李佳敏 ，賈 瓊 ，秦蓉芬 ，遲志端 ，王富明 ，范瑞文

（1.山西農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，山西 太谷 030801；2.晉中市莊子鄉(xiāng)綜合便民服務(wù)中心，山西 晉中 030600）

氧是生命活動中所必需的物質(zhì)，且在其中起重要作用[1]。缺氧在惡性腫瘤中是較為常見的，且缺氧還是腫瘤生長環(huán)境最顯著的特征之一[2]。組織和細胞是通過缺氧誘導因子（Hypoxia inducible factor，HIF）誘導相應靶基因來適應氧氣濃度[3]。HIF-1、HIF-2 及HIF-3 是HIF 的3 種亞型，均由氧調(diào)節(jié)型α 亞基和組成型β 亞基構(gòu)成，α 亞基是活性亞基，又分為HIF-1α，HIF-2α 和HIF-3α[4]。HIF-1α 與氧濃度的關(guān)系密切，HIF-1α 是缺氧細胞基因表達的關(guān)鍵，其穩(wěn)定性和活性受各種翻譯后修飾、羥基化、乙酰化和磷酸化的調(diào)節(jié)[5]。HIF-1α 成為許多適應低氧微環(huán)境疾病的主要參與者，如癌癥、中風和心臟病[6]。因此，阻斷HIF-1α 的表達或阻斷其相互作用的蛋白質(zhì)會抑制腫瘤生長[7]。HIF-1α 在腫瘤組織中表達增高，一方面與腫瘤組織增生過快造成局部組織缺氧有關(guān)，另一方面，HIF-1α 是多種依賴氧張力的調(diào)節(jié)因子[8]，與某些癌基因激活或抑癌基因失活有關(guān)。因此，HIF-1α 的表達量可作為檢測惡性腫瘤的標準。

黑色素瘤來源于黑色素細胞，是一種具有侵襲性的皮膚癌[9-10]。黑色素瘤雖然發(fā)病率不高，但其死亡率較高[11-12]。黑色素瘤多發(fā)于哺乳動物皮膚和黏膜，均具有侵襲性和致死性，且預后差[13-14]。HIF-1α 的表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，研究其在黑色素瘤發(fā)病和發(fā)展機制中的作用對于改善患者的臨床結(jié)果至關(guān)重要[15]。HIF-1α 介導不同過程的基因轉(zhuǎn)錄，包括應激適應、代謝、凋亡、腫瘤生長、血管生成和侵襲[16]。近年來研究還發(fā)現(xiàn)，HIF-1α 參與了PI3K/Akt/mTOR、Ras/RAF/MEK/ERK、JAK/STAT、Wnt/β-catenin、Notch 等信號通路[17-18]，這些路徑及其相關(guān)的復雜變化影響黑色素瘤的生長和發(fā)展、新陳代謝、運動和細胞凋亡[19]。

傳統(tǒng)抗體藥物分子較大，結(jié)構(gòu)復雜，較易失活且價格昂貴。納米抗體的優(yōu)勢在于分子小、滲透性強，能夠針對傳統(tǒng)單抗所不能觸及的抗原表位設(shè)計藥物，使其更好地到達腫瘤內(nèi)部以及穿透血腦屏障[20]。因此，基于HIF-1α 表達受到抑制將發(fā)揮抗腫瘤功能，結(jié)合納米抗體的優(yōu)勢，本研究以羊駝源黑色素瘤B16 噬菌體文庫制備HIF-1α 納米抗體，并驗證其在黑素瘤的生長和發(fā)展過程中的作用，旨在為抑制腫瘤生長提供新思路。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

大腸桿菌TG1、輔助噬菌體M13K07、B16 細胞和羊駝源黑色素瘤B16 噬菌體文庫、正常小鼠腦組織切片均由山西農(nóng)業(yè)大學羊駝生物工程實驗室保存提供。HIF-1α 多肽購自武漢三鷹生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 HIF-1α 納米抗體的篩選 將HIF-1α 多肽稀釋至終質(zhì)量濃度為20 μg/mL，包被免疫管，4 ℃靜置過夜，以備用。將TG1 接種于5 mL 2YT 培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 過夜振蕩培養(yǎng)以活化。

