李軻，田玉潔，田雨晴，李美嬉，郝敬虹，楊柳

（農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/植物生產(chǎn)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心/北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206）

0 引言

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)是唇形科黃芩屬多年生草本植物[1]。黃芩地上部分和地下部分的成分相似，即都含有豐富的黃酮類(lèi)物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒和清熱解毒的生物活性和藥理活性[2-4]。黃芩根作為傳統(tǒng)中藥使用，性寒[5]，味苦[6]，有清熱燥濕[7]、瀉火清心[8]等功效。黃芩莖葉具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎抗病毒等作用[9]。近年來(lái)，為擴(kuò)大利用資源，增加黃芩的附加值，對(duì)黃芩的地上、地下部分的化學(xué)成分和藥理作用研究日益增多[10-11]。

近年來(lái)，黃酮化合物在醫(yī)藥[12]、食品[13]、化妝品[14]等方面應(yīng)用廣泛，黃酮類(lèi)化合物含量的研究方興未艾。靳維榮[15]采用HPLC法（高效液相色譜法）同時(shí)測(cè)定黃芩中6種黃酮類(lèi)成分（野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、芹菜素、漢黃芩素和白楊素）的含量。魏亞楓等[16]采用HPLC 法（高效液相色譜法）測(cè)定黃芩與黃芩茶中的5種黃酮類(lèi)成分（黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A）的含量。黃芩整株都有利用價(jià)值，現(xiàn)有研究對(duì)黃芩根較深入[17-18]，忽視了對(duì)黃芩莖葉的研究，尤其是黃芩根部與莖葉部位黃酮含量的差異未見(jiàn)報(bào)道。為了探究黃芩不同部位黃酮含量，本試驗(yàn)采用HPLC法（高效液相色譜法）同時(shí)測(cè)定黃芩中12種黃酮成分，耗時(shí)短，可測(cè)定黃芩不同生長(zhǎng)部位以及整個(gè)生長(zhǎng)期的12 種黃酮含量?！吨袊?guó)藥典》[5]中規(guī)定利用高效液相色譜法測(cè)定黃芩含量，且只測(cè)定了黃芩苷，要求結(jié)果中含黃芩苷不得少于9%，本研究方法測(cè)定黃芩莖葉、黃芩根中黃芩苷含量均高于9%，測(cè)得數(shù)據(jù)在《中國(guó)藥典》通則0512“高效液相色譜法”中規(guī)定允許變動(dòng)的條件范圍內(nèi)進(jìn)行。

本研究采用HPLC法（高效液相色譜法）測(cè)定黃芩苷、黃芩苷、木犀草素、漢黃芩苷、芹菜素、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、白楊素、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷、紅花素等12種黃酮類(lèi)化合物的含量，為黃酮類(lèi)物質(zhì)檢測(cè)提供一種更加簡(jiǎn)便、快捷的檢測(cè)方法，同時(shí)為黃芩資源開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1200 型液相色譜儀（包括四元溶劑泵、脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、光電二級(jí)管陣列檢測(cè)器及軟件），超聲波發(fā)生器（深圳市歐泊創(chuàng)新設(shè)備有限公司），高速多功能粉碎機(jī)（武義鼎藏日用金屬制品廠），萬(wàn)分之一天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品色譜圖

1.2 藥品和試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：野黃芩苷（批號(hào)：Y01201905020）、黃芩苷（ 批號(hào)：H00811206032）、木犀草素（ 批號(hào)：M00702004028）、漢黃芩苷（批號(hào)：H01911809030）、芹菜素（ 批號(hào)：Q00211801029）、黃芩素（ 批號(hào)：H01411203026）、漢黃芩素（批號(hào)：H02004007026）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京盛世康普化工科技研究所院；千層紙素A（批號(hào)：Q02011809028）、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（批號(hào)：S54787）、白楊素（批號(hào)：S00408）、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷（批號(hào)：S69457）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京譜析科技有限公司；紅花素（批號(hào)：211006）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。甲醇、乙腈為色譜純級(jí)（Fisher scientific公司），磷酸為分析純級(jí)（上海麥克林生化科技有限公司），水為娃哈哈純凈水（上海娃哈哈飲用水有限公司），黃芩莖葉，黃芩根。試驗(yàn)所用的黃芩采自房山區(qū)蒲洼鄉(xiāng)，經(jīng)北京農(nóng)學(xué)院徐踐老師驗(yàn)證，鑒定均為唇形科植物黃芩S.baicalensis Georgi.的干燥莖葉和根。

