張慧敏,何曉勇,劉平穩(wěn),孫玉田

1.鄭州科技學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院 (鄭州 450064) 2.無錫中糧工程科技有限公司 (無錫 214035)

花青素是一種廣泛存在于自然界中的多酚類化合物,具有強(qiáng)抗氧化和清除自由基的功能,而且抗腫瘤、抗衰老等食藥價(jià)值極高[1]。葡萄中花青素主要集中在葡萄籽、皮中,從葡萄皮中提取花青素既可以提高葡萄皮的利用價(jià)值,又能更好的創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益[2]。目前,花青素的提取方法主要有酶法提取[3]、有機(jī)溶劑提取法[4]、微波提取法[5]、超聲提取法[6]等。其中,有機(jī)溶劑提取法提取率較低且比較耗時(shí),微波輔助提取法與酶法提取成本較高,且酶的活性受外界條件影響較大,而超聲輔助提取相對(duì)成本低廉,操作簡便[7]。因此本文以超聲輔助的方式,采用單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)來確定料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度三個(gè)因素對(duì)葡萄皮中花青素的提取的影響,從而獲得提取紫葡萄皮中花青素的最優(yōu)工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

巨峰葡萄,市購;原花青素,化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品,潤友化學(xué)有限公司;甲醇、無水乙醇、鹽酸、正丁醇、硫酸鐵銨,均為分析純,中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

UV-4802型紫外可見分光光度計(jì),尤尼柯(上海)儀器有限公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;BS224S型分析天平,北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;101-0ABs型真空干燥箱,上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司;TDL-50B型低速離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1紫葡萄皮的預(yù)處理

挑選較好的葡萄,洗凈后去掉果肉、籽,然后把葡萄皮均勻的平鋪在鐵盤上,放入烘箱內(nèi)45 ℃烘24 h烘干,裝進(jìn)密封袋內(nèi)避光保存,備用。

1.3.2花青素樣品的提取

準(zhǔn)確稱取1.0 g葡萄皮于錐形瓶內(nèi)加入20 mL的65%乙醇溶液,混合,在超聲功率200 W下,30 ℃超聲20 min。將超聲處理后的樣液倒入離心管內(nèi)以3 000 r/min離心15 min,用移液槍取0.1 mL的上清液于10 mL的比色管內(nèi)稀釋,用甲醇定容至刻度線。移液管吸取1 mL的稀釋液加入6 mL的正丁醇-鹽酸溶液(95∶5)和0.2 mL的2%硫酸鐵銨溶液,搖勻,放入烘箱100 ℃保溫40 min,冷卻15 min,用甲醇做空白對(duì)照,在546 nm的波長下測其吸光度[8]。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于甲醇中溶解,定容至10 mL的比色管內(nèi),用移液槍精確吸取0、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL移于10 mL的比色管內(nèi),用甲醇定容至刻度線,得到濃度為0、0.010、0.025、0.050、0.100、0.150、0.200 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。取1 mL的標(biāo)準(zhǔn)液于10mL的比色管內(nèi),加入6 mL(95∶5)正丁醇-鹽酸溶液0.2 mL 2%硫酸鐵銨溶液,搖勻,放入烘箱100 ℃保溫40 min,冷卻15 min,在546 nm下測吸光度。以花青素濃度C為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4單因素試驗(yàn)

(1)不同料液比對(duì)葡萄皮中花青素得率影響

精確稱取1.0 g葡萄皮于錐形瓶中,按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)料液比,分別加入65%乙醇溶液,按照1.3.2所述方法,研究不同料液比對(duì)葡萄皮花青素得率的影響。

(2)不同超聲時(shí)間對(duì)葡萄皮中花青素得率影響

精確稱取1.0 g葡萄皮于錐形瓶內(nèi)加入20 mL的65%乙醇溶液混合,按照1.3.2所述方法,通過設(shè)置不同的超聲時(shí)間,分別為20、30、40、50、60 min,研究不同超聲時(shí)間對(duì)從葡萄皮中提取花青素的影響。