將500 μL 噬菌體文庫溶于100 mL 2YT/AG溶液培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)至D600nm值為0.4～0.6；加入100 μL 輔助噬菌體，混勻靜置30 min，再37 ℃、200 r/min 振蕩30 min，棄上清，加入100 mL 2YT/AK 液體培養(yǎng)基重懸沉淀，30 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)至過夜。次日，將TG1 接入30 mL 2YT 中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至D600nm=0.4備用。4 ℃、11 000 r/min 離心10 min，去上清加入1/5 體積遇冷的PEG/NaCl，冰上放置70 min。離心后用2.4 mL 無菌PBS 重新懸浮菌體沉淀，再次離心，回收上清加入事先包被20 μL/mLHIF-1α 多肽的免疫包被管中。37 ℃封閉1 h 后用PBS 沖洗，并加入三乙醇胺，緩慢振蕩15 min，加入Tris-HCl中和。將其涂布于2YT/AG 平板，30 ℃培養(yǎng)過夜。次日收集菌落，作為HIF-1α 一級文庫。

按上述方法，分別以10、5、2.5 μg/mL 的HIF-1α 質(zhì)量濃度進行第2 輪、3 輪、4 輪的淘篩。從第4 輪篩選洗脫物滴定的平板上，隨機挑取96 個單克隆接種于2YTAG 中與30 ℃振蕩培養(yǎng)8 h，加入稀釋的噬菌體，37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h 后離心，棄去上清用含有Kana 抗性的培養(yǎng)基重懸沉淀，37 ℃過夜培養(yǎng)。

將HIF-1α 蛋白和BSA 蛋白包被于96 孔板，用ELISA 法篩選陽性克隆并進行測序，比對測序結(jié)果，在NCBI基因庫中選擇VHH序列并用DNAMAN進行比對和ORF Finder 軟件進行氨基酸序列分析，選取能夠完整表達蛋白質(zhì)的菌株，進行后續(xù)試驗。

1.2.2 載體的構(gòu)建 按陽性克隆的DNA 序列設(shè)計引物（含BamHI、SalI 酶切位點）：HIF-1α-F：5'-CGGGATCCGAGTCGGGAGGAGGCTTGG-3'；HIF-1α -R：5'-GCGTCGACTGAGGAGACGGT GACTAGGG-3'。

PCR 擴增反應體系為50 μL：2×Es Taq Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板5 μL，ddH2O補至50 μL。PCR 反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR 產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳膠回收，將回收產(chǎn)物和PMD19-T 連接，PMD-19T 反應體系為：PMD-19T 1 μL，回收產(chǎn)物4 μL，Solution Buffer 1 μL。之后再以BamHI、SalI 將19TNbHIF-1α 和pET-28a 進行雙酶切并進行T4 連接（雙酶切體系為：10×QuickCut Buffer 5 μL，BamHⅠ 1 μL，SalⅠ 1 μL，19TNbHIF-1α 質(zhì)粒8 μL，ddH2O 35 μL；T4 連接體系為：回收菌體質(zhì)粒6 μL，回收載體2 μL，T4 連接酶1 μL，T4Buffer 2 μL，ddH2O 9 μL，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，涂布于含100 μg/mL Kana 的LB 平板上37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆接種于LB-Kana 液體培養(yǎng)基搖至D600為0.4～0.6 后測序，將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒命名為pET28a-NbHIF-1α。

1.2.3 HIF-1α 納米抗體表達與純化 將5 μL pET28a-NbHIF-1α 提取質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）中，冰浴30 min，42 ℃熱激45 s，再冰浴3 min，37 ℃、200 r/min 振蕩活化1 h，菌液接種于LBKana 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩至D600為0.6，加入0.3 mmol/L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），28 ℃、200 r/min 搖菌4 h 后收菌，將菌液沉淀用PBS 清洗2 次后超聲破碎，16 000 g 離心30 min。使用AKTA 層析系統(tǒng)與鎳離子金屬螯合親和層析介質(zhì)（Ni-NTA）預裝柱對帶有His 標簽的納米抗體進行純化，分別用不同梯度咪唑和分子篩除去雜蛋白，將蛋白用超濾管濃縮后分裝，-80 ℃保存。

1.2.4 HIF-1α 納米抗體的應用 將6 周齡正常小鼠腦組織研磨后提取總蛋白后進行SDS-PAGE 電泳，將純化的HIF-1α 納米抗體作為一抗、HRPHis-Tag 作為二抗進行Western Blot 檢測腦組織中HIF-1α 蛋白的表達。

將制備的小鼠腦組織制備石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原修復，然后在3%雙氧水中室溫孵育30 min。用PBS 洗滌后，用5%BSA 在37 ℃封閉1 h，然后與純化的納米抗體或PBS（空白對照）孵育，之后于37 ℃在His-tag 抗體孵育1 h。DAB 顯色，隨時觀察停止顯色，然后用蘇木精復染，脫色封片，檢測小鼠腦組織中HIF-1α 表達分布。

