佐明興，閆 瑞，封子旋，高 婷，鄭玉成，侯炳豪，葉乃興，陳倩潔，毛宇源,*，高水練,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 泉州 362406）

烏龍茶屬半發(fā)酵茶，主產(chǎn)于我國(guó)閩南、閩北、廣東及臺(tái)灣等地[1]。其中鐵觀(guān)音是閩南烏龍茶的典型代表，其制成的成品茶滋味醇厚回甘，香氣馥郁悠長(zhǎng)，具有獨(dú)特的“蘭花香、觀(guān)音韻”[2]。

烏龍茶品質(zhì)特征主要受品種、產(chǎn)地以及加工工藝的影響，其中加工工藝尤為重要[3-4]。包揉是閩南烏龍茶加工的特殊工藝，包揉過(guò)程中伴隨著反復(fù)揉搓擠壓的機(jī)械力，發(fā)生熱化學(xué)反應(yīng)和濕熱作用等促進(jìn)非揮發(fā)性與揮發(fā)性代謝物轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響茶葉的色、香、味[5-7]。郭玉瓊等[8]研究表明，包揉使茶葉細(xì)胞破碎，茶汁擠出，增加了茶葉耐泡度，由于濕熱作用，各活性物質(zhì)間的非酶促反應(yīng)增加，參與香氣形成的游離氨基酸含量減少；劉偉等[9]研究發(fā)現(xiàn)包揉工藝毛茶中具有較多醇類(lèi)，呈花果香和清甜香的橙花基丙酮和己酸-3-己烯酯相對(duì)含量高于壓揉毛茶；郝志龍等[10]研究表明采用“全速包”造型工藝的茶葉容重、葉溫、含水率、黃酮總量和游離氨基酸含量顯著低于“速包＋平板”造型工藝；張妍等[11]基于力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)搓揉力與壓力和純壓力兩種模型的茶葉生化成分含量在加工過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，其中搓揉力與壓力模型的成品茶香氣成分如羅勒烯和芳樟醇相對(duì)含量較高，感官品質(zhì)表現(xiàn)優(yōu)于純壓力模型。近年來(lái)，代謝組學(xué)技術(shù)研究廣泛涉及烏龍茶加工和成品茶精制等方面，更深層次地分析了烏龍茶萎凋[12-13]和做青[14-16]等加工過(guò)程中關(guān)鍵差異代謝物變化規(guī)律及代謝途徑[17-18]。

然而，關(guān)于對(duì)烏龍茶包揉工藝的研究更多關(guān)注于包揉對(duì)感官品質(zhì)的影響或常規(guī)的生化檢測(cè)，但對(duì)包揉過(guò)程中不同階段茶葉非揮發(fā)性與揮發(fā)性次生代謝物的研究鮮有報(bào)道。本研究以鐵觀(guān)音為研究對(duì)象，利用廣泛靶向代謝組學(xué)及揮發(fā)性代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)鐵觀(guān)音包揉過(guò)程中的揮發(fā)性與非揮發(fā)性代謝物進(jìn)行探究，并分析差異代謝物及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以期為閩南烏龍茶在包揉過(guò)程中的品質(zhì)形成機(jī)制提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮葉于2021年4月26日采自福建省安溪縣龍涓鄉(xiāng)舉源村舉源茶葉合作社（24°59’N；117°47’E），采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽三四葉，品種為鐵觀(guān)音。

甲醇、乙腈（均為色譜純）默克化工技術(shù)（上海）有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）云南西力生物技術(shù)股份有限公司、美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5424R 2 Eppendorf離心機(jī) 艾本德中國(guó)有限公司；MM 400研磨機(jī) 德國(guó)Retsch公司；Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A超高效液相色譜儀 日本島津公司；Applied Biosystems 6500QTRAP三重四極桿質(zhì)譜儀美國(guó)賽默飛世爾科技公司；SB-C18色譜柱 美國(guó)安捷倫公司；6CYQT-90 型搖青機(jī)、6CWS-110型滾筒式液化氣殺青機(jī)、6CR-55型茶葉揉捻機(jī)、ML-6CSBG-19型速包機(jī)、6CW-60型解塊篩末機(jī)、6CWB-80型平板包揉機(jī)、6CH-54型電熱烘干箱 福建省安溪長(zhǎng)安茶葉機(jī)械廠(chǎng)。

1.3 方法

1.3.1 茶樣制備

參照Z(yǔ)heng Yucheng等[19]的閩南烏龍茶加工工藝參數(shù)進(jìn)行加工：鮮葉→萎凋→做青→殺青→揉捻→包揉（初包揉→復(fù)包揉→再包揉）→烘干→毛茶。鐵觀(guān)音鮮葉經(jīng)統(tǒng)一萎凋、做青、殺青、揉捻而成的揉捻葉（RN）作為處理茶樣。

