陳婷珍，劉佩本，李艷秀，左祥榮

肺高血壓（pulmonary hypertension，PH）目前被定義為靜息時肺動脈平均壓（mean pulmonary artery pressure，mPAP）＞20 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）［1］。肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是PH分類中的第一大類，其以肺動脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）異常增殖和內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能紊亂導(dǎo)致的管壁增厚、肺血管重構(gòu)為病理特征，而不可逆的肺血管重構(gòu)和肺動脈壓持續(xù)升高會進(jìn)一步導(dǎo)致右心衰竭，從而導(dǎo)致患者死亡［2-3］。PAH的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前關(guān)于PAH的治療主要為擴(kuò)張肺血管，但研究報道，經(jīng)積極治療的PAH患者的5年生存率為70%左右，且治療費(fèi)用昂貴、臨床預(yù)后差［4］。大量臨床前研究重點(diǎn)關(guān)注抗炎、抑制PASMCs增殖、促PASMCs凋亡及免疫調(diào)節(jié)等機(jī)制以尋求PAH的精準(zhǔn)治療方案，但在臨床上仍未取得突破性進(jìn)展［5］。因此，進(jìn)一步闡明PAH的細(xì)胞分子機(jī)制，進(jìn)而尋找潛在的特異性治療靶點(diǎn)是當(dāng)前學(xué)術(shù)界關(guān)注的熱點(diǎn)。

RNA甲基化修飾作為表觀遺傳學(xué)修飾領(lǐng)域調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的關(guān)鍵過程，可廣泛參與真核細(xì)胞生物的生命活動，并作為各種生物生長發(fā)育過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在不改變基因序列的情況下其可通過調(diào)控甲基的可逆修飾而影響細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)［6］。大量研究表明，RNA甲基化修飾在腫瘤、心血管疾病、代謝性疾病等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，其已成為未來治療這些疾病的潛在靶點(diǎn)［7-12］。近年來有關(guān)RNA甲基化修飾在PAH發(fā)病中的作用也逐漸引起國內(nèi)外學(xué)者的重視［13-14］。本文旨在探討RNA甲基化修飾在PAH發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，以期為RNA表觀遺傳學(xué)在PAH中的機(jī)制研究、精準(zhǔn)治療以及預(yù)后判斷提供新思路。

1 RNA甲基化修飾概述

1.1 RNA甲基化修飾的種類和作用 RNA修飾是一種轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控方式，其廣泛分布在包括信使RNA（messenger RNA，mRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA）、核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）在內(nèi)的150多種RNA上。1974年，N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）修飾首次在細(xì)胞mRNA上被發(fā)現(xiàn)，其是mRNA中豐度最高的甲基化修飾形式，被認(rèn)為是目前最普遍、最豐富的一種RNA修飾方式，在多種生物的生長發(fā)育及代謝過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用［15-16］。m6A失調(diào)可能會導(dǎo)致炎癥、心血管疾病、腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生［17-18］。除此之外，非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）的m6A在細(xì)胞的生理功能中也起著關(guān)鍵作用，約67%的mRNA的m6A峰3'-UTR有ncRNA的結(jié)合位點(diǎn)［19］。除m6A外，RNA甲基化修飾還包括N1-甲基腺嘌呤（N1-methyladenosine，m1A）、5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）和7-甲基鳥苷（7-methylguanosine，m7G）修飾。作為新型RNA甲基化修飾，m5C修飾和m7G修飾的作用也在mRNA及ncRNA中被證實(shí)，二者均可調(diào)節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄、翻譯、出核及穩(wěn)定性等［20-22］，且在細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激等生物學(xué)功能中起著關(guān)鍵作用［23］。

1.2 m6A修飾主要蛋白及其功能 m6A修飾主要蛋白有三類：甲基轉(zhuǎn)移酶（Writers）可以催化m6A的發(fā)生；去甲基化酶（Erasers）可以催化去甲基化過程；甲基識別蛋白（Readers）通過直接或間接與甲基化位點(diǎn)結(jié)合而促進(jìn)翻譯表達(dá)。

