李永利,高艷秋,薛民杰,郝玉紅,李 杰

(上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院,上海市在線檢測(cè)與控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201203)

蛋白質(zhì)是生命體實(shí)現(xiàn)生理功能的直接參與者,因此研究生命體蛋白質(zhì)表達(dá)模式和功能作用不僅局限于蛋白質(zhì)的定性分析,臨床檢測(cè)、食品分析等領(lǐng)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)的定量測(cè)量需求越來越強(qiáng)烈。常用的蛋白質(zhì)定量測(cè)量方法主要有電泳法[1]、免疫法[2-3]、高效液相色譜[4]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5]等,隨著質(zhì)譜分析技術(shù)的發(fā)展,被認(rèn)為是小分子定量金標(biāo)準(zhǔn)的同位素稀釋質(zhì)譜法[6-7]應(yīng)用于蛋白質(zhì)定量測(cè)量中,展現(xiàn)了準(zhǔn)確、精密、易于溯源等特點(diǎn)[8-9]。

基于同位素稀釋質(zhì)譜法的蛋白質(zhì)定量技術(shù),可以將蛋白質(zhì)酶解成肽段后測(cè)定特征肽段進(jìn)行定量,也可以將蛋白質(zhì)完全水解成游離氨基酸后,測(cè)定各氨基酸含量,再根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列信息,由氨基酸含量計(jì)算得到蛋白質(zhì)含量?；陔亩蔚亩糠椒ň哂懈玫奶禺愋?但需要設(shè)計(jì)酶解方案、合成標(biāo)記的特征肽段,難以建立具有普適性的定量方法;基于氨基酸的定量方法,不僅需要獲得準(zhǔn)確的氨基酸序列信息,而且為了避免游離氨基酸和雜質(zhì)蛋白、肽段水解產(chǎn)生氨基酸對(duì)測(cè)量結(jié)果的干擾,需要預(yù)先提純蛋白質(zhì),但該方法易于建立測(cè)量結(jié)果的計(jì)量溯源性,實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量,且可以建立適用于不同蛋白質(zhì)的樣品處理和儀器分析方法,和傳統(tǒng)氨基酸分析法相比操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度和精密度高[8],和基于肽段的定量方法相比通用性更強(qiáng),因此應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定國際比對(duì)[10]、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制[11-12]和臨床診斷中各種蛋白質(zhì)分析的校準(zhǔn)[13-14],建立蛋白質(zhì)分析的計(jì)量溯源性。

本研究采用蛋白質(zhì)水解后以同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)定氨基酸含量的方式,建立可用于多種蛋白質(zhì)的高準(zhǔn)確度定量方法,方法精密、靈敏,結(jié)果可溯源至國際基本單位,可應(yīng)用于蛋白質(zhì)絕對(duì)定量和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀:Acquity UPLC I-Class Plus/XEVO TQ-XS型,美國Waters公司;電子天平:XPE105型,瑞士Mettler Toledo公司;超純水儀:Milli-Q型,德國Merck公司;水燃料氫氧機(jī):OH200型,湖南沃克能源科技有限公司;強(qiáng)制對(duì)流烘箱:FD115型,德國Binder公司;冷凍干燥機(jī):L-200型,瑞士Buchi公司。

