喬麟軼 ，李 銳 ，郝宇瓊 ，喬 玲 ，李 欣 ，張曉軍 ，暢志堅 ，鄭興衛(wèi)

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 小麥研究所，山西 臨汾 041000）

小麥?zhǔn)俏覈闹骷Z作物。新中國成立以來，育種家通過選育和推廣高產(chǎn)品種，實現(xiàn)了小麥產(chǎn)量飛躍式增長。然而，隨著人口持續(xù)增加以及耕地面積逐漸縮小，小麥增產(chǎn)在長期內(nèi)仍是一個主要的育種目標(biāo)[1]；此外，全球氣候變化造成極端天氣頻發(fā)，對小麥抗旱、耐熱、耐澇、抗穗發(fā)芽等方面提出了更高要求，而常規(guī)育種技術(shù)在選育突破性高產(chǎn)抗逆小麥品種工作中表現(xiàn)出一定的局限性，因此，必須結(jié)合高效生物技術(shù)，進一步發(fā)掘小麥增產(chǎn)和抗逆潛力，才能滿足今后育種需求、保障糧食安全[2]。

植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)自1983年問世以來，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)育種領(lǐng)域，并在玉米、大豆、棉花、油菜等作物中獲得成功[3]。1992年，VASIL 等[4]利用基因槍介導(dǎo)法獲得了世界上第1 例小麥轉(zhuǎn)基因植株。然而，小麥為異源六倍體，基因組龐大且復(fù)雜、再生能力差，且不同品種的轉(zhuǎn)化效率存在差異，一度限制了遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用[5]。國內(nèi)外最常用的轉(zhuǎn)化載體品種為農(nóng)藝性狀較差的春小麥品種Fielder[6]和Bobwhite[7]。近年來，小麥分子技術(shù)發(fā)展迅速，完成重測序的我國小麥品種達100 余份，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)也不斷完善[8-9]。因此，我國育種家開始將當(dāng)?shù)刂髟云贩N作為載體品種，通過優(yōu)化組培條件和轉(zhuǎn)化條件，建立對應(yīng)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。如中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院構(gòu)建的科農(nóng)199 遺傳轉(zhuǎn)化體系[10]、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院構(gòu)建的寧麥13 遺傳轉(zhuǎn)化體系[11]、西北農(nóng)林科技大學(xué)構(gòu)建的小偃22 遺傳轉(zhuǎn)化體系[12]等。

山西省地理位置獨特，種植區(qū)域多為典型半干旱地區(qū)，小麥品種歷來以耐逆、優(yōu)質(zhì)著稱[13]，如長6878、晉麥47、臨汾5064 等品種均具有很好的代表性。其中，臨汾5064 作為我國小麥優(yōu)質(zhì)骨干親本，具有矮稈、早熟、千粒質(zhì)量高、品質(zhì)好等特點，已育成衍生品種（系）80 多個，其中，濟南17 和濟麥19 在黃淮北片大面積推廣，分別獲得國家科技進步二等獎；新麥26 是當(dāng)前黃淮南片主推品種，是我國加工品質(zhì)最好的品種；農(nóng)大152、農(nóng)大135 和農(nóng)大1195 等也在北部冬麥區(qū)生產(chǎn)上得到應(yīng)用。這些衍生品種不僅生產(chǎn)上表現(xiàn)突出，也是當(dāng)前小麥品質(zhì)育種的主要親本，是我國小麥品質(zhì)改良的基礎(chǔ)[14]。

本研究通過設(shè)置不同的培養(yǎng)基激素濃度和轟擊壓力參數(shù)，構(gòu)建了臨汾5064 幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系，以期搭建適合山西省小麥育種需求的技術(shù)平臺，并為其后代衍生品種的轉(zhuǎn)基因育種提供有價值的信息。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

基因槍轉(zhuǎn)化的受體材料為山西冬小麥品種臨汾5064（2n=6x=42，AABBDD），由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所提供。

用于轉(zhuǎn)化的測試質(zhì)粒為pCAMBIA-Pubi-ERF8-E9[15]，包含ERF8基因編碼區(qū)（全長762 bp），由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所小麥細胞工程與分子育種實驗室提供。金粉購自Bio-Rad 公司（美國），所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 試驗方法

