唐 碩， 葉雨萌， 王雪佳， 楊蕾蕾， 張 瀟，王少霞， 郝延輝， 左紅艷， 李 楊

(1.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 輻射醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100850；2. 32311部隊(duì)， 北京 102112)

0 引言

磁場按其頻率可分為靜磁場和動磁場，按其強(qiáng)度可分為弱磁場(<1 mT)、中強(qiáng)度磁場(1 mT～1 T)、強(qiáng)磁場(1 T～5 T)和超強(qiáng)磁場(>5 T)[1]。流行病學(xué)調(diào)查及動物實(shí)驗(yàn)研究均表明，腦是磁場暴露損傷的主要敏感靶器官[2]，磁場對神經(jīng)系統(tǒng)的影響最為顯著，具體表現(xiàn)在認(rèn)知功能損傷[3]、情緒行為異常[4]、腦電[5]及腦組織病理改變[6]幾個(gè)方面。腦內(nèi)多巴胺(Dopamine，DA)能系統(tǒng)與情緒調(diào)控密切相關(guān)，DA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)之一，在中樞參與學(xué)習(xí)記憶、獎賞、運(yùn)動、情緒等多種大腦重要生理功能的調(diào)控[7]。多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(Dopamine transporters，DAT)通過重?cái)z取突觸間隙內(nèi)DA，實(shí)現(xiàn)了對突觸間隙內(nèi)DA濃度的調(diào)控，DAT在多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著紐帶作用，通過對突觸間隙內(nèi)DA濃度的調(diào)節(jié)，使其與多巴胺受體(Dopamine receptor，DR)結(jié)合后實(shí)現(xiàn)各種生理功能[8]。

磁場暴露對于DAT和DR的影響及其機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步深入研究。本研究通過對不同強(qiáng)度靜磁場暴露后的大鼠行為、腦電圖檢測用來探討靜磁場暴露對大鼠抑郁樣行為及腦電的影響，進(jìn)而采用免疫組織化學(xué)法檢測大鼠海馬DAT及DR2的表達(dá)變化，以期初步探究靜磁場暴露影響大鼠行為學(xué)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

SPF級雄性Wistar大鼠60只，體重200±20 g，購買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，隨機(jī)分為4組，即對照組(C組)15只，磁場暴露低強(qiáng)度組(50 mT、L組)15只，磁場暴露中強(qiáng)度組(100 mT、M組)15只，磁場暴露高強(qiáng)度組(200 mT、H組)15只。其中每組10只用于糖水偏愛實(shí)驗(yàn)，另外5只用于腦電生理及取材。

1.2 暴露方法

將大鼠置于自制的有機(jī)鼠籠中，采用超導(dǎo)磁體暴露源進(jìn)行全身暴露，暴露強(qiáng)度為50 mT、100 mT、200 mT，時(shí)間為1 h/d，連續(xù)暴露15 d或30 d。對照組置于相同環(huán)境進(jìn)行假暴露。

1.3 糖水偏愛指數(shù)檢測

磁場暴露前，將各組大鼠飼養(yǎng)于安靜的房間，每組10只。每個(gè)鼠籠放置兩個(gè)水瓶，均裝有1%蔗糖水喂養(yǎng)24 h，再將水瓶更換為1%蔗糖水和普通水，喂養(yǎng)24 h，將兩個(gè)水瓶取走，禁水禁食24 h。同時(shí)給予每只大鼠事先稱重好的1%蔗糖水和純水各1瓶，60 min后測量每只大鼠糖水消耗量和液體消耗總量。于暴露第15 d、30 d和終止暴露后第7 d，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)步驟，分別測量以上時(shí)間點(diǎn)各組大鼠糖水?dāng)z入量和液體攝入總量，而后計(jì)算糖水偏愛指數(shù)，糖水偏愛指數(shù)=糖水?dāng)z入量/(糖水?dāng)z入量+普通水?dāng)z入量)。