1.2.1 Writers Writers 主要包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（methyltransferase-like 3，METTL3）、甲基轉(zhuǎn)移酶樣14（methyltransferase-like 14，METTL14）、Wilm腫瘤1相關(guān)蛋白（Wilms tumor 1-associated protein，WTAP）。METTL3作為第一個被發(fā)現(xiàn)的Writers，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）作為甲基供體的催化亞基，但其與METTL14一起成體系才有活性［24］。METTL14主要起支撐、穩(wěn)定復(fù)合物的作用，并能夠識別特定的5'-RRACH-3'序列，將其作為催化底物［25］。一項(xiàng)來自斑馬魚的研究表明，WTAP為Writers中唯一沒有催化活性的亞基，其能夠?qū)TAPMETTL3-METTL14復(fù)合物募集并錨定到富含mRNA前體加工因子的核斑點(diǎn)，該核斑點(diǎn)是m6A動態(tài)調(diào)節(jié)的發(fā)生部位，WTAP在RNA選擇性剪接和基因表達(dá)中至關(guān)重要［26］。

1.2.2 Erasers Erasers包括脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）和AlkB同源蛋白5（AlkB homolog 5，ALKBH5）。FTO與核斑點(diǎn)標(biāo)志分子SC35和轉(zhuǎn)錄酶RNA PolⅡ有共定位，并可募集到核斑點(diǎn)擦除mRNA上的m6A修飾位點(diǎn)。ALKBH5屬于α-酮戊二酸鹽依賴型雙加氧酶，其表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞質(zhì)中的mRNA表達(dá)降低，m6A明顯升高，其有催化Erasers活性并調(diào)控mRNA輸出和RNA代謝的作用［25］。

1.2.3 Readers Readers主要有YTH結(jié)構(gòu)域蛋白家族（YTH domain family protein，YTHDF）1、YTHDF2、YTHDF3、YT512-同源結(jié)構(gòu)域蛋白（YT512-B homology domaincontaining protein，YTHDC）1、YTHDC2、異質(zhì)核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，HNRNP）家族、胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白（insulin-like growth factor 2 binding protein，IGF2BP）1、IGF2BP2、IGF2BP3等［26-27］。其中YTHDF1具有募集翻譯的起始復(fù)合物以促進(jìn)翻譯的作用，且YTHDF1和YTHDF2、YTHDF3均具有運(yùn)輸mRNA、促進(jìn)RNA降解的作用［28］。此外，YTHDF2還可以促進(jìn)mRNA的剪切。YTHDC1主要與mRNA的可變剪切和核轉(zhuǎn)運(yùn)作用有關(guān)［29-30］。此外，YTHDC1還可以迅速結(jié)合ncRNA如X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄子（X-inactive specific transcript，XIST）、富核轉(zhuǎn)錄因子1（nuclear enriched abundant transcript 1，NEAT1）和肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）上的m6A位點(diǎn)，進(jìn)而介導(dǎo)ncRNA的m6A修飾［31］。YTHDC2可結(jié)合的m6A位點(diǎn)較少，通常以選擇性結(jié)合的方式與甲基化位點(diǎn)結(jié)合并促進(jìn)mRNA翻譯。有研究表明，YTHDC2可以通過招募5'-3'的外切核糖核酸酶Xrn1而促進(jìn)RNA降解［32］。HNRNP家族主要起識別功能，HNRNPA2/B1被報道可識別初級miRNA的m6A， 修飾從而促進(jìn)其加工［33］。除此之外，IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3也可識別m6A修飾并通過m6A修飾依賴而促進(jìn)mRNA的穩(wěn)定和翻譯作用［34］。

綜上，m6A修飾主要通過Writers、Erasers、Readers動態(tài)調(diào)控mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯、剪接、折疊、降解和輸出，進(jìn)而在基因表達(dá)和各種生命活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用［35］。

