王攀峰

（山西省檢驗檢測中心（山西省標(biāo)準(zhǔn)計量技術(shù)研究院），山西太原 030012）

脫氫乙酸及其鈉鹽是聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）與世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）公認(rèn)的一種低毒、高效、廣譜的食品防腐劑，其對霉菌、酵母菌與細(xì)菌有著較強(qiáng)的抑制作用，在面包糕點、腌制蔬菜、果汁飲料及熟肉制品等食品加工與貯存過程中廣泛使用[1]。然而，部分食品生產(chǎn)企業(yè)超限量或超范圍使用脫氫乙酸，消費者過量攝入后，會對其肝臟或腎臟造成影響，甚至存在致癌風(fēng)險[2]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）[3]規(guī)定果蔬汁（漿）中脫氫乙酸及其鈉鹽的最大使用量為0.3 g·kg-1。為加強(qiáng)果汁飲料的日常監(jiān)管，準(zhǔn)確測定其中脫氫乙酸及其鈉鹽的含量，避免在測定結(jié)果接近臨界值時出現(xiàn)誤判情況，本研究依據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[4]中規(guī)定的方法程序，對《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）[5]中高效液相色譜法測定椰汁中脫氫乙酸含量的不確定度進(jìn)行評定，分析影響測定結(jié)果的關(guān)鍵因素，以便提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，也為檢驗檢測機(jī)構(gòu)在評估其他檢驗項目測量不確定方面提供理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

椰汁，購自某超市；甲醇中脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為1 000 μg·mL-1），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；甲醇（色譜純），德國默克公司；甲酸（分析純），無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；硫酸鋅、氫氧化鈉（均為分析純），江蘇省亞泰集團(tuán)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U3000高效液相色譜儀（DAD檢測器），美國賽默飛世爾公司；AL104電子天平（精度0.000 1 g），瑞士梅特勒-托利多公司；JL-SPE-12B固相萃取裝置，上海靳瀾儀器公司；C18固相萃取柱（500 mg/6 mL），常德比克曼生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測定》（GB 5009.121—2016）中第二法 液相色譜法進(jìn)行椰汁中脫氫乙酸含量的測定。

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確吸取1.0 mL甲醇中脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg·mL-1）置于10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配制成濃度為1 00 μg·mL-1的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確吸取1.0 mL脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液用超純水稀釋成10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別吸取0.10 mL、0.40 mL脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)中間液，0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL和1.0 mL脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液于6個10 mL容量瓶中，用超純水定容，配制成濃度為0.1 μg·mL-1、0.4 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 試樣制備提取

準(zhǔn)確稱取2.5 g（精確至0.000 1 g）椰汁試樣置于25 mL離心管中，加入10 mL超純水、5 mL硫酸鋅溶液（120 g·L-1），用氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）調(diào)節(jié)pH值至7.5，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用超純水稀釋定容，搖勻，置于離心管中，4 000 r·min-1離心10 min。移取20 mL上清液于25 mL容量瓶中，用10%的甲酸溶液調(diào)節(jié)pH值至5，用超純水定容至刻度。將C18固相萃取柱依次用5 mL甲醇、10 mL水活化，取5 mL試液過柱，再用5 mL水淋洗，2 mL 70%的甲醇溶液洗脫，收集2 mL洗脫液，渦旋混勻，過0.45 μm有機(jī)濾膜后上機(jī)測試。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱：艾杰爾XBP-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：10%甲醇+90% 0.02 mol·L-1乙酸銨（體積比）；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；DAD檢測器：波長293 nm。

1.4 數(shù)學(xué)模型建立

建立的數(shù)學(xué)模型見公式（1）。

式中：X為椰汁試樣中脫氫乙酸含量，g·kg-1；m為椰汁試樣稱取質(zhì)量，g；V為試液總體積，mL；c1為待測試液中脫氫乙酸的濃度，μg·mL-1；c0為空白試液中脫氫乙酸的濃度，μg·mL-1；f為過固相萃取柱的換算系數(shù)，f=0.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源

從測定過程與數(shù)學(xué)模型來看，本試驗中測量不確定度主要來源于試樣稱量、試樣制備提取、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合及測量重復(fù)性等過程。

2.2 測量不確定度分量評定

2.2.1 試樣稱量過程引入的不確定度分量urel(m)