(3)不同超聲溫度對(duì)葡萄皮中花青素得率影響

精確稱取1.0 g的葡萄皮于錐形瓶內(nèi)加入20 mL的65%乙醇溶液混合,按照1.3.2所述方法,通過設(shè)置不同的超聲溫度,分別為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃,研究不同的超聲溫度對(duì)葡萄皮中花青素提取的影響。

1.3.5響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,選擇對(duì)料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度為自變量,以Y紫葡萄皮花青素得率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)Box-Behnken工藝優(yōu)化試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

1.3.6葡萄皮中花青素含量計(jì)算

式中:C為稀釋過的上清液中花青素的質(zhì)量濃度,mg/mL;V為提取液的總體積,mL;N為稀釋倍數(shù);m為葡萄皮的質(zhì)量,g。

1.3.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

試驗(yàn)過程中每次平行取樣3次,對(duì)樣品進(jìn)行測定,通過Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,使用Origin繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。y=0.003 1x+0.751,R2=0.999?；ㄇ嗨刭|(zhì)量濃度在0.000～0.200 mg/mL內(nèi)的線性較好。

圖1 花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1不同料液比對(duì)花青素得率影響

由圖2可知,當(dāng)料液比(g/mL)在1∶10～1∶25時(shí),隨著料液比的增加,花青素得率也增大;當(dāng)料液比(g/mL)為1∶25時(shí),花青素得率最大,為21.17 mg/g;當(dāng)料液比(g/mL)大于1∶25時(shí),花青素得率降低,這可能是因?yàn)橐掖寄茏尰ㄇ嗨嘏c蛋白質(zhì)、多糖結(jié)合的氫鍵斷裂[9],使花青素提取量增加,當(dāng)乙醇過高時(shí),不利于提取液的濃縮,會(huì)對(duì)花青素的提取造成影響[1]。所以,葡萄皮花青素提取最適料液比(g/mL)為1∶25。

圖2 不同料液比對(duì)花青素得率的影響

2.2.2不同超聲時(shí)間對(duì)花青素得率影響

由圖3可知,當(dāng)超聲時(shí)間在20～50 min時(shí),隨著超聲時(shí)間的增加花青素的得率也增加;當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到50 min時(shí),花青素得率最大,為33.8 mg/g;當(dāng)超聲時(shí)間大于50 min時(shí),花青素得率降低。這可能是因?yàn)榛ㄇ嗨嘏c空氣中的氧氣接觸而被氧化,使花青素得率下降。所以葡萄皮花青素提取最適超聲時(shí)間為50 min。

圖3 不同超聲時(shí)間對(duì)葡萄皮中花青素得率的影響

2.2.2不同超聲溫度對(duì)花青素得率影響

由圖4可知,當(dāng)超聲溫度在30 ℃～50 ℃時(shí),隨著超聲溫度的上升花青素的得率呈上升趨勢;當(dāng)超聲溫度在50 ℃時(shí),花青素得率最大,為22.50 mg/g;當(dāng)超聲波溫度大于50 ℃時(shí),花青素得率呈下降趨勢。這可能是因?yàn)樵谝欢ǖ姆秶鷥?nèi)適當(dāng)?shù)脑黾映暅囟?能提高傳質(zhì)系數(shù)[10],降低溶劑粘度,有利于花青素的溶出,但是溫度過高時(shí),花青素也會(huì)被大量降解,影響花青素的得率。所以從葡萄皮中提取花青素的最適超聲溫度是50 ℃。

圖4 不同超聲溫度對(duì)葡萄皮中花青素得率的影響

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度均為影響顯著因素。利用DesignV8.0.6.1設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn),設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn),確定A料液比、B超聲時(shí)間、C、超聲溫度為自變量,以紫葡萄皮花青素得率為響應(yīng)值Y,得到Y(jié)與A,B,C二次回歸方程為:Y= -139.11+5.33A+1.42B+2.43C+0.004AB-0.002AC-0.008BC-0.105A2-0.012B2-0.020C2。試驗(yàn)設(shè)計(jì)最佳方案與結(jié)果見表3,方差分析結(jié)果見表4。