2 m6A修飾在PAH中的作用機(jī)制

2.1 Writers主要蛋白METTL3和Readers主要蛋白YTHDF在PAH中的作用機(jī)制 m6A修飾在PAH發(fā)生發(fā)展中的作用已引起許多學(xué)者的關(guān)注，其中Writers主要蛋白METTL3在PAH中的作用研究得最為深入。為了探討低氧導(dǎo)致的PAH中m6A修飾的變化，XU等［36］檢測了新生SD大鼠PAH模型中總m6A修飾以及Writers主要蛋白的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總m6A修飾沒有明顯變化，但除了WTAP表達(dá)無差異外，其他Writers主要蛋白表達(dá)均下調(diào)；然后通過RNA甲基化免疫共沉淀高通量測序（methylated RNA immunoprecipitation sequencing，MeRIPseq）和基因本體（gene ontology，GO）技術(shù)分析得出，PAH的發(fā)展可能與低氧導(dǎo)致的METTL3持續(xù)低表達(dá)影響了PAH血管相關(guān)基因的m6A修飾有關(guān)。該研究揭示了m6A修飾可能是調(diào)節(jié)低氧導(dǎo)致的PAH和肺發(fā)育關(guān)鍵基因表觀遺傳修飾的一種生物標(biāo)志物，且m6A修飾可能是PAH潛在的治療靶點(diǎn)。然而，m6A修飾與PAH之間的具體調(diào)控機(jī)制以及如何通過調(diào)控m6A修飾來治療PAH仍需要進(jìn)一步探索。QIN等［37］通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)的PASMCs異常增殖和成年大鼠PAH模型中m6A修飾和METTL3表達(dá)升高，被閱讀蛋白YTHDF2識別后促進(jìn)其關(guān)鍵靶基因PTEN的降解，從而促進(jìn)PASMCs增殖和遷移，提示METTL3可能通過影響PASMCs的功能而調(diào)控PAH。該研究不僅證實(shí)了m6A修飾通過調(diào)控PASMCs增殖和遷移來導(dǎo)致PAH，而且進(jìn)一步表明了Writers主要蛋白METTL3作為PAH中m6A修飾潛在治療靶點(diǎn)的可能性及其機(jī)制。

同時，METTL3失調(diào)介導(dǎo)的PASMCs異常增殖和血管重構(gòu)過程中Readers主要蛋白YTHDF的作用也引起了關(guān)注。HU等［38］在多種PAH模型中發(fā)現(xiàn)總m6A修飾、YTHDF1表達(dá)水平升高，并首次驗(yàn)證了YTHDF1通過促進(jìn)黑色素瘤抗原家族D1（melanoma antigen family D1，MAGED1）的翻譯而促進(jìn)PASMCs增殖和肺血管重構(gòu)，從而導(dǎo)致PAH的發(fā)生發(fā)展，且METTL3也參與了這一過程。以上研究表明，METTL3和YTHDF的相互作用可能在PAH的m6A修飾中起著重要作用，但這種作用還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，METTL3在被YTHDF識別后介導(dǎo)PASMCs異常增殖和肺血管重構(gòu)的具體機(jī)制可能為通過靶向調(diào)控m6A修飾來治療PAH提供了最有前途和吸引力的方法。

2.2 Writers和Readers的其他蛋白在PAH中的作用機(jī)制METTL14作為另一個比較重要的Writers的主要蛋白，在PAH發(fā)生中至關(guān)重要。ZHOU等［39］研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠PAH模型和PASMCs中m6A修飾、METTL14和YTHDF2表達(dá)增加，而特異性敲除PASMCs中的Setd2可降低METTL14表達(dá)水平，逆轉(zhuǎn)低氧導(dǎo)致的右心室收縮壓、平均動脈壓及mPAP升高，提示Setd2和METTL14是防治PAH及保護(hù)右心功能的靶點(diǎn)，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。LIU等［40］研究也發(fā)現(xiàn)，PAH患者和小鼠PAH模型肺組織中總m6A修飾和METTL14表達(dá)水平升高，并通過m6A-RIP首次發(fā)現(xiàn)YTHDF2可通過調(diào)節(jié)METTL14與GRAP的結(jié)合、抑制RAS/ERK信號通路而抑制PASMCs的過度增殖和遷移，進(jìn)而減輕PAH。該研究第一次突出了甲基化修飾GRAP的功能，為以METTL14/YTHDF2/GRAP軸為靶點(diǎn)治療PAH提供了依據(jù)。更重要的是，這兩項(xiàng)研究不僅更新了研究者對除METTL3外的甲基化轉(zhuǎn)移酶調(diào)控PASMCs增殖在PAH中的作用的認(rèn)識，也為尋找新的治療PAH的表觀遺傳學(xué)靶點(diǎn)提供了充分的證據(jù)。