GBW(E)100084脯氨酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Pro,99.0±1.5%,k=2)、GBW09236 L-纈氨酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Val,99.4%,Ur=0.6%,k=2)、GBW09237 L-亮氨酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Leu,99.7%,Ur=0.4%,k=2)、GBW09238 L-異亮氨酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Ile,99.7%,Ur=0.3%,k=2)、GBW(E)100061苯丙氨酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Phe,99.0±1.5,k=2)等20種天然氨基酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和GBW(E)091110 新型冠狀病毒核衣殼蛋白(N蛋白)人源IgG單克隆抗體溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(85.3±8.5 μg/g):中國計(jì)量科學(xué)研究院;Pro-13C5、Val-13C5、Leu-13C615N、Ile-13C6、Phe-13C9:純度>98%,豐度>99 atom%,美國CIL公司;甲酸、乙腈:質(zhì)譜純,德國Merck公司;全氟戊酸:純度>97%,德國Merck公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 為了獲得更高準(zhǔn)確度的定量結(jié)果,采用重量法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別稱取Pro、Val、Leu、Ile、Phe標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)約10 mg至不同的10 mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,稱量并記錄溶液總重,得濃度約為1 000 μg/g的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.2氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 分別稱取Pro、Val、Leu、Ile、Phe儲(chǔ)備液適量至10 mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,稱量并記錄溶液總重,得氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.2.3內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 分別稱取Pro-13C5、Val-13C5、Leu-13C615N、Ile-13C6、Phe-13C9約10 mg至不同的10 mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,稱量并記錄溶液總重,得濃度約為1 000 μg/g的內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.4內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)中間液 分別稱取Pro-13C5、Val-13C5、Leu-13C615N、Ile-13C6、Phe-13C9儲(chǔ)備液適量至10 mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,稱量并記錄溶液總重,得內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.2.5標(biāo)準(zhǔn)工作液 分別移取氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間液、內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)中間液9 μL、10 μL至樣品瓶中并準(zhǔn)確稱重,冷凍干燥至干后用0.1%甲酸水溶液500 μL復(fù)溶,得低濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液。

分別移取氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間液、內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)中間液11 μL、10 μL至樣品瓶中并準(zhǔn)確稱重,冷凍干燥至干后用0.1%甲酸水溶液500 μL復(fù)溶,得高濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 儀器分析條件

1.3.1色譜條件 Hypercarb多孔石墨碳色譜柱(100×2.1 mm,3 μm);柱溫40 ℃;流動(dòng)相:A為0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)全氟戊酸水溶液,B相為乙腈;梯度洗脫:0～5 min使流動(dòng)相A由100%降至90%,5～10 min使流動(dòng)相A由90%降至0%后保持至11.5 min,再將流動(dòng)相恢復(fù)至初始比例平衡1.5 min;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:2 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧正離子源(ESI+),毛細(xì)管電壓3.0 kV,離子源溫度,150 ℃,脫溶劑氣流速1 000 L/h,脫溶劑氣溫度500 ℃,錐孔氣流速150 L/h,碰撞氣為氬氣,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。其他質(zhì)譜條件列于表1,其中*為定量離子。

表1 氨基酸分析質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters for amino acids

1.4 蛋白質(zhì)的水解

準(zhǔn)確稱取適量樣品至清洗干凈的2 mL棕色安瓿瓶,再移入內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)中間液10 μL并準(zhǔn)確稱重,加入6 mol/L的鹽酸水溶液600 μL,通氮?dú)? min后融封,在130 ℃烘箱中水解15 h。水解后冷凍干燥至干,用0.1%甲酸水溶液500 μL復(fù)溶,進(jìn)LC-MS/MS分析。

1.5 蛋白質(zhì)含量計(jì)算

采用括號(hào)法測(cè)定各氨基酸含量,即以低濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液-樣品-高濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液-樣品-低濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)樣測(cè)試,按公式(1)分別由各氨基酸含量計(jì)算蛋白質(zhì)含量:

(1)

式中,Cx為由某氨基酸計(jì)算得到的蛋白質(zhì)濃度,μg/g;Rs、Rl、Rh分別為樣品、低濃度和高濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液中氨基酸和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比;mSTDl、mIl和mSTDh、mIh分別為低濃度和高濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液配制時(shí)加入氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)中間液、內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的質(zhì)量,mg;cSTD為混合標(biāo)準(zhǔn)中間液某氨基酸的濃度,μg/g;mSI為蛋白質(zhì)水解前加入內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)中間液的質(zhì)量,mg;ms為樣品質(zhì)量,mg;n為蛋白質(zhì)中某氨基酸的數(shù)量;MAA、MN分別為某氨基酸、蛋白質(zhì)的摩爾質(zhì)量,g/mol。

