王 燦，黃玉玲，楊清松，彭翠仙，李 玲，趙大偉，陶永宏

（云南省文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南 文山 663000）

文山三七［Panax notoginseng（Burk.） F. H.Chen］（下簡(jiǎn)稱三七）是五加科人參屬藥用植物，具有悠久的栽培歷史，是珍貴的中藥材，同時(shí)也是保健品、特色食材等，具有消腫定痛、止血、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、抗疲勞、耐缺氧、抗衰老、降血脂、降血糖、提高機(jī)體免疫力等功效［1-2］。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)記載，三七使用歷史近600 年，栽培歷史近500 年。三七主要分布在我國(guó)西南部海拔1 500 ~ 1 800 m，北緯23.5°的特殊地理氣候環(huán)境中［2］，其中云南文山是三七的原產(chǎn)地和主產(chǎn)地，全國(guó)的三七大多來(lái)源于此。隨著市場(chǎng)對(duì)三七需求量的增加，三七病害、連作障礙的發(fā)生，三七耕作制度的影響，導(dǎo)致三七種植業(yè)存在不斷更換種植地點(diǎn)，農(nóng)戶間相互售賣各地種苗，三七種質(zhì)混雜，極大增加了三七居群間的基因交流等問(wèn)題的出現(xiàn)，影響了三七產(chǎn)業(yè)的正常發(fā)展［2-3］。

基因分型技術(shù)（Genotyping by sequencing，GBS）是一種基于二代測(cè)序的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，可檢測(cè)物種SNP 的變異位點(diǎn)，對(duì)了解種質(zhì)資源的遺傳背景、系統(tǒng)進(jìn)化、群體遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)具有重要意義［4-5］。目前已應(yīng)用GBS 方法對(duì)石斛［6］、黃芪［7］等物種進(jìn)行了群體SNP 的檢測(cè)并用于群體關(guān)聯(lián)分析、遺傳圖譜的構(gòu)建和遺傳多樣性研究。郭燦等［8］根據(jù)地理來(lái)源和種質(zhì)類型將59 份不同茶樹(shù)品種（系）材料分為11個(gè)種群，發(fā)現(xiàn)不同種群間具有較低的基因交流，但種群內(nèi)部具有較高的基因交流，由此提出在育種實(shí)踐中應(yīng)盡量避免相同地理來(lái)源材料間的雜交應(yīng)用。

雖然育種工作者很早就開(kāi)始三七種質(zhì)資源的收集和利用，但由于三七選育周期長(zhǎng)良種少，種質(zhì)資源混雜、自身多樣性豐富等原因?qū)е氯叻N質(zhì)資源的評(píng)價(jià)、收集、利用相關(guān)基礎(chǔ)還很薄弱［1］。為此本研究以28份不同居群三七及其近緣種為材料，采用GBS技術(shù)，初步進(jìn)行不同居群間遺傳結(jié)構(gòu)分析，為后續(xù)更加全面解析三七及其近緣種種質(zhì)資源多樣性評(píng)價(jià)、育種親本選擇、優(yōu)良種質(zhì)性狀遺傳標(biāo)記提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

收集文山州地區(qū)栽培3年以上的人參屬植物葉片樣本共28 份（表1），其中包括25 份文山三七樣本，由文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥物生物研究所陶永宏研究員鑒定為文山三七［Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen］。此外還收集3 份近緣種材料：屏邊三七、姜狀三七、狹葉竹節(jié)參各一份由文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥物生物研究所黃玉玲高級(jí)農(nóng)藝師鑒定為屏邊三七（Panax stipuleanatus）、姜狀三七（Panax zingiberensis）和狹葉竹節(jié)參（Panax japonicasvar.angustifo-lius）。

表1 供試三七及其近緣種植物材料Tab.1 Panax notoginseng and its closely related species materials provided in the experiment