田間試驗在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)東陽示范基地溫室進行；組培試驗在作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室完成；基因槍轟擊試驗在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所小麥細胞工程與分子育種實驗室完成。

1.2.1 幼胚處理 將臨汾5064 分3 批種植于溫室，每批播種期相差7 d。在植株開花14 d 后剪取麥穗帶回實驗室收獲未成熟籽粒，用70%乙醇對籽粒表面消毒10 min，再用無菌水沖洗2 次備用。

1.2.2 不同激素濃度誘導(dǎo)培養(yǎng) 在超凈臺中將處理好的籽粒幼胚盾片平面向上接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)皿（90 mm）約接種60 個幼胚，于25 ℃暗培養(yǎng)，14 d 后統(tǒng)計出愈率。誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的激素質(zhì)量濃度設(shè)置3 種處理：1.5（A1）、2.0（A2）、2.5（A3）mg/L 的2，4-D，其余成分為MS+200 mg/L 水解酪蛋白+100 mg/L 肌醇+30 g/L 蔗糖+2 g/L 植物膠，pH 值為5.8。

1.2.3 不同激素濃度分化培養(yǎng) 將幼胚愈傷移入分化培養(yǎng)基，于23 ℃、16 h光/8 h暗條件下培養(yǎng)14 d，統(tǒng)計分化率。再生培養(yǎng)基中的激素濃度設(shè)置4 種處理：0.2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA（B1）、0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA（B2）、0.5 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA（B3）和0.5 mg/L 2，4-D +0.5 mg/L 6-BA（B4）。其余成分為MS+0.15 g/L 天冬酰胺+40 g/L 麥芽糖+2 g/L 植物膠，pH 值為5.8。

1.2.4 不同激素濃度生根培養(yǎng) 將分化出芽的愈傷組織轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基，于23 ℃、16 h 光/8 h 暗條件下培養(yǎng)，28 d后統(tǒng)計生根率。生根培養(yǎng)基中的激素濃度設(shè)置4 種處理：0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L 6-BA（C1）、0.1 mg/L 2，4-D（C2）、0.1 mg/L 6-BA（C3）和無激素（C4）。其余成分為MS+0.075 g/L天冬酰胺+20 g/L 麥芽糖+2 g/L 植物膠，pH 值為5.8。

1.2.5 不同轟擊壓力轉(zhuǎn)化 基于上述優(yōu)化后的再生培養(yǎng)體系，將愈傷組織移入高滲培養(yǎng)基（含9%甘露醇的誘導(dǎo)培養(yǎng)基），于25 ℃暗培養(yǎng)4 h。使用0.6 μm 金粉（Bio-Rad，美國）制備20 mg/mL 金粉懸浮液，加入1/50 體積的1 μg/μL 質(zhì)粒溶液，將包被有DNA 的金粉懸浮液混勻后涂于微彈載片，每片10 μL，待干燥后用PDS-1000/He 基因槍（Bio-Rad，美國）轟擊，每次涂液前將懸浮液漩渦處理混勻。設(shè)3 個轟擊壓力分別為650（D1）、900（D2）、1 100（D3）psi，每皿轟擊一次。將轟擊后的愈傷組織先后移入分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，完成植株再生。

1.2.6 PCR 檢測 剪取再生植株的葉片，采用CTAB 法提取基因組DNA。根據(jù)ERF8基因外顯子序列，在跨內(nèi)含子處設(shè)計檢測引物F：5′-CGCTG AGGAACAAGGGAGG-3′和R：5′-CCGAACGG CAGGTTGACAG-3′，預(yù)期產(chǎn)物片段為421 bp。PCR反應(yīng)體系為10 μL：ddH2O 3.5 μL，PCR Mixture 5 μL（生工生物，中國上海），上下鏈引物各0.25 μL，DNA 模板（100 ng/μL） 1.0 μL。PCR 擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性25 s，58 ℃復(fù)性25 s，72 ℃延伸25 s，共30 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。PCR 產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素濃度對愈傷誘導(dǎo)率的影響