使用AL104電子天平稱取2.500 0 g椰汁試樣，由檢定證書獲得示值誤差為±0.000 5 g，偏載誤差為±0.000 5 g，重復(fù)性誤差為±0.001 g，按正態(tài)分布考慮，則試樣稱量過程引入的不確定度為

2.2.2 試樣制備提取引入的不確定度分量urel(V)

由數(shù)學(xué)模型可知，試樣制備提取引入的不確定度來自試液定容的總體積，定容過程使用25 mL單標(biāo)線容量瓶（A級），根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[6]獲得容量允差為±0.03 mL，20 ℃時容量校正引入的不確定度按矩形分布，依據(jù)公式（2）計算；實驗溫差為±3 ℃，水膨脹系數(shù)為2.10×10-4℃-1，由實驗室溫差產(chǎn)生的不確定度按矩形分布，依據(jù)公式（3）計算。由玻璃量器引入的相對不確定度依據(jù)公式（4）計算，求得urel(V)=0.000 78。

式中：ΔS表示玻璃量器的容量允差；V表示玻璃量器移取或定容試液的體積，mL。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度分量urel(c)

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液賦值。甲醇中脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液編號為91351A，批號為A22050324，標(biāo)準(zhǔn)溶液證書顯示相對擴(kuò)展不確定度為U=kurel(cb)=2%（k=2），則urel(cb)=2%/2=0.010 0。

（2）標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制。吸取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液使用的1 mL分度吸量管（A級）的容量允差為±0.008 mL，定容使用的10 mL單標(biāo)線容量瓶（A級）的容量允差為±0.020 mL，依據(jù)公式（2）、（3）、（4）求得urel(V1)=0.004 63，urel(V10)=0.001 21，則該過程引入的相對不確定度為

（3）標(biāo)準(zhǔn)工作液配制。標(biāo)準(zhǔn)中間液配制與儲備液配制過程所用玻璃量器相同，引入的相對不確定度urel(c2)=urel(c1)=0.004 79。標(biāo)準(zhǔn)工作液配制時6次使用1 mL分度吸量管（A級），6次使用10 mL單標(biāo)線容量瓶（A級），該過程引入的相對不確定度為

由此，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度分量urel(q)

將1.3.1中配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液上機(jī)測試，測得峰面積分別為0.025 481、0.131 380、0.334 300、0.818 980、2.294 000和4.674 600。以脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)測得峰面積為縱坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性方程為Y=0.474 7c-0.084 0，其中b=0.474 7，a=-0.084 0。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度根據(jù)以下公式計算。

式中：n為標(biāo)準(zhǔn)工作液測試次數(shù)，n=6；p為椰汁試樣測試次數(shù)，p=6；測得椰汁試樣平均值為0.049 4 g·kg-1，代入數(shù)學(xué)模型中求得c=9.88 μg·mL-1，標(biāo)準(zhǔn)工作液各濃度點的平均值=3.083 3 μg·mL-1。

計算得sR=0.049 96，u(q)=0.103 39 μg·mL-1，則

2.2.5 測量重復(fù)性引入的不確定度分量urel(s)

將椰汁試樣在期間精密度測量條件下測試6次，結(jié)果分別為0.049 5 g·kg-1、0.048 8 g·kg-1、0.049 8 g·kg-1、0.049 1 g·kg-1、0.049 7 g·kg-1和0.049 6 g·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)偏差s=0.000 387，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3 合成與擴(kuò)展不確定度

將各個相對不確定度分量進(jìn)行合成得

則標(biāo)準(zhǔn)合成不確定度為u=0.049 4×0.020 1=0.000 99 g·kg-1。取包含因子k=2，置信概率p=95%，則測量擴(kuò)展不確定度U=ku=0.002 0 g·kg-1。因此，測量不確定度結(jié)果報告為（0.049 4±0.002 0）g·kg-1（k=2，p=95%）。

3 結(jié)論

通過分析評定高效液相色譜法測定椰汁中脫氫乙酸含量的測量不確定度，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合過程對測量結(jié)果影響較大，其次為測量重復(fù)性、試樣制備提取體積及試樣稱量過程。因此，檢驗檢測機(jī)構(gòu)相關(guān)部門要重視玻璃量器與大型儀器的計量檢定工作，并督促實驗室做好標(biāo)準(zhǔn)溶液與儀器設(shè)備的期間核查工作。此外，還應(yīng)重視實驗人員的職業(yè)水平培訓(xùn)，提升其實驗操作水平技能與對大型儀器設(shè)備的維護(hù)能力，盡可能地降低測量不確定度，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。