王夢欽，董云龍，徐 達，陳曉波，張云峰，2

（1.云南師范大學生命科學學院，昆明 650500；2.生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程中心，昆明 650500）

多倍化是植物新物種形成的重要方式，在自然界中廣泛發(fā)生，可以幫助物種具備更廣泛的環(huán)境適應能力，在高等植物進化中占有重要地位［1］。植物多倍化后形成更大的營養(yǎng)儲存器官［2］，產生更快、更為豐富的次生代謝產物［3］，具有更強的抗病性和更好的環(huán)境適應性［4］。諸如異源多倍體化的燕麥（Avena sativa）、小麥（Triticum aestivum）、甘蔗（Saccharum officinarum）以及同源多倍體化的馬鈴薯（Solanum tuberosum）、草莓（Fragaria ananassa）、咖啡（Coffea arabicaL.）、煙草（Nicotiana tabacumL.）等為人類生產所利用［5］。燈盞花（Erigeron breviscapusHand.）又名短葶飛蓬、燈盞細辛，為菊科（Compositae）飛蓬屬植物，主要分布于中國云南省（占全國95%以上），少數分布于四川、貴州和西藏等地［6］，可用于治療高血壓、心腦血管病等多種疾病［7］。燈盞花人工大田栽培病蟲害嚴重，連作障礙明顯，嚴重制約了燈盞花產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［8］。燈盞花多倍體具有株型大、有效成分較高、抗性強等特性，進行燈盞花的多倍體品種選育是燈盞花育種的一種有效嘗試［9］。

傳統的植物倍性鑒定主要通過器官形態(tài)差異觀察、生理生化指標測定、氣孔大小檢測等方法進行推測，準確度不高。采用染色體計數法雖然直觀、準確，但對于染色體數目多、染色體小的植物而言，其技術要求相對較高［10］。流式細胞技術可針對細胞核中的DNA 進行熒光標記，快速準確地測定其DNA 含量和倍性水平［11］，已廣泛用于蘋果（Malus pumilaMill.）、梨（Pyrus communis）、桑樹（Morus albaLinn.）、菘藍（Isatis indigoticaFortune）、草莓、水稻（Oryza sativaL.）、櫻桃（Cerasus pseudocerasus G.Don）、馬鈴薯等的鑒別［12］。

菊科植物由于酚類、糖類物質含量較高，進行細胞裂解時易發(fā)生氧化反應造成細胞核沉積、黏連，影響了流式細胞儀的檢測效果，尤其是多倍體的檢測效果不佳。本研究通過對制樣方式、細胞核懸液及熒光染料染色劑等工藝進行優(yōu)化，建立燈盞花倍性鑒定的方法，旨在為燈盞花大規(guī)模的倍性鑒定奠定基礎，推動燈盞花的育種工作。

1 材料與方法

1.1 材料

以云南師范大學生物工程中心遺傳實驗室培養(yǎng)的二倍體和四倍體燈盞花為材料來源，選取在MS 培養(yǎng)基中正常生長3 周左右的幼嫩葉片為供試材料。

1.2 解離液及染色液的配制

共設計3 種細胞解離液和2 種PI 染色液，其配方成分詳見表1。

表1 解離液和染色液成分

1.3 制樣方法

1.3.1 機器研磨法 將葉片用滅菌dd H2O2沖洗干凈，擦干，放入離心管中加入鋼珠，同時加入2 mL 解離液，放入研磨機中，溫度設置為4 ℃，研磨1 min。

1.3.2 液氮研磨法 將葉片用滅菌dd H2O 沖洗干凈，擦干，放入研缽中，加入5～10 mL 液氮迅速研磨成粉末，然后加入2 mL 預冷的解離液，再將其轉入1.5 mL 離心管中插入冰上裂解30 min。

1.3.3 刀片切碎法 將葉片用滅菌dd H2O 沖洗干凈，擦干，放入培養(yǎng)皿中同時加入2 mL 解離液，用吉利刀片迅速切2 min。

1.4 植物組織單細胞制備方法

選取培養(yǎng)瓶中生長狀況好的幼嫩葉片，用滅菌dd H2O 沖洗干凈、擦干后，按照“1.3”方法進行樣品制備；隨后用400 目的濾膜過濾至1.5 mL 離心管中，于4 ℃下靜置10 min 后離心，轉速1 000～2 000 r/min離心5 min，棄上清液，取沉淀物。在試管中加入預冷的按照“1.2”方法制備的解離液1 mL，加20 μL 1 mg/mL 預冷的染料，使其懸浮液與染料結合，4 ℃避光保存15～20 min，用400 目的濾膜過濾至上機管中待測。

1.5 流式細胞術測定與數據分析

使用艾森生物ACEA NovoCyte 型流式細胞儀，按照儀器操作說明進行測定，采用NovoExpress 1.3.0軟件處理數據。以細胞核DNA 相對含量的總熒光強度為橫坐標，細胞核數量為縱坐標，繪制流式峰值圖；以細胞的總熒光強度為橫坐標，細胞核顆粒度為縱坐標，繪制流式散點圖。