各氨基酸含量計(jì)算得到的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果,經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)、一致性和等精度檢驗(yàn)后的算術(shù)平均值或加權(quán)算數(shù)平均值即為蛋白質(zhì)含量結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

用0.1%甲酸水溶液分別配制濃度為100 ng/mL的20種天然氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液,以連續(xù)流直接進(jìn)樣的方式注入質(zhì)譜儀中進(jìn)行全掃描,以響應(yīng)最高的準(zhǔn)分子離子峰質(zhì)荷比作為母離子,優(yōu)化錐孔電壓等各質(zhì)譜參數(shù)使母離子信號(hào)強(qiáng)度最高。再對(duì)母離子分別進(jìn)行子離子掃描,選擇信號(hào)強(qiáng)度最高且穩(wěn)定的離子對(duì)作為定量離子對(duì)和定性離子對(duì),優(yōu)化碰撞能量使子離子信號(hào)強(qiáng)度最高。優(yōu)選的質(zhì)譜條件和特征離子對(duì)列于表1。

2.2 色譜條件優(yōu)化

由于氨基酸極性較強(qiáng),C18色譜柱上不易保留,分離效果不佳,常通過柱前衍生[15]降低極性或者使用親水作用(Hilic)色譜柱[16]改善分離,但分析效率和分離效果難以滿足蛋白質(zhì)定量分析的要求。本研究結(jié)合多孔石墨化碳填料(Hypercarb)和揮發(fā)性離子對(duì)試劑,高效、準(zhǔn)確、精密的實(shí)現(xiàn)了20種天然氨基酸的分離分析(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸),除His、Arg、Trp外絕大多數(shù)氨基酸峰型對(duì)稱、尖銳,質(zhì)譜響應(yīng)靈敏。

2.3 定量氨基酸選擇

由單一氨基酸含量計(jì)算蛋白質(zhì)含量結(jié)果,因受蛋白質(zhì)純度、水解過程、測(cè)量誤差等眾多因素影響,難以保證準(zhǔn)確度。而由多個(gè)氨基酸含量統(tǒng)計(jì)計(jì)算的蛋白質(zhì)含量,可以降低雜蛋白、氨基酸水解差異和偶然因素引入的誤差,獲得更為準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)定量結(jié)果。但實(shí)驗(yàn)表明,經(jīng)過1.4節(jié)的水解步驟后,Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Glu、Met、Tyr、Trp等氨基酸會(huì)發(fā)生不同程度的降解。因此綜合考慮各天然氨基酸的耐酸性、熱穩(wěn)定性和所建立定量分析條件下的準(zhǔn)確性、精密度,結(jié)合蛋白質(zhì)中氨基酸的含量差異,選擇Pro、Val、Leu、Ile、Phe作為定量蛋白質(zhì)的氨基酸。

2.4 水解條件優(yōu)化

水解條件優(yōu)化結(jié)果示于圖1。水解需要在保證氨基酸未被降解的前提下盡可能將蛋白質(zhì)完全轉(zhuǎn)化成游離氨基酸,而水解效率受水解試劑和濃度、水解溫度、水解時(shí)間等因素影響,因此,本研究使用肌紅蛋白(Mb)、人血清白蛋白(HSA)和C-反應(yīng)蛋白(CRP)優(yōu)化水解條件。

a——鹽酸濃度; b——水解溫度; c——水解時(shí)間

蛋白質(zhì)水解方法主要有酸水解、堿水解、酶水解和微波消解等,堿水解容易使部分氨基酸消旋化,酶水解往往需要較長的時(shí)間,酸水解通用、高效的特點(diǎn)使其成為采用較多的水解方法[17]。酸水解最常用的水解試劑是鹽酸和甲磺酸,因?yàn)榧谆撬犭y易揮發(fā),水解后難以去除,會(huì)干擾質(zhì)譜檢測(cè),因此選擇鹽酸作為水解試劑。通過對(duì)不同濃度的鹽酸考察表明,濃度小于4 mol/L水解效率不足,濃度大于6 mol/L水解后氨基酸含量基本一致(圖1a);通過對(duì)不同水解溫度的考察表明,高于100 ℃的水解溫度可以顯著提升水解效率,130 ℃ 和150 ℃水解后氨基酸含量沒有顯著差異(圖2a);通過對(duì)水解時(shí)間的考察表明,3種蛋白質(zhì)水解15 h后氨基酸含量沒有顯著增加(圖3a)。因此,以6 mol/L的鹽酸水溶液作為水解試劑、通氮?dú)馊诜夂笤?30 ℃水解15 h是優(yōu)選的水解條件。