1.3 HPLC法測(cè)定

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：乙腈(A)，0.1%磷酸水(B)，梯度洗脫見(jiàn)表1。在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示，各峰分離情況良好。色譜見(jiàn)圖1。

表1 梯度洗脫條件

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)品野黃芩苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、紅花素、黃芩苷、木犀草素、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、芹菜素、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A 5 mg（精確到小數(shù)點(diǎn)后4 位），置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，4℃冷藏，備用。

1.5 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

取野黃芩苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、紅花素、黃芩苷、木犀草素、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、芹菜素、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度50、50、60、20、20、20、10、12.5、70、15、35、100 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.6 樣品溶液的制備

以黃芩莖葉為例，將黃芩樣品切段，用高速多功能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60 目篩得黃芩樣品粉末，稱(chēng)取黃芩莖葉粉末1 g（精確到小數(shù)點(diǎn)后4 位），置于250 mL 錐形瓶中，加入適量70%甲醇（第1次提取加20 mL 70%甲醇，第2 次第3 次提取加10 mL 70%甲醇），超聲提取3次，每次40 min。定容至50 mL 容量瓶中，搖勻，用0.45 μm 針頭過(guò)濾器過(guò)濾即得樣品溶液。如測(cè)定樣品為黃芩根部，應(yīng)稱(chēng)取黃芩根粉末0.5 g（精確到小數(shù)點(diǎn)后4位），其他步驟不變。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析。以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得12種成分的回歸方程，結(jié)果表明各成分在相應(yīng)進(jìn)樣量范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。線性關(guān)系考察結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2 精密度試驗(yàn)

稱(chēng)取黃芩根粉末0.5 g（精確到小數(shù)點(diǎn)后4 位），按“2.4”方法制備樣品溶液，按“2.1”色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣3次，結(jié)果見(jiàn)表3，野黃芩苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、紅花素、黃芩苷、木犀草素、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、芹菜素、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A 峰面積的RSD分別為0.07%、4.41%、1.11%、1.95%、0.30%、0.28%、0.37%、0.12%、0.27%、0.30%、0.30%、0.91%，表明該方法精密度良好。

表3 精密度考察結(jié)果(n=3)

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

稱(chēng)取黃芩根粉末0.5 g（精確到小數(shù)點(diǎn)后4 位），按“2.4”方法制備3份樣品溶液，按“2.1”色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4，野黃芩苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、紅花素、黃芩苷、木犀草素、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、芹菜素、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A 峰面積的RSD分別為0.26%、1.70%、1.92%、1.61%、0.20%、0.46%、0.38%、4.01%、1.34%、1.38%、1.30%、2.16%，表明方法重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性考察結(jié)果(n=3)

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱(chēng)取黃芩根粉末0.5 g（精確到小數(shù)點(diǎn)后4 位），按“2.4”方法制備樣品溶液，按“2.1”色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，放置不同時(shí)間后進(jìn)行進(jìn)樣，分別在第0、6、12、24、48 h后間隔進(jìn)樣，考察溶液穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表5，野黃芩苷、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、紅花素、黃芩苷、木犀草素、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷、漢黃芩苷、芹菜素、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A 峰面積的RSD分別為0.43%、4.45%、1.11%、2.11%、0.59%、0.41%、0.46%、4.21%、0.55%、0.31%、1.55%、0.99%，表明樣品溶液48 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表5 穩(wěn)定性考察結(jié)果(n=5)