1.2 方法

DNA 提取采用CTAB 法［9］，分別取28 份三七及其近緣種幼嫩葉片材料約0.05 g 用組織研磨儀進(jìn)行研磨。DNA 產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)目的條帶清晰明亮且完整后，利用 TIANGEN Purification Kit 柱式膠回收試劑盒進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)濃度及純度檢測(cè)達(dá)到測(cè)序要求后，送往廣州基迪奧生物科技有限公進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用比對(duì)軟件bwa（0.7.12）采用mem 算法將過(guò)濾后的reads 比對(duì)到五加科人參屬三七［Panax notoginseng（ Burk.） F. H. Chen］參考基因組（NCBI：PRJNA632433）上［10］，比對(duì)完之后結(jié)果使用picard（1.129）軟件進(jìn)行標(biāo)記。使用軟件 GATK （3.4-46）的UnifiedGenotyper 模塊將處理好的比對(duì)文件進(jìn)行多個(gè)樣本的Variant 檢測(cè)，檢測(cè)到的變異使用Variant-Filtration 進(jìn)行過(guò)濾。使用ANNOVAR 對(duì)檢測(cè)出的Variant進(jìn)行功能注釋。通過(guò)得到的SNP信息計(jì)算樣品間遺傳距離，對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析，并使用 treebest 軟件鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。同時(shí)采用Plink 和Admixture軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)和雜合率分析。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序質(zhì)量分析

將28 份三七及其近緣種幼嫩葉片材料DNA 提取后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，電泳圖如下（圖1），條帶清晰可用于后續(xù)建庫(kù)測(cè)序。對(duì)28 份材料的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)共獲得115.64 Gb 數(shù)據(jù)，平均每個(gè)樣品為4.13 Gb。過(guò)濾后各樣本測(cè)序片段數(shù)和堿基數(shù)存在差異，其中最多的是PN-PB-2（測(cè)序片段數(shù)為42 350 070，堿基數(shù)為5 926 130 970 bp），最少的是PN-PL-4（測(cè)序片段數(shù)為15 681 198，堿基數(shù)為2 208 630 526 bp）。測(cè)序質(zhì)量里平均Q20 ≧ 98.63%、平均Q30 ≧ 95.05%、平均GC ≧ 38.47%，測(cè)序質(zhì)量較好，滿足分析要求。（表2）

圖1 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electropherogram

表2 三七及其近緣種植物測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Statistics of plant sequencing data of panax notoginseng and closely related species

在三七及三七近緣種植物與參考基因組比對(duì)統(tǒng)計(jì)表中，單端比對(duì)上的reads 最高的是PZ（11 769 895），雙端比對(duì)上的reads 最高的是PNPB-2 （38 394 164）。未比對(duì)上的reads 最高的是PS達(dá) 8 229 975，最低的是PN-PA-3 僅106 684。比對(duì)率最高的是PN-PA-3 （99.45%），最低的是PS（70.03%）。在雜合率比較中，三七雜合率5.6% ~12.9%，平均值為10.02%，均高于屏邊三七1.3%、姜狀三七6.2%、狹葉竹節(jié)參5.1%（表3）。

表3 三七及其近緣種植物與參考基因組比對(duì)統(tǒng)計(jì)表Tab.3 Statistical table for comparison of panax notoginseng and closely related species with reference genome

2.2 SNP突變類型及數(shù)量

對(duì)SNP 分型結(jié)果進(jìn)行突變統(tǒng)計(jì)，獲得高質(zhì)量SNP 位點(diǎn)1 968 786，InDel 標(biāo)記90 954，All Variant 數(shù)2 059 740。Transition占比為68.49%（1 348 336個(gè)），其中C->T 轉(zhuǎn)換類型最多（420 919 個(gè)），占全部堿基突變類型的21.38%，G->A 轉(zhuǎn)換類型（418 681 個(gè)）占21.27%，T->C 轉(zhuǎn)換類型（254 618 個(gè)）占12.93 %，A->G 轉(zhuǎn)換類型（254 118 個(gè)）占12.91%。Transversion占比為31.51%（620 450個(gè)）。其中C->A顛換類型最多（110 447 個(gè)）占5.61%，C->G 顛換類型最少（36 203個(gè)）占1.84%。轉(zhuǎn)換與顛換比為2.17（圖2）。