表3 葡萄皮中花青素響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)分析表

由表4可知,回歸模型P值<0.000 1為極顯著,失擬項(xiàng)P值為0.343 5>0.05則不顯著,從而可知回歸模型建立存在著可靠性?；貧w方程的決定系數(shù)R2為0.987 2,預(yù)測值與實(shí)際值擬合度較好,在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是可信的,試驗(yàn)條件合適。由方差分析表可看出,一次項(xiàng)A及二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)花青素得率的影響為極顯著(P<0.01),交互項(xiàng)BC對(duì)花青素得率的影響顯著(P<0.05),一次項(xiàng)B、C及交互項(xiàng)AB、AC對(duì)花青素得率的影響不顯著(P>0.05)。

由F值可知,三因素對(duì)葡萄皮中花青素得率的影響順序?yàn)?A料液比>B超聲時(shí)間>C超聲溫度。

2.3.2交互響應(yīng)面分析

三因素間交互影響的響應(yīng)面圖見圖5～圖7。當(dāng)A料液比、B超聲時(shí)間、C超聲溫度兩兩交互時(shí),由圖可以看出,三因素兩兩交互對(duì)花青素得率均有影響,各響應(yīng)面之間存在差異。各圖響應(yīng)面變化形式均呈現(xiàn)為先上升后下降的狀態(tài),這表明各圖都存在得率最大值點(diǎn)。

圖5 料液比和超聲時(shí)間交互間的響應(yīng)面圖

由圖5～圖7可以更加直觀地了解各種響應(yīng)因子對(duì)響應(yīng)值的影響,每個(gè)響應(yīng)面分別代表著兩個(gè)獨(dú)立變量之間的相互作用。三個(gè)因素與響應(yīng)值之間呈現(xiàn)拋物線關(guān)系,各因素的增加帶來的Y值的變化趨勢不同。由圖5、圖6可知,隨著A料液比的變化,得率出現(xiàn)一個(gè)較大曲面的弧度,其影響作用要大于B超聲時(shí)間、C超聲溫度。這也驗(yàn)證了A料液比因素,是響應(yīng)面分析中對(duì)響應(yīng)值影響作用最顯著的因子。由響應(yīng)面試驗(yàn)得到葡萄皮中花青素提取工藝預(yù)測值為:料液比25.96 (g/mL),超聲時(shí)間49.97 min,超聲溫度49.97 ℃,此時(shí)葡萄皮花青素的得率為25.67 mg/g。

圖6 料液比和超聲溫度交互間的響應(yīng)面圖

圖7 超聲時(shí)間和超聲溫度交互間的響應(yīng)面圖

2.3.3響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)

為便于操作,將工藝條件調(diào)整為料液比(g/mL)1∶26、超聲時(shí)間50 min,超聲溫度50 ℃,在此條件下進(jìn)行試驗(yàn),測出葡萄皮花青素得率的平均值為25.50 mg/g,驗(yàn)證試驗(yàn)值與優(yōu)化預(yù)測值相符率高達(dá)99.3%,驗(yàn)證試驗(yàn)值與優(yōu)化預(yù)測值之間良好的擬合性,進(jìn)一步表明了模型的有效性。

3 結(jié)論

本文以紫葡萄皮為原料,采用65%乙醇超聲波輔助法提取花青素,通過采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn),以花青素提取量為依據(jù),對(duì)料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度三個(gè)影響因素進(jìn)行測定,優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明:花青素提取的最優(yōu)工藝為料液比1∶26(g/mL)、超聲時(shí)間50 min,超聲溫度50 ℃,在此最佳條件下葡萄皮花青素得率為25.50 mg/g。本研究可為超聲波輔助有機(jī)溶劑從葡萄皮中提取花青素提供理論依據(jù),且提取工藝簡單、安全、無害。