1.4 腦電圖檢測

每組隨機(jī)選取5只大鼠分別于暴露前、暴露第1 d、第5 d、第10 d、第15 d 進(jìn)行腦電生理檢測。操作流程為：首先，根據(jù)體重腹腔注射1%戊巴比妥鈉0.5 ml/100 g麻醉大鼠，而后剃刀脫毛，酒精棉球去脂，使每個(gè)電極電阻均小于12 kΩ。取兩眼外眥與外耳門連線的前中1/3交點(diǎn)處做一連線，并在此連線中點(diǎn)旁開1 mm處(相當(dāng)于冠狀縫后矢狀縫旁開1 mm)頭皮下安置電極針，耳緣部安置對照電極。采用MP-150多導(dǎo)生理記錄及分析系統(tǒng)對大鼠腦電圖(ECG)進(jìn)行檢測，連續(xù)記錄3 min腦電圖。然后進(jìn)行腦電圖波形及功率譜分析。

1.5 大鼠海馬組織取材及石蠟切片制備

每組5只大鼠根據(jù)體重腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，取大鼠全腦，經(jīng)4%甲醛液固定2周，根據(jù)大鼠腦區(qū)圖譜定位海馬位置，并將所取區(qū)域切成形狀規(guī)則、厚度為3 mm大小的組織塊，放入包埋盒中，用流水沖洗12 h，去除固定物和沉淀。 然后將包埋塊放入自動脫水機(jī)中，按照程序脫水后，置于60℃石蠟中2 h，取出后進(jìn)行包埋及石蠟切片制備。

1.6 免疫組織化學(xué)檢測大鼠海馬DAT、DR2的表達(dá)和圖像定量分析

首先石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗；使用微波爐加熱檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫；PBS洗3 min ×3次；在切片上滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑覆蓋組織，室溫避光10 min孵育，PBS洗3 min ×3次；滴加DAT (兔源，ab184451，abcam，1∶200)及DR2 (兔源，ab85367，abcam，1∶200)一抗，于4℃過夜；后滴加酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物，37℃孵育30 min，PBS洗3 min×3次；在顯微鏡下控制DAB顯色時(shí)間，出現(xiàn)淺棕色陽性信號時(shí)即可終止顯色；后使用蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來水返藍(lán)；脫水、透明、封片及圖像采集后，采用Image J進(jìn)行積分光密度及陽性細(xì)胞數(shù)定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 200 mT靜磁場暴露致大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為

200 mT靜磁場暴露第15 d，200 mT 大鼠糖水偏愛指數(shù)較C組無明顯差異；暴露第30 d，與C組比較，200 mT 大鼠糖水偏愛指數(shù)顯著降低，且較暴露前顯著降低；暴露終止后7 d，200 mT 糖水偏愛指數(shù)較C組無顯著性差異，如圖1所示。

圖1 200 mT靜磁場暴露不同時(shí)間對大鼠糖水偏愛指數(shù)的影響H組與C組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01，組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)與暴露前比較，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

2.2 200 mT靜磁場暴露致大鼠腦電呈抑制狀態(tài)

靜磁場暴露第5 d，與C組比較，H組大鼠腦電波出現(xiàn)了高幅慢波，提示δ和θ波增多，抑制增加。暴露第15 d，H組大鼠腦β波和θ波功率相對功率值顯著降低；暴露第10 d、15 d，H組δ波相對功率值功率較C組顯著升高，重心頻率F顯著降低。L和M組大鼠腦電圖較C組無顯著差異，如圖2和表1所示。

表1 不同強(qiáng)度靜磁場暴露不同時(shí)間大鼠δ、θ、β、α頻段相對功率值和重心頻率F的變化(n=5，ˉ

圖2 不同強(qiáng)度靜磁場在暴露不同時(shí)間對大鼠腦電圖的影響

2.3 靜磁場暴露致大鼠海馬組織DAT和DR2表達(dá)發(fā)生改變

靜磁場暴露第1 d、5 d和10 d，各強(qiáng)度組與C組比較大鼠海馬DR2表達(dá)無明顯變化；暴露第15 d，各強(qiáng)度組大鼠海馬DR2表達(dá)與C組比較明顯降低，陽性細(xì)胞數(shù)量減少，其中H組減少最為顯著，如圖3所示。