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

稱(chēng)取已知含量的黃芩莖葉粉末1 g（精確到小數(shù)點(diǎn)后4位）和黃芩根粉末0.5 g（精確到小數(shù)點(diǎn)后4位），各平行操作3份，置于錐形瓶中，分別加入各標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，按“2.4”方法制備的樣品溶液，并按“2.1”色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，各進(jìn)樣10 μL，計(jì)算其回收率，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.6 樣品含量測(cè)定

分別稱(chēng)取黃芩莖葉粉末1 g（精確到小數(shù)點(diǎn)后4位）和黃芩根粉末0.5 g（精確到小數(shù)點(diǎn)后4 位），按“2.4”方法制備樣品溶液，按“2.1”色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，用外標(biāo)法計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 平均樣品含量(n=3)

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)有研究對(duì)黃芩根較深入，忽視了對(duì)黃芩莖葉的研究，尤其是黃芩根部與莖葉部位黃酮含量的差異未見(jiàn)報(bào)道。采用HPLC 法，色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫，建立一種測(cè)定黃芩中十二種黃酮類(lèi)成分含量的測(cè)定方法。

在整株黃芩中，黃芩根的黃酮成分主要為黃芩苷和黃芩素[19-20]，莖葉中除野黃芩苷和黃芩苷外還有黃芩素、野黃芩素、白楊素、木犀草素、芹菜素等多種黃酮成分[21-22]，莖葉與根成分的種類(lèi)與含量存在明顯差異，現(xiàn)有研究對(duì)黃芩根比較深入，忽視了對(duì)黃芩莖葉的研究。為了達(dá)到測(cè)定需求，選擇黃芩苷、黃芩苷、木犀草素、漢黃芩苷、芹菜素、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、白楊素、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷、紅花素等12 種黃酮類(lèi)成分，用一種方法同時(shí)測(cè)定黃芩中十二種黃酮類(lèi)成分的含量，體現(xiàn)出黃芩不同部位黃酮物質(zhì)的分布情況。由表7 可以得出，黃芩根中的十二種黃酮總量為106.5819 mg/g，2020 年春季黃芩莖葉的黃酮總量為107.3057 mg/g，2020 年秋季黃芩莖葉的黃酮總量為37.8509 mg/g，可以看出不同時(shí)期，不同部位的黃芩中12種黃酮類(lèi)成分含量都可用此方法測(cè)定。

本試驗(yàn)以黃芩中黃酮類(lèi)物質(zhì)多組分分離為目的，在同一色譜條件下分離多種成分。通過(guò)對(duì)甲醇、乙腈與不同濃度磷酸溶液的流動(dòng)相體系進(jìn)行考察，結(jié)果表明，甲醇-磷酸溶液系統(tǒng)中紅花素與芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的色譜峰無(wú)法分離，漢黃芩素、白楊素與千層紙素A的色譜峰無(wú)法分離，乙腈-磷酸溶液系統(tǒng)作為流動(dòng)相對(duì)黃芩各成分的分離度較好，通過(guò)試驗(yàn)，確定乙腈-0.1%磷酸溶液體系可達(dá)到同時(shí)測(cè)定黃芩根、莖葉中黃酮含量的檢測(cè)要求。本方法分離效果好、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、靈敏度高，檢測(cè)方法可行。目前正在探索黃芩中更多黃酮類(lèi)物質(zhì)，應(yīng)用所建立的方法測(cè)定不同生長(zhǎng)部位、不同生長(zhǎng)期黃芩中的黃酮成分和含量，為黃芩資源的使用提供效率。

本試驗(yàn)建立的12種黃酮成分含量的方法，測(cè)定黃芩中12 種黃酮類(lèi)物質(zhì)在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r＞0.98)，平均加樣回收率分別為99.7214%、92.7039%、103.9755%、100.5837%、92.4819%、93.2465%、99.6387%、104.3866%、95.0767%、95.3245%、92.2161%、95.3995%(RSD＜5)。線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均滿(mǎn)足分析要求，適用于黃芩根部及莖葉中12種黃酮類(lèi)成分的檢測(cè)。