臨汾5064 幼胚在3 種激素濃度的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中均可形成愈傷組織，但出愈率不同。其中，在含1.5 mg/L 2，4-D 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（A1 處理）條件下，300 個參試幼胚中有203 個形成了愈傷組織，占比67.7%；在含2.0 mg/L 2，4-D 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（A2 處理）條件下，300 個參試幼胚中有249 個形成了愈傷組織，占比83.0%；在含2.5 mg/L 2，4-D 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（A3 處理）條件下，300 個參試幼胚中有220 個形成了愈傷組織，占比73.3%。當(dāng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的2，4-D 質(zhì)量濃度為2.0 mg/L 時，幼胚愈傷誘導(dǎo)率最高（表1）。

表1 培養(yǎng)基激素濃度對誘導(dǎo)幼胚愈傷的影響Tab.1 Effects of hormone concentrations in culture medium on the induction of immature embryo calli

2.2 激素濃度對分化率的影響

將臨汾5064 幼胚愈傷組織分別移到4 種激素濃度的分化培養(yǎng)基中（B1～B4 處理），每個處理組含150 個愈傷組織。在14 d 后，各個處理組均有再生芽產(chǎn)生（表2）。

表2 培養(yǎng)基激素濃度對愈傷分化的影響Tab.2 Effects of hormone concentrations in culture medium on the differentiation of calli

由表2可知，當(dāng)分化培養(yǎng)基包含0.2 mg/L 2，4-D和0.2 mg/L 6-BA 時（B1 處理），發(fā)生分化的愈傷組織數(shù)為105個；當(dāng)包含0.2 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L 6-BA 時（B2 處理），分化愈傷組織數(shù)為94 個；當(dāng)包含0.5 mg/L 2，4-D 和0.2 mg/L 6-BA 時（B3 處理），分化愈傷組織數(shù)為73 個；當(dāng)包含0.5 mg/L 2，4-D 和0.5 mg/L 6-BA 時（B4 處理），分化愈傷組織數(shù)為78 個。不同濃度處理的分化率從高到低依次為70.0%（B1）、62.7%（B2）、52.0%（B4）和48.7%（B3）。分化培養(yǎng)基中，2，4-D 質(zhì)量濃度為0.2 mg/L 時的愈傷分化率高于0.5 mg/L，并且當(dāng)6-BA 質(zhì)量濃度也為0.2 mg/L 時具有最多的分化愈傷數(shù)。

2.3 激素濃度對生根率的影響

將臨汾5064 分化愈傷組織分別移到4 種激素濃度的生根培養(yǎng)基中（C1～C4 處理），每個處理組含80 個分化愈傷組織。在28 d 后，每種處理均有根生成，但生根率差異較大（表3）。當(dāng)生根培養(yǎng)基包含0.1 mg/L 2，4-D 和0.1 mg/L 6-BA 時（C1 處理），生根愈傷組織數(shù)為31 個；當(dāng)生根培養(yǎng)基只包含0.1 mg/L 2，4-D 時（C2 處理），生根愈傷組織數(shù)為62 個；當(dāng)生根培養(yǎng)基只包含0.1 mg/L 6-BA 時（C3 處理），生根愈傷組織數(shù)為26 個；當(dāng)生根培養(yǎng)基中不添加2，4-D 和6-BA 時（C4 處理），生根愈傷組織數(shù)為57 個。不同處理愈傷組織的生根率從高到低依次為77.5%（C2）、71.3%（C4）、38.8%（C1）和32.5%（C3）。生根培養(yǎng)基中不添加6-BA 時的生根率高于添加0.1 mg/L 6-BA，此時，2，4-D 質(zhì)量濃度造成的生根率變化不大，分別為77.5%（0.1 mg/L 2，4-D 處理）和71.3%（不添加2，4-D 處理）。然而，C2 處理下的植株可以生成3～4 個根，而C4 處理下的植株只生成1～2 個根（圖1），因此，生根最適培養(yǎng)基為0.1 mg/L 2，4-D 且不添加6-BA。