圖3 不同強(qiáng)度靜磁場暴露不同時(shí)間大鼠海馬DR2表達(dá)變化(免疫組化SP法，Scale bar=50 μm)A：暴露第15 d C組；B：暴露第15 d L組；C：暴露第15 d M組；D：暴露第15 d H組，不同時(shí)間點(diǎn)各強(qiáng)度組與C組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

靜磁場暴露第1d和5d，各強(qiáng)度組大鼠海馬DAT表達(dá)與C組比較無明顯差異。暴露后大鼠海馬DAT表達(dá)發(fā)生變化，免疫組化結(jié)果如圖4所示，靜磁場暴露第10d，M組和H組大鼠海馬神經(jīng)元DAT表達(dá)與C組比較明顯升高，陽性細(xì)胞數(shù)量增加，L組與C組比較無明顯差異。暴露第15d，各強(qiáng)度組大鼠海馬神經(jīng)元DAT表達(dá)與C組比較顯著升高，陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，如圖4所示。

圖4 不同強(qiáng)度靜磁場暴露不同時(shí)間大鼠海馬DAT表達(dá)變化(免疫組化SP法，Scale bar=50 μm)A：暴露第15 d C組；B：暴露第15 d L組；C：暴露第15 d M組；D：暴露第15 d H組，同時(shí)間點(diǎn)各強(qiáng)度組與C組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

3 討論

磁場暴露對大鼠行為學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)研究顯示，3 Hz，600 V/m電磁場暴露可以使大鼠自發(fā)活動時(shí)間減少，動物的情緒反應(yīng)低落，多處于焦慮狀態(tài)。而10 Hz，600 V/m電磁場可以使大鼠的自發(fā)活動時(shí)間增加，大鼠可以表現(xiàn)為積極和活躍的情緒反應(yīng)[9]。脈沖磁場連續(xù)暴露3個(gè)月后，曠場實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示大鼠自發(fā)活動明顯增多[10]。可見，不同參數(shù)的磁場對大鼠自發(fā)探索活動會產(chǎn)生不同的影響。當(dāng)前磁場暴露對抑郁情緒影響的實(shí)驗(yàn)究較少，Kitaoka[11]等對小鼠進(jìn)行3mT的極低頻磁場暴露，累計(jì)暴露時(shí)間200 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可誘發(fā)小鼠產(chǎn)生抑郁樣行為。本文通過糖水偏愛試驗(yàn)檢測靜磁場暴露是否導(dǎo)致大鼠抑郁樣行為。糖水偏愛是評價(jià)抑郁動物對獎賞的快感消失和敏感缺乏的金標(biāo)準(zhǔn)，本研究發(fā)現(xiàn)，200 mT靜磁場暴露15 d后大鼠糖水偏愛指數(shù)無顯著變化，延長暴露至30 d，大鼠出現(xiàn)了抑郁樣行為，暴露終止后7 d大鼠恢復(fù)對糖水的偏愛，表明在一定條件下，靜磁場長期暴露可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為，暴露終止后，抑郁樣行為消失。