圖2 SNP位點(diǎn)堿基突變類型及其數(shù)量Fig.2 Types and quantities of base mutations at SNP sites

對(duì)Variant 注釋發(fā)現(xiàn)功能分類中（表4），非同義突變最大為60 052 個(gè)，約占54.979%，其次是同義突變44 160 個(gè)，約占40.429%，終止子獲得為2 548 個(gè)，約占2.333%。此外標(biāo)記最多的位于基因間區(qū)，約占總量的77.83%，12.31%位于基因中內(nèi)含子區(qū)域，5.30%位于基因中外顯子區(qū)域。1.66%和1.62%分別位于基因下游和上游，位于基因下游區(qū)域同時(shí)又位于上游區(qū)域的占0.18%。UTR3 和UTR5 分別占0.63%、0.45%，位于UTR3 同時(shí)又位于UTR5 區(qū)域的占0.001%。位于剪切位點(diǎn)的占0.03%（表5）。

表4 SNP功能分類Tab.4 Functional classification of the SNP

表5 SNP標(biāo)記的功能性分布Tab.5 Functional distribution of the SNP markers

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)得到的SNP 信息，用treebest 軟件構(gòu)建NJ（Neighbor-joining methods）進(jìn)化樹(shù)（圖3a），可劃分3個(gè)大的類群。即屏邊三七單獨(dú)聚為一類，姜狀三七和狹葉竹節(jié)參聚為一類，文山三七單獨(dú)聚為一類。此外在文山三七中，不同地點(diǎn)采集的樣本分布較為混雜，相同地理來(lái)源的種質(zhì)并未完全歸并到一處。

圖3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Population genetic structure analysis

通過(guò)Plink 和Admixture 進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。提取K= 1 ~ 9 時(shí)的交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率（Cross-valdaion error，CV error），K從2開(kāi)始CV error逐漸增大，因此K= 2 可作為最佳值（圖3b）。Structure 圖可以看出K= 2 時(shí)，PS（屏邊三七）、PZ（姜狀三七）、PJA（狹葉竹節(jié)參）聚為一支；文山三七（PN）聚為一支與進(jìn)化樹(shù)結(jié)果一致，其中PN-ML-5、PN-PA-2、PNPL-3、PN-PL-4包含了2種遺傳背景（圖3c）。

3 討論

種質(zhì)資源是培育優(yōu)良品種的基礎(chǔ)，不同居群遺傳結(jié)構(gòu)分析對(duì)培育新品種和種質(zhì)資源收集、評(píng)價(jià)與利用具有重要的意義。本文對(duì)25 份文山三七樣本和3 份近緣種進(jìn)行GBS 測(cè)序，共獲得115.64 Gb 數(shù)據(jù)，1 968 786 個(gè)SNP 位點(diǎn)，其中5.30%（109 188）位于外顯子區(qū)域。外顯子作為真核生物基因的一部分，包含著合成蛋白質(zhì)所需要的核心信息并可在蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程中被表達(dá)［11］。因此外顯子上的SNP 可應(yīng)用于功能基因標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，表明本研究中外顯子上的109 188 個(gè)SNP 具有開(kāi)發(fā)成功能標(biāo)記的潛力。此外SNP 功能分布中，終止子獲得是指堿基突變導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)，產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)從而使基因喪失原本的功能，并進(jìn)一步引發(fā)植物表型變異［11］。大豆中GmSG基因發(fā)生 A->G 轉(zhuǎn)換導(dǎo)致翻譯提前終止，使大豆種皮顏色由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色［12］。水稻中OsCUL3a 蛋白翻譯提前終止導(dǎo)致水稻flg 22、幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的活性氧和相關(guān)發(fā)病基因表達(dá)量顯著增加，進(jìn)而產(chǎn)生類病斑［13］。因此終止子獲得對(duì)基因功能研究具有重要意義，本試驗(yàn)中終止子獲得有2 548 個(gè)，約占2.333%，僅次于非同義突變，（54.979%）和同義突變（40.429%）排名第3，此結(jié)果將為后續(xù)三七生長(zhǎng)特性、生物抗性及皂苷合成等基因功能研究提供新的見(jiàn)解。