圖1 不同激素濃度下的再生植株根部Fig.1 Roots of regenerated plants under different hormone concentrations

表3 培養(yǎng)基激素濃度對愈傷生根的影響Tab.3 Effects of hormone concentrations in culture medium on the rooting of calli

2.4 基因槍轟擊壓力對轉(zhuǎn)化率的影響

利用上述優(yōu)化激素濃度的培養(yǎng)基對臨汾5064幼胚開展基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，在轟擊步驟設(shè)置650、900、1 100 psi 共3 個壓力處理組（D1～D3），分別導(dǎo)入測試質(zhì)粒PCAMBIA-Pubi-ERF8-TE9，結(jié)果顯示（表4），在650 psi 轟擊壓力（D1）下最終獲得187 株再生植株，但通過PCR 檢測均沒有擴增出ERF8的測試片段；在900 psi 轟擊壓力（D2）下獲得192 株再生植株，其中有4 株成功擴增出目標(biāo)條帶，遺傳轉(zhuǎn)化率為0.50%；在1 100 psi 轟擊壓力（D3）下則獲得226 株再生植株，其中有1 株P(guān)CR 陽性株，轉(zhuǎn)化率為0.13%。因此，900 psi 是更合適臨汾5064幼胚轉(zhuǎn)化的基因槍轟擊壓力。

表4 再生優(yōu)化體系下轟擊壓力對轉(zhuǎn)化率的影響Tab.4 Effects of bombardment pressure on transformation rate under optimized regeneration system

3 結(jié)論與討論

遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是過表達基因和基因編輯的前提，也是生物分子育種的基礎(chǔ)。在小麥中，遺傳轉(zhuǎn)化主要采用基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。與后者相比，基因槍法具有轉(zhuǎn)化受體廣泛的優(yōu)點，應(yīng)用更為普遍[16]。最早被用于基因槍遺傳轉(zhuǎn)化的小麥品種為美國春小麥Bobwhite[4]，通過不斷優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化體系，其轉(zhuǎn)化效率從0.1%～0.2%[17-18]提高到0.3%～1.0%[19-21]；另一個常用轉(zhuǎn)化載體品種為春小麥Fielder，其轉(zhuǎn)化效率達到了0.7%～2.5%[6]。這些體系的建立實現(xiàn)了在小麥中觀察基因?qū)χ仓昊蚱鞴俦硇偷挠绊懀龠M了小麥基因的功能解析和育種應(yīng)用。然而，該轉(zhuǎn)化體系具有一定的局限性，如用于編輯的靶基因在Bobwhite 和Fielder 中可能是無功能的等位變異，而且這2 個品種春性較強，在我國北方田間的耐寒性和農(nóng)藝性狀較差，對陽性株表型的觀察會受到影響。因此，發(fā)掘不同遺傳背景的小麥轉(zhuǎn)化載體品種尤為重要。

近年來，國內(nèi)多個單位基于當(dāng)?shù)赜N和科研需求，建立了針對特定小麥品種的遺傳轉(zhuǎn)化體系，轉(zhuǎn)化成功的小麥品種有濟麥20、魯麥14、揚麥158、科農(nóng)199、新春9 號、石4185、豫麥66 等[5]。山西省小麥種質(zhì)資源以抗旱和優(yōu)質(zhì)著稱，部分種質(zhì)如臨汾5064 曾為提高全國小麥產(chǎn)量和品質(zhì)作出了重要貢獻。本研究通過優(yōu)化組培和轉(zhuǎn)化條件，建立了臨汾5064 的基因槍遺傳轉(zhuǎn)化體系：幼胚于含2.0 mg/L 2，4-D 的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中25 ℃暗培養(yǎng)14 d；將誘導(dǎo)的愈傷組織移入高滲培養(yǎng)基（添加了9%甘露醇的誘導(dǎo)培養(yǎng)基）于25 ℃暗培養(yǎng)4 h；使用0.6 μm 金粉與目標(biāo)質(zhì)粒溶液混勻制備微彈，利用基因槍在900 psi 壓力下將微彈轟擊到愈傷組織；將轟擊后的愈傷組織移入含0.2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA 的分化培養(yǎng)基中，于23 ℃、16 h 光/8 h 暗條件下培養(yǎng)14 d；將分化出芽的愈傷組織轉(zhuǎn)移至含0.1 mg/L 2，4-D的生根培養(yǎng)基，于23 ℃、16 h 光/8 h 暗條件下培養(yǎng)28 d；檢測再生植株中的陽性株。本研究結(jié)果將有助于優(yōu)異基因的發(fā)掘和功能解析、以及不利基因的定點編輯和定向改良，從而創(chuàng)制突破性新種質(zhì)，實現(xiàn)小麥種質(zhì)資源的快速更新?lián)Q代。