除此之外，CHEN等［41］研究發(fā)現(xiàn)，肺動脈中METTL14表達(dá)水平升高可導(dǎo)致血管鈣化，這為探索METTL14治療PAH機(jī)制研究提供了新的思路和研究方向。雖然目前關(guān)于WTAP在PAH發(fā)生發(fā)展中作用的研究相對較少，但其作用不容忽視。XIN等［42］首次提出，WTAP介導(dǎo)的谷胱甘肽過氧化物酶4的m6A修飾會觸發(fā)PASMCs中的鐵死亡和肺纖維化，但其介導(dǎo)的m6A修飾在PAH形成中的具體作用尚不清楚。

2.3 Erasers在PAH中的作用機(jī)制 既往研究顯示，大鼠PAH模型中FTO和ALKBH5表達(dá)水平降低［36-37，41］。ZENG等［43］通過GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO和ALKBH5可能通過調(diào)節(jié)炎癥、糖酵解相關(guān)基因和血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）信號通路相關(guān)基因等的表達(dá)而參與PAH的發(fā)生。目前關(guān)于FTO和ALKBH5介導(dǎo)m6A修飾而參與PAH的研究尚淺，但其潛在的研究價值和臨床意義卻見微知著。MATHIYALAGAN等［44］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO過表達(dá)能抑制心肌纖維化并促進(jìn)血管生成，但FTO表達(dá)升高能否促進(jìn)PAH血管新生還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。這也意味著FTO和ALKBH5調(diào)控PAH的機(jī)制研究空間非常大，深入研究FTO和ALKBH5表達(dá)降低是否參與調(diào)控PASMCs增殖和遷移是PAH治療的新靶點(diǎn)。

2.4 ncRNA m6A修飾在PAH中的作用機(jī)制 除mRNA外，ncRNA也含有豐富的m6A修飾。lncRNA和miRNA在肺血管重塑中至關(guān)重要［45-46］。目前關(guān)于ncRNA m6A修飾的研究大多聚焦于腫瘤的發(fā)生，對PAH的關(guān)注較少。2020年，SU等［47］首次揭示環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）即circXpo6和circTmtc3的m6A修飾降低會通過circRNA-miRNA-mRNA表達(dá)網(wǎng)絡(luò)而促進(jìn)PASMCs增殖，這為ncRNA m6A修飾在PAH中的機(jī)制研究提供了新的思路和方向。一項(xiàng)研究提示，HNRNPA2/B1可能通過與lncRNA/miRNA/mRNA相互作用、促進(jìn)PASMCs表型轉(zhuǎn)換而在PAH中發(fā)揮作用［13］，但該結(jié)論仍需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

3 m5C修飾在PAH中的作用機(jī)制

與m6A修飾類似，m5C修飾也主要依賴Writers、Erasers及Readers的調(diào)節(jié)而發(fā)揮生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA的穩(wěn)定性、翻譯、線粒體活性等［48］。m5C修飾的Writers主要有NOL1/NOP2/sun（NSUN）甲基轉(zhuǎn)移酶和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶類似物DNMT2；m5C修飾的Readers主要有Aly/REF輸出因子（Aly/REF export factor，ALYREF）和Y-框結(jié)合蛋白1（Y-box bindingprotein 1，YBX1）；m5C修飾的Erasers指10-11易位蛋白（ten-eleven translocation，TET）1、TET2、TET3［49］。