大腦皮層電生理活動主要包括α、β、θ和δ4種主要腦電波節(jié)律。不同節(jié)律的腦電波反映了不同的認(rèn)知功能、行為記憶、思維狀態(tài)和神經(jīng)功能狀態(tài)。一般認(rèn)為，α和β低幅快波是大腦皮層興奮時(shí)的主要波形，反映大腦皮層神經(jīng)元興奮的程度，δ和θ高幅慢波是大腦皮層處于抑制狀態(tài)時(shí)的主要表現(xiàn)，反映了大腦皮層神經(jīng)元抑制的程度，受抑制程度增加，興奮程度降低[12]。正常狀態(tài)下大鼠腦電以高頻低幅波為主，當(dāng)大腦皮層受到抑制的程度增加時(shí)，腦電中高頻波段減少低頻波段增加，并隨著抑制程度的逐漸增強(qiáng)，腦電信號整個(gè)電功率頻譜會向低頻率遷移，致使重心頻率整體降低，降低程度與大腦皮層受到的抑制程度呈正相關(guān)。徐新萍等[13]將大鼠暴露于50 Hz，400 μT磁場中，連續(xù)暴露60 d，研究結(jié)果顯示暴露終止后6 h，磁場暴露組大鼠出現(xiàn)δ頻段相對功率值呈升高改變，而β頻段相對功率值降低。可見極低頻電磁場暴露可使大鼠腦電圖功率譜分布異常。蘇建云等[9]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠暴露于不同頻率的電磁場環(huán)境中，大鼠的海馬CA1區(qū)腦電能量信號譜發(fā)生的改變，最為顯著性的結(jié)果是大鼠海馬CA1區(qū)在磁場暴露后θ波頻段能量顯著降低，而且使腦電低頻成分中的能量顯著增加。本文研究發(fā)現(xiàn)，200 mT靜磁場暴露導(dǎo)致大鼠腦電波出現(xiàn)了高幅慢波，抑制增加，且β波和θ波功率相對功率值顯著降低，表明一定條件靜磁場暴露可導(dǎo)致大鼠大腦皮層更多處于抑制狀態(tài)，興奮性降低，并隨暴露強(qiáng)度的增加，抑制效果更為明顯，可能與其抑郁樣行為具有相關(guān)性。

多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)功能異常與抑郁的發(fā)生存在密切的關(guān)聯(lián)[7]。研究表明，DR表達(dá)變化在抑郁發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用[14]。DR屬于7次跨膜的G蛋白耦聯(lián)受體家族，該受體分為5個(gè)亞型，其中DR2是DR家族中含量第二的受體亞型，主要分布于紋狀體、海馬、伏隔核和嗅結(jié)節(jié)[15]，其主要表達(dá)于DA能神經(jīng)元細(xì)胞膜。研究認(rèn)為，DR2異常與抑郁相關(guān)。目前抑郁患者腦區(qū)DR2表達(dá)變化報(bào)道不盡一致，有研究報(bào)道首發(fā)抑郁癥患者紋狀體DR2總體結(jié)合力降低[16]。M Pecina等[17]的研究通過PET檢測到抑郁患者腹側(cè)紋狀體有異常高的DR2表達(dá)。而在另一項(xiàng)對抑郁動物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，腹側(cè)紋狀體DR2表達(dá)降低，數(shù)量減少，并在抑郁癥狀得到治療后恢復(fù)[18]。20 Hz，14 mT極低頻磁場暴露后大鼠背側(cè)海馬神經(jīng)元DR2密度降低[19]。另有研究報(bào)道20 Hz，14 mT極低頻磁場暴露后，使嗎啡依賴大鼠海馬CA2區(qū)DR2表達(dá)降低更為明顯[20]。本文研究發(fā)現(xiàn)不同強(qiáng)度靜磁場暴露15 d，各個(gè)強(qiáng)度組大鼠海馬組織中DR2均降低，其中H組降低更為顯著。提示靜磁場暴露所致大鼠海馬DR2表達(dá)降低可能與大鼠抑郁樣行為相關(guān)，且分子表達(dá)的改變早于行為學(xué)改變。

DAT是一個(gè)12跨膜蛋白，僅表達(dá)于DA能神經(jīng)元中，其在黑質(zhì)、海馬、紋狀體和伏隔核區(qū)域神經(jīng)元中大量表達(dá)，DAT位于突觸前體，其功能是將突觸出間隙的DA重?cái)z取，維持DA在突觸間隙一定濃度，使DA與DR結(jié)合后激活下游一系列信號通路產(chǎn)生生物效應(yīng)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，一定條件靜磁場暴露后大鼠海馬DAT表達(dá)升高，進(jìn)而對突觸間隙多巴胺重?cái)z取作用增強(qiáng)，使突觸間隙內(nèi)DA含量降低，可能與靜磁場暴露后大鼠抑郁樣行為相關(guān)。

綜上，在一定條件下靜磁場暴露導(dǎo)致腦電圖和DA系統(tǒng)異常，可能為靜磁場暴露引起大鼠抑郁樣行為的機(jī)制之一。