組織培養(yǎng)體系是遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的寧麥13 遺傳轉(zhuǎn)化體系中，共涉及預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基、侵染培養(yǎng)基、共培養(yǎng)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基和YEP 培養(yǎng)基等8 種培養(yǎng)基[11]?？傮w而言，基因槍法所涉及的組培培養(yǎng)基比農(nóng)桿菌法較為簡單，通常只需要誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、高滲培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。為了建立冬小麥品種臨汾5064 的組培體系，本研究對不同階段的培養(yǎng)基分別設(shè)置多個激素濃度處理，總結(jié)了臨汾5064 的幼胚最適組培體系：誘導(dǎo)培養(yǎng)基含2.0 mg/L 2，4-D；分化培養(yǎng)基含0.2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 6-BA；生根培養(yǎng)基含0.1 mg/L 2，4-D。此外，有研究報道向培養(yǎng)基中添加一些化學(xué)成分也可以提高轉(zhuǎn)化率。如GREER 等[22]將誘導(dǎo)培養(yǎng)基中硝酸銨濃度增加了1 倍，從而使基因槍介導(dǎo)的小麥幼胚轉(zhuǎn)化率提高了2～3 倍，推測硝酸銨有助于增加外源DNA 穩(wěn)定性以及向小麥染色體上整合的效率。

除培養(yǎng)基激素濃度以外，轉(zhuǎn)化轟擊壓力是影響基因槍法轉(zhuǎn)化效率的另一個重要因素[8,10,23-25]。在優(yōu)化后的組培體系基礎(chǔ)上，分別設(shè)置3 個轟擊壓力并測試轉(zhuǎn)化效率，再生植株獲得率達23.4%～28.3%，但其中的陽性株少，最高轉(zhuǎn)化率只有0.5%，表明其他轟擊參數(shù)也需要進一步優(yōu)化，例如金粉粒徑、質(zhì)粒濃度、轟擊距離等[10,26-27]。通常情況下，金粉粒徑大、轟擊距離近、轟擊強度高會使外源基因瞬時表達量增加，但也會導(dǎo)致愈傷組織損傷，影響再生能力[28-29]。此外，轟擊距離過近還會造成金粉分布不均勻的問題[30]。國外實驗室基于Fielder、Bobwhite 等春小麥品種，總結(jié)了基因槍轉(zhuǎn)化小麥的主要轟擊參數(shù)：金粉粒徑0.6 μm、質(zhì)粒濃度294 ng/槍、轟擊距離12 cm、轟擊強度650～900 psi[27，30]。閔東紅等[10]、賀曉嵐等[31]則先后以科農(nóng)199 為受體材料對基因槍轉(zhuǎn)化小麥的影響因素進行了優(yōu)化，認為在金粉顆粒0.6 μm、質(zhì)粒濃度250～500 ng/槍、轟擊距離6～12 cm、轟擊強度650 psi 的條件下，轉(zhuǎn)化效果最佳。本研究同樣選用了0.6 μm 金粉，制備的質(zhì)粒濃度約200 ng/槍，轟擊距離12 cm、轟擊強度900 psi。由于目前公認0.6 μm 金粉是更適合轉(zhuǎn)化小麥的粒徑，今后將重點測試不同質(zhì)粒濃度和轟擊距離對轉(zhuǎn)化率的影響，以期優(yōu)化臨汾5064 幼胚的基因槍轟擊參數(shù)。