1.2.5 HIF-1α納米抗體對黑素瘤細胞增殖的影響待B16 細胞在培養(yǎng)皿中長到80%～90%，與HIF-1α 納米抗體加入96 孔板中，并保證每孔2 000 個，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中待6 h 后，在每孔中加入10 μL CCK-8 工作液，檢測0、3、6、9 h 的450 nm 波長的吸光度。

1.2.6 HIF-1α 納米抗體對黑素瘤細胞遷移的影響 將培養(yǎng)到80%～90%的B16 細胞傳代至12 孔板中，待細胞長滿12 孔板后，使用直尺與100 μL 槍頭在12 孔板劃平行線，用PBS 緩沖液洗凈殘留細胞。試驗組加入HIF-1α 納米抗體。分別在劃痕0、12、24、36 h 后對同一位置進行拍照，觀察細胞遷移結(jié)果。

1.2.7 HIF-1α 納米抗體對增值相關(guān)蛋白表達的影響 選取培養(yǎng)狀態(tài)良好且培養(yǎng)到80%～90%的豐度，細胞傳代到6 孔板中，試驗組和對照組各3 個孔。試驗組中加入HIF-1α 抗體，放入培養(yǎng)箱中進行過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細胞，提取細胞總蛋白。用所提蛋白進行Westen Blot 檢測，以β-actin為內(nèi)參，檢測細胞中Ras、RAF1、ERK1/2、RAC1 和VEGF 蛋白表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HIF-1α 納米抗體的篩選及序列特征

通過對陽性克隆的序列進行比對，篩選出6 個VHH 序列。經(jīng)過ELISA 法對6 個陽性克隆進行抗原結(jié)合力檢測，選取1A12 作為候選克?。ū?）。1A12 的核苷酸序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的VHH 序列相似性達到78%（圖1-A），通過對1A12 克隆的氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)該序列沒有形成跨膜區(qū)（圖1-B），為親水性蛋白（圖1-C）。1A12 的氨基酸序列由88 個氨基酸構(gòu)成，含有完整的4 個框架區(qū)（FR1～FR4）和3 個高度可變抗原結(jié)合區(qū)即互補決定區(qū)（CDR1～CDR3），其中CDR3 是抗原特異性識別的區(qū)域，含有11 個氨基酸（圖1-D）。

表1 HIF-1α 單克隆ELISA 篩選結(jié)果Tab.1 Monoclonal screening of HIF-1α by ELISA

2.2 納米抗體表達、純化與結(jié)合性檢測

以挑選出的VHH（1A12）序列質(zhì)粒為模板進行PCR，擴增出大小約為400 bp 的VHH 片段（圖2-A）。將VHH 片段與PMD19-T 連接后再連接到pET-28a 表達載體上以構(gòu)建質(zhì)粒（圖2-B）。

圖2 質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.2 Construction of the plasmid

構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)原核表達和純化后，用考馬斯亮藍染色以及Western Blot 進行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，考馬斯亮藍染色得到的條帶較單一（圖3-A）；Western Blot 檢測發(fā)現(xiàn)大小約為16 ku 的特異性條帶（圖3-B），說明該蛋白為表達所得的特異蛋白。

選取小鼠腦組織，免疫組織化學一抗試驗組用HIF-1α 納米抗體，用PBS 作對照，可看出大腦組織中的免疫陽性信號（圖3-C），由此可見，HIF-1α 納米抗體可以與抗原HIF-1α 結(jié)合，用于HIF-1α 的組織定位。

Western Blot 試驗中一抗用純化所得的HIF-1α 納米抗體，選取小鼠腦組織提取蛋白，結(jié)果顯示，HIF-1α 納米抗體作為一抗可以與抗原HIF-1α 結(jié)合，檢測到特異性的免疫陽性條帶，分子質(zhì)量約為100、120、130 ku（圖3-D），說明腦組織中表達HIF-1α。由此可知，制備的HIF-1α 納米抗體可用于Western Blot 試驗的一抗以檢測組織中HIF-1α 抗原表達的相對定量。

2.3 HIF-1α 納米抗體對黑色素瘤細胞增殖、遷移及其相關(guān)蛋白表達的影響

將HIF-1α 納米抗體加入B16 細胞培養(yǎng)基中，用CCK-8 法檢測并觀察對B16 細胞增殖的影響，結(jié)果顯示，在HIF-1α 納米抗體作用下，在3～9 h 內(nèi)，加入HIF-1α 納米抗體的B16 細胞表現(xiàn)出了抑制效果（圖4-A）。將HIF-1α納米抗體加入B16細胞培養(yǎng)基中，用細胞劃痕試驗檢測HIF-1α 納米抗體對B16細胞遷移的影響。B16 細胞在培養(yǎng)0、12、24、36 h 檢測，在12 h 時已出現(xiàn)抑制細胞遷移現(xiàn)象（圖4-B）。