2 結果與分析

2.1 不同方法制備的細胞核懸液效果比較

分別采用液氮研磨法、刀片切碎法和機器研磨法3 種方法制備燈盞花葉片樣品，使用流式細胞儀進行細胞核懸液效果檢測（圖1）。由圖1 可知，液氮研磨法和機器研磨法中細胞核沒有顯著聚集在一起，而刀片切碎法在總熒光強度106和106.2處分別呈現出細胞核的顯著聚集，且不同熒光強度的2 個細胞核群可以完全地分開，表明刀片切碎法收集到了完整的細胞核。此外，圖1c 中的細胞核聚集較為緊密，細胞核占比為67.77%。結果表明，刀片切碎法制備的燈盞花流式細胞樣品效果較好。

圖1 不同方法制備的細胞核懸液效果比較

2.2 不同細胞解離液解離的效果比較

采用3種細胞解離液分別對二倍體燈盞花（圖2）和四倍體燈盞花細胞（圖3）進行植物組織單細胞裂解。由圖2 可知，采用解離液Ⅰ處理燈盞花二倍體葉片細胞，燈盞花葉片的流式細胞檢驗圖峰型清晰且集中，在總熒光強度1.2 處出現峰值；解離液Ⅱ處理的樣品，檢驗圖出現了明顯的雜亂峰；解離液Ⅲ處理的樣品，峰型集中但不夠清晰，總熒光強度1.2 后有雜亂峰。由圖3 可知，解離Ⅰ處理的燈盞花四倍體葉片細胞出現了集中且清晰的2 個峰型，比二倍體更明顯；解離液Ⅱ和解離液Ⅲ處理的樣品，雖測出1 個峰，但峰型表現雜亂。結果表明，采用細胞解離液Ⅰ對燈盞花細胞進行裂解，不僅出峰清晰，且能較好地呈現出二倍體和四倍體細胞核DNA 峰型。因此，本研究選擇解離液Ⅰ。

圖2 不同解離液處理二倍體燈盞花葉片的流式細胞檢驗

圖3 不同解離液處理四倍體燈盞花葉片的流式細胞檢驗

2.3 不同染色液的效果比較

采用刀片切碎法制備樣品，經解離液Ⅰ裂解后的細胞懸液分別用不同公司的PI 染色液進行染色，結果（圖4）表明，使用BioFroxx 公司的粉末自配染色液可以明顯減少細胞碎片造成的背景干擾，染色效果明顯。因此，本研究選擇BioFroxx公司的PI 染色液。

2.4 對繼代苗體細胞變異的檢驗

在植物組織培養(yǎng)過程中，體細胞變異（Somaclonal variation）是時常發(fā)生的事件［13］，尤其是繼代數超過12 次以后。在燈盞花的組織培養(yǎng)過程中，發(fā)現再生植株呈現出不同的表型，對其葉片進行流式細胞測定，發(fā)現不同表型呈現出不同的峰型（圖5）。圖5a 燈盞花植株的流式細胞檢驗為二倍體，圖5b 為單倍體，圖5c 為四倍體，圖5d 為混倍體，并進行了驗證試驗。組織培養(yǎng)過程中最常見的遺傳不穩(wěn)定性是倍性變化［14］，體細胞無性系核型的改變包括染色體重排、非整倍體和整倍體。非整倍體可能是由染色體不分離、異常紡錘體、滯后染色體和/或染色體斷裂引起的［15］。其中，多倍體化是染色體數量上最常見的變化，通常由內多倍體化（核內重復或有絲分裂）或核聚變引起［16］。許多研究表明，基因型［15］、繼代培養(yǎng)次數、培養(yǎng)基類型、外植體狀況都會導致體細胞無性系變異［17］，尤其是培養(yǎng)基中2，4-d 的運用［18］。盡管如此，鮮見燈盞花組培中體細胞變異的相關報道。本研究表明，在燈盞花的組培快繁中的確存在體細胞變異。下一步可以利用組培過程中的變異體細胞篩選有用的變異株。

圖5 流式細胞檢驗優(yōu)化流程對燈盞花繼代再生苗的檢驗

3 小結

利用染色體計數方法鑒定植株倍性，雖準確率高但操作繁鎖，且技術要求高，所需材料為根尖，而取根通常會影響植物的正常生長，且不易鑒定出混倍體［10］。流式細胞檢測不僅操作簡單，取材多元化，且能測定基因組大小及鑒定混倍體。有許多因素會影響到流式細胞的檢驗結果，如材料來源［19］、細胞核解離液類型［20］、膜過濾次數［21］、DNA 熒光染料類型［22］等，尤其是材料選取不當，酚類、多糖、單寧等雜質的干擾會導致解離出來的單細胞核顆粒少，甚至形成較大的染色體峰。但是，采用適宜的解離液和解離方法可以消除此類干擾［23］。燈盞花多糖、酚類物質含量較高，本研究采用刀片研磨法制備樣品，選擇解離液I 進行植物組織裂解，使用Bio-Froxx 公司染料進行染色。優(yōu)化后的工藝不僅能較好地檢驗燈盞花的倍性，同時也能檢驗出再生植株中的混倍體和單倍體。建立的流式細胞術測定燈盞花倍性檢驗體系，可為燈盞花多倍體育種提供參考。