方會娟， 徐小艷， 徐憲偉， 姜 黃

(河南中醫(yī)藥大學(xué) 第五臨床醫(yī)學(xué)院(鄭州人民醫(yī)院)病理科， 河南 鄭州 450000)

0 引言

在過去20年中，我國乳腺癌的發(fā)病率和死亡率呈快速上升趨勢，雖然手術(shù)、放化療、免疫治療和聯(lián)合治療等手段大大提高了乳腺癌患者的生活質(zhì)量，但對于總生存率仍無明顯改善，乳腺癌依然嚴(yán)重威脅著女性群體的健康，侵襲和轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者病情復(fù)發(fā)和死亡的主要原因。研究表明，在包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤細(xì)胞中存在 EZH2(enhancer of zeste homolog 2)基因的突變及異常表達(dá)，與癌癥的侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)[1]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)是腫瘤微環(huán)境極為重要的成分，在腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞可以被極化成兩種不同的亞型[2]：經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞和替代活化的M2型巨噬細(xì)胞，TAMs主要為M2型巨噬細(xì)胞，乳腺癌的不良預(yù)后與TAMs 的浸潤密切相關(guān)[3]。CD163 是公認(rèn)的M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物之一。乳腺浸潤性癌中EZH2定量表達(dá)特點如何，其與CD163 是否存在相關(guān)性，這些都尚未見文獻報道。為了解乳腺浸潤性癌中EZH2和CD163與多個臨床病理因素的關(guān)系及二者之間的相關(guān)性，本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測67例乳腺浸潤性癌及相應(yīng)的癌旁組織中EZH2蛋白的表達(dá)情況，采用定量測試方法，測試EZH2蛋白的陽性單位(Positive Unit，PU)，計數(shù)高倍視野CD163的個數(shù)，分析EZH2蛋白定量表達(dá)和CD163數(shù)目與乳腺浸潤性癌的臨床病理特征的關(guān)系及二者的相關(guān)性，旨在觀察EZH2和CD163是否參與乳腺浸潤性癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，以拓展和豐富人們對乳腺癌發(fā)生和發(fā)展機制的認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院病理科2015年1月至2017年12月期間的手術(shù)切除的活檢標(biāo)本，其中包括乳腺浸潤性癌67例和相應(yīng)的67例癌旁組織。67例乳腺浸潤性癌標(biāo)準(zhǔn)如下：①患者均為女性；②術(shù)前均未接受放化療或中醫(yī)治療；③經(jīng)過乳腺保乳或者乳腺根治性切除術(shù)。收集患者相關(guān)臨床資料，按照2019年WHO乳腺癌組織病理分級分類法，即核分裂象、腺管形成和細(xì)胞異型性對其進行分級。所有標(biāo)本均經(jīng)10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋，并經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院病理科診斷確診。

1.2 主要試劑

EZH2一抗兔抗人單克隆抗體公司購自福州邁新公司、CD163一抗兔抗人單克隆抗體、二抗及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)均為河南賽諾特生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

(1)3～4 μm石蠟切片、烤片、脫蠟及水化；

(2)抗原修復(fù)，EZH2采用EDTA修復(fù)，CD163采用檸檬酸修復(fù)；

(3)一抗37℃孵育1.5～2 h；

(4)二抗室溫孵育20～30 min；

(5)DAB顯色3～5 min；

(6)脫水、透明及中性樹膠封片。

EZH2陽性對照采用已知EZH2陽性的乳腺癌組織和PBS代替一抗分別作為陽性和空白對照，CD163陽性對照采用扁桃體和和PBS代替一抗分別作為陽性和空白對照。

1.4 EZH2免疫組化定量測試

根據(jù)空白對照、乳腺癌組織自身陰性對照、陽性對照的顯色情況，在確保無假陰性和假陽性的前提下，以EZH2細(xì)胞核染成棕褐色為陽性。用ImagePro Plus圖像分析軟件，測試其陽性單位值(Positive Unit，PU)[4]。方法如下：在40倍物鏡下，從每例切片中取10個著色最強的視野輸入計算機，使其轉(zhuǎn)換成灰色照片，將照片導(dǎo)入ImagePro Plus圖像分析軟件。測試每個陽性細(xì)胞的灰度Gα，同時在相應(yīng)的10個視野中測試背景灰度Gβ并取其平均值。本研究中測試軟件設(shè)定的Gmax為256，按下列公式計算每個陽性細(xì)胞的陽性單位(Positive Unit)PU值[4]。