圖4 HIF-1α 納米抗體對B16 細胞增殖、遷移及其相關(guān)蛋白表達的影響Fig.4 Effects of HIF-1α nano-antibody on proliferation，migration，and expression of the related proteins in B16 cells

在CCK-8 法檢測HIF-1α 納米抗體抑制B16細胞增殖的基礎(chǔ)上，提取HIF-1α 納米抗體處理15 h后的B16 細胞總蛋白，用Western Blot 檢測VEGF、RAS、ERK、RAC 和RAF 蛋白的表達量，與對照組相比，HIF-1α 納米抗體處理B16 細胞后其蛋白量均呈下降趨勢（圖4-C、D）。

3 結(jié)論與討論

HIF-1α 亞基是堿性-環(huán)-螺旋（basic-helixloop-helix, Bhlh）–PAS（per/ARNT/Sim，PAS）)超家族成員之一[21]，HIF-1α 位于多種致癌和抑癌途徑的交匯點，包括PI3K/AKT 和MAPK/ERK 信號通路，而這些信號通路是分子信號網(wǎng)絡(luò)的核心，控制著許多細胞的生長、增殖、分化和生存，而腫瘤組織常高表達HIF-1α[22-23]。通過多種方式抑制HIF-1α 的表達有望成為治療黑色素瘤的方法。

本研究通過已建立的羊駝源黑素瘤噬菌體文庫，以HIF-1α 多肽進行4 輪淘篩，篩選出1 株陽性單克隆菌株，經(jīng)過原核表達載體構(gòu)建并誘導表達目的蛋白，鎳柱純化得到HIF-1α 納米抗體。所得的納米抗體抗原特異性識別區(qū)域CDR3 含有11 個氨基酸殘基超過了傳統(tǒng)抗體CDR3 的平均長度（7～9 個氨基酸殘基），可增大與抗原的接觸面積，因此其與抗原具有較好的親和性。VEGF 家族是一類血管調(diào)節(jié)因子[24]，新生血管生成是腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在機制之一，血管參與加速腫瘤生長、促進腫瘤轉(zhuǎn)移等過程[25]。在黑素瘤細胞中，HIF-1α 納米抗體穿過細胞膜進入胞質(zhì)中，與HIF-1α 結(jié)合后，抑制VEGF 下游靶基因表達，并抑制Ras 信號路徑中關(guān)鍵基因的表達，同時使黑素瘤細胞中ERK 和P-ERK 表達下調(diào)，ERK 是絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）家族成員之一，該酶被激活后，成為磷酸化的ERK（P-ERK）。p-ERK 可以介導信號由胞漿向胞核傳遞，參與調(diào)節(jié)細胞的生長、發(fā)育、分化、分裂等多種生理過程，其異常表達在細胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[26]。并且發(fā)現(xiàn)HIF-1α 納米抗體在黑素瘤細胞中引起RAF1 表達下調(diào)，通過PLC-γ-PKC-Raf-MEKMAPK 信號通路使細胞增殖和遷移速度下降[27]。此外，在腫瘤組織中，由于新生血管管壁僅有1 層內(nèi)皮細胞，缺乏基底膜，內(nèi)皮細胞間常有裂隙，同時VEGF 本身可提高血管通透性，并刺激內(nèi)皮細胞釋放膠原酶使腫瘤細胞與腫瘤組織分離脫落，為腫瘤的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件[28]。因此，HIF-1α 納米抗體在黑素瘤組織中可能會通過抑制血管形成而成為抑制腫瘤生長和發(fā)展的新材料。

本研究獲得的HIF-1α 納米抗體分子質(zhì)量約為16 ku，沒有跨膜結(jié)構(gòu)，具有親水性。HIF-1α 納米抗體在構(gòu)建原核表達載體時加入了His 標簽，將HIF-1α 納米抗體作為Western Blot 和免疫組織化學技術(shù)中的一抗，與組織細胞中的HIF-1α 特異性結(jié)合，使用HRP-His-tag 抗體作為二抗，來檢測HIF-1α在組織中的含量及分布。將自備的HIF-1α 納米抗體作用于B16 細胞時，HIF-1α 納米抗體與HIF-1α結(jié)合，直接影響下游靶基因VEGF，并引發(fā)該信號通路的下調(diào)，抑制B16 細胞的增殖和遷移，揭示其可能在黑色素瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著較為重要的作用，可作為基因治療黑色素瘤的靶點。