圖2 新冠病毒N蛋白測(cè)定的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of COVID-19 N protein determination

2.5 線性范圍和檢出限

分別移取一定量的 Pro、Val、Leu、Ile、Phe和Pro-13C5、Val-13C5、Leu-13C615N、Ile-13C6、Phe-13C9儲(chǔ)備液,配制氨基酸濃度為10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL,內(nèi)標(biāo)濃度為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。經(jīng)LC-MS/MS分析后,以氨基酸和相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的濃度比為橫坐標(biāo)、峰面積比為縱坐標(biāo),繪制回歸方程,分別以信噪比3和10計(jì)算檢出限和定量限,結(jié)果列于表2。5種氨基酸在10～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)均大于0.995,檢出限范圍為0.02～0.07 ng/mL,定量限范圍為0.06～0.2 ng/mL。

表2 5種氨基酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限Table 2 Regression equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of 5 amino acids

2.6 回收率和精密度

稱取適量標(biāo)準(zhǔn)中間液,加入棕色安瓿瓶的5種氨基酸質(zhì)量分別為25 ng、50 ng和100 ng,按1.4節(jié)步驟處理,每個(gè)水平平行處理3份。經(jīng)LC-MS/MS分析后,結(jié)果表明,3個(gè)不同質(zhì)量水平下5種氨基酸的回收率在97.0%～102.4%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.1%～3.0%之間。

2.7 檢測(cè)應(yīng)用

新冠病毒N蛋白測(cè)定的總離子流圖示于圖2。采用本研究所建立的方法,測(cè)定GBW(E)091110 新型冠狀病毒核衣殼蛋白(N蛋白)人源IgG單克隆抗體溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量,由Val、Leu、Ile、Phe測(cè)得含量計(jì)算的抗體濃度分別為82.30、84.60、84.10、85.10 μg/g,4種氨基酸含量計(jì)算的抗體濃度符合正態(tài)分布,且結(jié)果一致、等精度,因此抗體濃度為84.0 μg/g。測(cè)定結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書給出的標(biāo)準(zhǔn)值(85.3±8.5) μg/g范圍內(nèi),En值0.14<1,表明測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值相一致。

采用本研究所建立的方法,參加了“新冠病毒N蛋白同位素稀釋質(zhì)譜法測(cè)量能力”國家計(jì)量比對(duì),測(cè)量結(jié)果與主導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室等效一致,比對(duì)結(jié)果符合要求。

3 小結(jié)

本研究采用同位素稀釋質(zhì)譜法建立了20種天然氨基酸的分析方法,通過對(duì)蛋白質(zhì)水解液中5種氨基酸準(zhǔn)確、精密、靈敏的定量分析,實(shí)現(xiàn)了高準(zhǔn)確度的蛋白質(zhì)定量測(cè)量,測(cè)量結(jié)果可溯源至國際基本單位。該方法測(cè)量新冠病毒N蛋白人源IgG單克隆抗體有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值一致,采用該方法參加新冠病毒N蛋白國家計(jì)量比對(duì)的測(cè)量結(jié)果滿意,證明該方法對(duì)多種不同蛋白含量測(cè)定均具有足夠的準(zhǔn)確性,可作為通用方法應(yīng)用于蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制和臨床診斷、食品安全中各種蛋白質(zhì)分析的校準(zhǔn),建立蛋白質(zhì)分析的計(jì)量溯源性。