang等[34]對中國22個省十字花科作物中的BrYV、CMV和TuMV病毒做了詳細調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BrYV-C在所調(diào)查地區(qū)發(fā)病率最高，為中國最主要的基因型，并且BrYV 3種基因型可單一侵染，也可2種以上混合侵染，還可與其他2種病毒混合侵染。本研究通過對BrYV的外殼蛋白基因序列進行一致性分析、系統(tǒng)發(fā)育樹分析以及重組分析，明確其與BrYV（GenBank登錄號EF079907）之間的進化關(guān)系，并且還顯示其與韓國分離物（GenBank登錄號KF923236）有很近的親緣關(guān)系。這說明來自不同寄主，不同地區(qū)的分離物在分子生物學和生物學特性上存在較大相關(guān)性。并基于系統(tǒng)進化分析結(jié)果對臨洮甘藍BrYV分離物進行基因型鑒定，但由于受樣品數(shù)量的影響，臨洮地區(qū)是否存在BrYV-A和BrYV-B基因型，以及其是否存在混合侵染與其他寄主，有待進一步研究。本研究結(jié)果對BrYV的田間識別，選育抗病品種，開展綜合防治具有指導意義。同時今后還需要通過采集不同地區(qū)、不同時間和不同種類蔬菜作物以及擴大采集樣品數(shù)量，進行更多病毒檢測，為更好地了解臨洮當?shù)谺rYV的3種基因型的流行學信息以及其他病毒分布，為該地區(qū)蔬菜作物病毒病害的防控奠定基礎(chǔ)。

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Identification of? Viruses Causing Cabbage Mosaic Disease and Genetic Variation in BrYV

ZHONG Jianxin，LI Jianguo，WU Chonggao，JIAO Taizhi，HE Zhilan，CHEN Yahan and YANG Chengde

Abstract To identify viral pathogens associated with cabbage mosaic viruses，we conducted a high-throughput sequencing of the small interfering RNA （siRNA） of the leaf samples. Based on the? ?siRNA sequences，potential viral pathogens were detected，including the turnip mosaic virus （TuMV），cucumber mosaic virus （CMV），broad bean wilt virus2（BBWV2），tobacco mosaic virus （TMV） and brassica yellows virus （BrYV）. To confirm the existence of the viruses by RT-PCR，BrYV，TuMV and CMV were detected. Moreover，cloning and phylogenetic analysis were carried out on the coat protein （cp） of the BrYV. The cp fragments of the BrYV was 576 bp. Pairwise comparison analysis indicated that the nucleotide and amino acid sequence identities of the BrYV cp genes with other published BrYV BrYV isolates in NCBI were from 88.0%-96.4% and 90.1%-95.8%，respectively. A phylogenetic tree was reconstructed for BrYV using the cp gene sequence，indicating a close relationship between BrYV-GL （classified as BrYV-C genotype） and an isolate from Inner Mongolia （GenBank accession no. EF079907）.Four potential evidence of recombination was found among the 15 complete cp sequences. The results of this study may provide a theoretical reference for future research and control of the disease.

Key words Cabbage; Brassica yellow virus;Coat protein; RT-PCR

Received2022-07-27Returned 2022-08-18

Foundation item National Natural Science Foundation of China （No. 32160628）; Natural Science Foundation of Gansu Province （No.21JR7RA820）; Universities Innovation Foundation of Gansu Province （No.2021B-117）; the Start-up Funding of High-level Talent Researchers in Gansu Agricultural University （No. GAU-KYQD-2019-22）.

First author ZHONG Jianxin，male，master student. Research area：resource utilization and plant protection，functional components.E-mail：2294088150@qq.com

Corresponding?? author CHEN Yahan，female，Ph.D，associate professor. Research area：plant virology，functional components.E-mail：yhchen1018@nwafu.edu.cn

YANG Chengde，male，Ph.D，professor. Research area：plant pathology，functional components.E-mail：yangcd@gsau.edn.cn

（責任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）

收稿日期：2022-07-27修回日期：2022-08-18

基金項目：國家自然科學基金（32160628）；甘肅省自然科學基金（21JR7RA820）；甘肅省高等學校創(chuàng)新基金（2021B-117）；甘肅農(nóng)業(yè)大學人才啟動金（GAU-KYQD-2019-22）。

第一作者：仲健新，男，碩士研究生，研究方向為植物病理學。E-mail：2294088150@qq.com

通信作者：陳雅寒，女，博士，副教授，研究方向為植物病毒學。E-mail：yhchen1018@nwafu.edu.cn

楊成德，男，博士，教授，研究方向為植物病理學。E-mail：yangcd@gsau.edn.cn