本研究中根據(jù)NJ進(jìn)化樹(shù)顯示，三七不同居群間遺傳分化水平較低、距離較近；另外三七近緣種與三七遺傳距離較遠(yuǎn)，尤其是屏邊三七與三七遺傳距離最遠(yuǎn)，這與張金渝等［4］通過(guò)SSR標(biāo)記分析比較8個(gè)文山三七及近緣種居群遺傳結(jié)構(gòu)結(jié)果一致。遺傳結(jié)構(gòu)分析中當(dāng)K= 2時(shí)除個(gè)別材料外，三七居群間均僅包含1 種遺傳背景，暗示不同地區(qū)間遺傳差異不明顯，種源間交流頻繁、基因遺傳一致度較高，難以形成遺傳分化較大的品種和居群。試驗(yàn)通過(guò)雜合率分析可知，三七雜合率較高，其范圍在5.6% ~12.9%，平均值為10.02%，而在近緣種中屏邊三七是1.3%、姜狀三七6.2%、狹葉竹節(jié)參5.1%，其雜合度明顯低于三七，說(shuō)明三七遺傳多樣性和遺傳變異豐富。Fan 等［14］揭示了三七群體間存在頻繁基因流動(dòng)，其原因可能是由于三七植株生長(zhǎng)過(guò)程中為了適應(yīng)復(fù)雜的地理氣候環(huán)境，形成了豐富多樣的生態(tài)類型，同時(shí)受三七連作障礙的影響頻繁更換種植區(qū)域，造成居群間基因頻繁交流，故增加了居群內(nèi)基因的雜合度，增加了基因交換、重組的幾率，從而使三七居群間的遺傳背景高度一致，群體遺傳差異較小。這意味著文山不同地區(qū)間群體混雜，整體遺傳背景差異較小，雜合度較高難以以此為基礎(chǔ)進(jìn)行雜交育種。雜交育種是將兩個(gè)或多個(gè)性狀優(yōu)良的品種通過(guò)雜交選育的方法，快速將多個(gè)優(yōu)良性狀集合到單一的品種上從而提高品種利用性。但應(yīng)注意親本間的遺傳差異，選用生態(tài)類型差異較大、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)、基因純合的親本材料相互雜交［15］。因此今后的育種工作中，通過(guò)分子標(biāo)記準(zhǔn)確篩選鑒定優(yōu)異單株并開(kāi)展定向培育（如抗病、高產(chǎn)等）是開(kāi)展三七育種的有效途徑［16］。同時(shí)應(yīng)著重對(duì)三七居群個(gè)體間具有優(yōu)良性狀的變異個(gè)體（抗病、優(yōu)質(zhì)）進(jìn)行種質(zhì)資源的收集、篩選、評(píng)價(jià)和保存。利用三七的高多態(tài)性加速三七重要功能基因的標(biāo)記、利用，針對(duì)特定性狀進(jìn)行小孢子單倍體育種快速培育是未來(lái)三七新品培育的重要研究?jī)?nèi)容之一。

4 結(jié) 論

綜上，本文運(yùn)用SNP 標(biāo)記對(duì)不同居群文山三七及其近緣種遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)文山三七及其近緣種遺傳距離較遠(yuǎn)，尤其是屏邊三七與文山三七遺傳距離最遠(yuǎn)。不同地區(qū)三七居群間遺傳背景差異不顯著，遺傳分化程度較低，但個(gè)體間多樣性、雜合度較高。此外試驗(yàn)獲得1 968 786 個(gè)SNP 位點(diǎn)，其中5.30%（109 188）位于外顯子區(qū)域，另外終止子獲得有2 548 個(gè)約占2.333%。這些結(jié)果進(jìn)一步豐富了三七分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)數(shù)量，為后續(xù)重要基因功能的標(biāo)記和研究如生物抗性及皂苷合成等提供了巨大研究潛力，同時(shí)也為三七的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、資源保護(hù)、遺傳圖譜構(gòu)建、生物育種等研究提供科學(xué)參考。