1.5 CD163計數(shù)判讀

在低倍鏡下選取視野中巨噬細(xì)胞最密集的5個區(qū)域，在高倍鏡下(400 ×)計數(shù)，取5個視野總和的平均值進行統(tǒng)計。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。兩個獨立樣本均數(shù)間比較采用t檢驗。多樣本均數(shù)之間采用方差分析進行比較。若方差齊，組間多重比較采用LSD檢驗，若方差不齊，組間多重比較采用Dunnett’S T3檢驗。相關(guān)分析采用Spearman分析法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EZH2和CD163蛋白在乳腺癌旁組織和浸潤性癌中表達(dá)情況

EZH2陽性表達(dá)部位定位于乳腺癌細(xì)胞核，在乳腺間質(zhì)的纖維細(xì)胞中未見表達(dá)，在乳腺癌癌旁組織中有少量弱表達(dá)。EZH2蛋白PU值在乳腺癌組織(14.81±5.62)中顯著高于其在癌旁組織(3.88±1.33)中的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。如圖1和表1所示。

表1 EZH2和CD163蛋白在乳腺癌旁組織和浸潤性癌中表達(dá)情況

圖1 EZH2和CD163蛋白在乳腺癌旁組織和浸潤性癌中的表達(dá)A：EZH2在癌旁組織中的表達(dá)；B：EZH2在乳腺癌組織中的表達(dá)；C：CD163在癌旁組織中的表達(dá)；D：CD163在乳腺癌組織中的表達(dá)。免疫組織化學(xué)法(200倍，視野直徑約1.1 mm)

CD163陽性表達(dá)部位主要定位于乳腺癌癌巢周圍組織間隙的組織細(xì)胞內(nèi)，染色呈棕黃色顆粒，呈小巢狀分布，也有散在分布于乳腺癌癌巢組織內(nèi)。CD163計數(shù)在乳腺癌組織(148.10±55.62)中顯著高于其在癌旁組織(7.34±3.57)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)(如圖1、圖2和表1所示)。

圖2 組織細(xì)胞在乳腺癌中的分布A：大部分組織細(xì)胞位于癌巢周圍呈片狀分布(200倍鏡，視野直徑約1.1 mm)；B：少量組織細(xì)胞散在分布于癌巢內(nèi)(400倍鏡，視野直徑約0.55 mm)

2.2 EZH2和CD163與乳腺浸潤性癌臨床病理特征的關(guān)系

乳腺浸潤性癌中，EZH2與腫瘤直徑大小相關(guān)，其蛋白PU值在腫瘤直徑≤2 cm、2～5 cm和>5 cm中表達(dá)依次升高，分別為12.11±4.18、18.24±4.80、19.14±5.41，差異總體有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，但其在2～5 cm和>5 cm組中，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；EZH2與乳腺癌WHO分級有關(guān)，其在WHOI級、II級、III級中的PU值表達(dá)依次升高，分別為11.16±6.66、13.59±4.28、18.75±5.47，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；EZH2在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組別(19.35±4.52)中高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組別(10.66±2.38)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；EZH2在TNMⅢ-Ⅳ期(16.68±5.92)表達(dá)高于Ⅰ-Ⅱ期(11.86±3.57)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；EZH2在ER陽性組中(11.68±3.83)低于ER陰性組(16.34±5.76)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；EZH2在PR陽性組中(12.51±4.57)低于ER陰性組(16.09±5.79)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；EZH2與患者的年齡、腫瘤的部位和Her-2是否擴增均無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 EZH2和CD163 與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

CD163計數(shù)與腫瘤直徑大小相關(guān)，其數(shù)目在腫瘤直徑≤2 cm、2～5 cm和>5 cm中表達(dá)依次增多，分別為121.38±41.54、181.80±47.31、191.18±53.20，差異總體有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，但其在2～5 cm和>5 cm組中，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；CD163計數(shù)與乳腺癌WHO分級有關(guān)，其在WHO I級、II級、III級中的計數(shù)依次升高，分別為110.56±67.04、136.66±42.30、186.75±53.57，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；CD163計數(shù)在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移組別(192.78±45.13)中高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組別(107.26±23.50)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P=0.000)；CD163計數(shù)在TNMⅢ-Ⅳ期(166.15±59.10)高于Ⅰ-Ⅱ期(117.50±36.86)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；CD163計數(shù)在ER陽性組中(125.50±44.63)低于ER陰性組(163.07±57.40)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；CD163計數(shù)在PR陽性組中(125.50±44.63)低于ER陰性組(160.72±57.58)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)；CD163計數(shù)與患者的年齡、腫瘤的部位和Her-2是否擴增均無關(guān)(P>0.05)。見表2。

2.3 乳腺浸潤性癌中EZH2和CD163表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析顯示：67例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中，EZH2和CD163蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(RS=0.990，P=0.000)，即EZH2蛋白表達(dá)量越高，CD163數(shù)目相應(yīng)的越多。