HIRAIDE等［50］報道，145例日本PAH患者中TET2突變的頻率較高。此外，POTUS等［51］研究發(fā)現(xiàn)，0.39%的PAH患者有12個TET2突變，且TET2基因敲除小鼠會發(fā)生不良肺血管重構(gòu)和炎癥，并發(fā)展為PAH。不同種族PAH患者白細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶的表達(dá)存在差異，并且與PAH嚴(yán)重程度相關(guān)：西班牙裔/非洲裔美國PAH患者DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1和TET2、TET3的表達(dá)水平高于高加索PAH患者，肺毛細(xì)血管楔壓也更高［52］。

4 m7G修飾在PAH中的作用機(jī)制

作為新型RNA甲基化修飾，m7G修飾在PAH中的研究較少，但已經(jīng)得到學(xué)者的關(guān)注。研究顯示，m7G修飾基因表達(dá)與PAH的發(fā)生有關(guān)［53］。m7G修飾在真核生物mRNA中是帶正電荷的5'帽修飾，同時也普遍存在于rRNA、tRNA和lncRNA中，WANG等［54］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠PAH模型中l(wèi)ncRNA m7G修飾降低，并首次進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果顯示，上調(diào)的m7G lncXR_591973和m7G lncXR_592398可能參與PAH的血管平滑肌收縮過程。這為lncRNA m7G修飾在PAH中作用的潛在分子機(jī)制的研究提供了新方向。此外，WANG等［55］在PAH患者與正常人肺組織中篩選出15種m7G修飾差異基因，通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，鑒定出的3個PAH新型診斷基因——CYFIP1、EIF4E、IFIT5在多種免疫細(xì)胞（如活化的CD4+T淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞、輔助型T淋巴細(xì)胞2或CD56自然殺傷細(xì)胞、骨髓來源的抑制性細(xì)胞和單核細(xì)胞）中的表達(dá)水平存在差異。提示PAH和腫瘤同樣需要免疫細(xì)胞創(chuàng)造的炎癥微環(huán)境，這或許與血管重塑過程有關(guān)，這為進(jìn)一步研究m7G修飾作為PAH治療靶點(diǎn)提供了新的方向。

5 小結(jié)與展望

PAH被認(rèn)為是一種特殊的“心血管癌癥”，患者5年生存率低，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前藥物治療效果有限、不良反應(yīng)多且治療費(fèi)用高昂。隨著醫(yī)療及科研技術(shù)的發(fā)展，RNA甲基化修飾不僅開辟了表觀遺傳修飾調(diào)控PAH研究的新領(lǐng)域，且多項(xiàng)研究提示RNA甲基化修飾可通過多種作用機(jī)制促進(jìn)PAH的發(fā)生發(fā)展，其中Writers、Erasers及Readers在PAH動物模型中加重或緩解肺血管重塑和右心室肥厚的作用機(jī)制正逐漸被揭示，尤其是m6A修飾中的METTL3。RNA甲基化修飾及其蛋白在PAH中的主要作用見表1。未來靶向調(diào)控m6A修飾有望成為治療PAH的新靶點(diǎn)。

未來有很多潛在價值較大的蛋白和機(jī)制值得深入探究。首先，Erasers中的FTO和ALKBH5盡管在腫瘤、代謝性疾病中的研究較為深入，但目前其在PAH中的研究還有待進(jìn)一步拓展；其次，對于PAH中m5C修飾的研究目前僅停留在臨床研究方面；最后，m7G修飾在PAH中的作用機(jī)制成為新的研究熱點(diǎn)，但目前還需要深入探討其具體的作用機(jī)制，才能更全面地揭示RNA甲基化修飾在PAH發(fā)生發(fā)展中的作用及尋找潛在的治療靶點(diǎn)。

作者貢獻(xiàn)：陳婷珍、劉佩本進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計，論文撰寫；陳婷珍、劉佩本、李艷秀進(jìn)行資料收集；陳婷珍進(jìn)行資料整理；李艷秀進(jìn)行論文的修訂；左祥榮負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。