3 討論

EZH2在多種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，這些異常導(dǎo)致了抑癌基因的沉默，與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有密切關(guān)系。已有的研究表明，其在膠質(zhì)瘤、前列腺癌和卵巢癌等腫瘤中的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[5-7]，其高表達(dá)提示腫瘤的不良預(yù)后。趙昕輝等[8]利用整合生物信息學(xué)手段分析結(jié)果表明，EZH2在乳腺癌組織中的mRNA及蛋白表達(dá)量顯著高于正常乳腺組織，EZH2的表達(dá)水平與年齡、分期及分子分型密切相關(guān)，乳腺癌患者EZH2表達(dá)水平高的總生存期、無病生存期、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期及后進展生存期均明顯低于EZH2低表達(dá)患者。Zhang L等[9]研究表明，EZH2通過整合素β1-FAK激活參與TGFβ信號傳導(dǎo)促進乳腺癌癥骨轉(zhuǎn)移。本研究采用免疫組織化學(xué)方法結(jié)合圖像定量測試分析表明EZH2蛋白在乳腺浸潤性癌中陽性強度高于癌旁組織，其在乳腺浸潤性癌的WHO Ⅲ級、淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移及TNM分期Ⅲ-Ⅳ表達(dá)量較高，EZH2蛋白定量表達(dá)與激素受體相關(guān)，在ER、PR陰性這表達(dá)較高，提示該蛋白在乳腺癌侵襲和進展的過程中發(fā)揮了重要的作用。EZH2蛋白定量研究結(jié)果與以往文獻定性結(jié)果基本相似。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，EZH2蛋白定量表達(dá)與乳腺癌的腫瘤直徑有關(guān)，其在腫瘤直徑≤2 cm、2～5 cm和>5 cm中表達(dá)依次升高，差異總體具有統(tǒng)計學(xué)意義，但是其在2～5 cm和>5 cm中表達(dá)基本相似，分析原因可能跟樣本含量有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，EZH2蛋白定量表達(dá)與患者年齡無關(guān)，與以往文獻報道[8]不同。其原因為：①免疫組化判讀方法不一致，本研究采用了定量判讀的方法；②年齡分組的界限不一致；③樣本量不一致。本研究結(jié)果提示，EZH2的表達(dá)可能與乳腺癌的進展和不良預(yù)后相關(guān)。

M2型巨噬細(xì)胞參與Th2型免疫反應(yīng)，抑制抗腫瘤免疫，對腫瘤細(xì)胞殺傷活性降低。研究表明，M2型巨噬細(xì)胞在多種腫瘤中可促進腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，在頭頸部鱗癌中研究發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞高表達(dá)組織與腫瘤多灶性、浸潤深度及發(fā)病次數(shù)呈顯著正相關(guān)[10]。Tu D等[11]研究表明，M2巨噬細(xì)胞孵育的乳腺癌細(xì)胞中miR-1587過表達(dá)，促進了癌細(xì)胞增殖和遷移。宮頸癌中CD163陽性的M2型巨噬細(xì)胞浸潤與治療反應(yīng)和疾病無進展生存期有關(guān)[12]。此外，M2型巨噬細(xì)胞可促進腫瘤血管的形成，與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)。Zhao X等[13]采用Meta分析發(fā)現(xiàn)，在4541例乳腺癌患者中，M2型巨噬細(xì)胞高密度者浸潤性乳腺癌患者生存率較低。本研究中通過分析M2巨噬細(xì)胞與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CD163陽性數(shù)目在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，其表達(dá)與腫瘤直徑、WHO分級、TNM分期、PR陰性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這提示乳腺癌組織中M2巨噬細(xì)胞浸潤的數(shù)量越多，乳腺癌患者腫瘤直徑較大、WHO分級較高、TNM分期較晚，腫瘤越容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，免疫組化檢測乳腺癌組織中M2巨噬細(xì)胞的數(shù)量能夠反映乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

本研究中，Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明，浸潤性乳腺癌組織中EZH2蛋白定量與 CD163陽性巨噬細(xì)胞個數(shù)呈顯著正相關(guān)，推測乳腺癌中EZH2表達(dá)與腫瘤微環(huán)境中CD163陽性的巨噬細(xì)胞可能存在協(xié)同作用，促進乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和不良預(yù)后。

4 結(jié)論

綜上所述，EZH2和CD163在乳腺癌中高表達(dá)，與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，二者表達(dá)呈正相關(guān)，乳腺癌中EZH2表達(dá)與腫瘤微環(huán)境中CD163 陽性的巨噬細(xì)胞可能存在協(xié)同作用促進乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，對乳腺癌中EZH2和CD163表達(dá)規(guī)律及相關(guān)性研究，能夠為乳腺癌靶向治療提供一定理論依據(jù)，其具體機制有待于后續(xù)開展更深入的研究。