1.3.1.1 鮮葉采摘與萎凋

選用安溪縣國(guó)家級(jí)茶樹(shù)良種鐵觀(guān)音鮮葉為實(shí)驗(yàn)材料，采摘標(biāo)準(zhǔn)小開(kāi)面一芽三四葉，按照閩南烏龍茶加工工藝進(jìn)行室外萎凋，曬青18 min至頂葉微軟下垂，室內(nèi)萎凋90 min。

1.3.1.2 做青（搖青-晾青3 次）

搖青機(jī)每桶投葉量25 kg，調(diào)速25 r/min，第1次搖3 min，主要促進(jìn)晾青葉“還陽(yáng)”，為搖青走水做準(zhǔn)備，晾青90 min，葉色暗綠轉(zhuǎn)淡，青氣退，略帶青香進(jìn)行下一次搖青。第2次搖5 min，搖青程度略重于第1次，以損傷葉緣細(xì)胞，促進(jìn)“走水”，晾青180 min，微有紅邊，待青氣退，略有香氣進(jìn)行下一次搖青。第3次搖18 min，做青葉發(fā)酵充分，葉片部分呈現(xiàn)“三紅七綠”狀態(tài)，晾青8 h，青氣退，花香顯。

1.3.1.3 殺青

炒青溫度270 ℃，炒青時(shí)間4 min，炒青適度時(shí)，葉色轉(zhuǎn)暗，手握茶青葉略有黏稠感。

1.3.1.4 揉捻

將殺青葉放入揉捻機(jī)趁熱揉4 min，條索初步形成，茶汁擠出。

1.3.1.5 包揉

采用速包機(jī)將揉捻葉（R N）包成球狀，用時(shí)60 s/次，之后于平板包揉機(jī)壓揉3 min，然后松包散熱解塊，速包、平揉、解塊反復(fù)3 次，形成初包揉葉（CQ），隨后利用烘干機(jī)進(jìn)行初烘，初烘溫度170 ℃、時(shí)間3 min，速包、平揉、解塊反復(fù)3 次后，形成復(fù)包揉葉（BY），接著置于烘干機(jī)復(fù)烘，復(fù)烘溫度80 ℃、時(shí)間8 min，然后進(jìn)行再包揉，即速包、平揉、解塊反復(fù)3 次，形成再包揉葉（BL）。

分別對(duì)加工過(guò)程中RN、CQ、BY、BL進(jìn)行取樣（圖1），每個(gè)樣品200 g，設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，液氮固樣后放置―80 ℃冰箱中保存待測(cè)。

圖1 不同包揉階段的茶葉樣品Fig.1 Tea samples at different wrapping-twisting stages

1.3.1.6 干燥

烘干機(jī)溫度80 ℃烘至茶梗易折斷，烘干毛茶攤晾后裝袋置于低溫避光環(huán)境下儲(chǔ)藏。

1.3.2 鐵觀(guān)音包揉過(guò)程中非揮發(fā)性代謝物分析

1.3.2.1 樣品前處理

對(duì)鐵觀(guān)音加工過(guò)程中的4 個(gè)樣品進(jìn)行真空冷凍干燥并磨至粉末狀；稱(chēng)取100 mg的樣本粉末，溶解于1.2 mL 70%甲醇溶液中并置于4 ℃冰箱過(guò)夜；離心（12 000 r/min、10min）吸取上清液后過(guò)濾樣品，并保存到進(jìn)樣瓶中，用于超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析。

1.3.2.2 UPLC-MS/MS分析

UPLC條件：色譜柱為Agilent SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A為超純水（加入0.1%甲酸），流動(dòng)相B為乙腈（加入0.1%甲酸）；洗脫梯度：0.00 min，95% A、5% B；0.00～9.00 min，95%～5% A、5%～95% B；9.00～10.00 min，5% A、95% B；10.00～11.10 min，5%～95% A、95%～5% B；11.10～14 min，95% A、5% B；流速為0.35 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為4 μL。

MS 條件：線(xiàn)性離子阱和三重四極桿（triple quadrupole，QQQ）掃描是在三重四極桿線(xiàn)性離子阱質(zhì)譜儀（Q TRAP），AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系統(tǒng)上獲得的，渦輪噴霧離子源；離子源溫度550 ℃；離子噴霧電壓5 500 V（正離子模式）/―4 500 V（負(fù)離子模式）；離子源氣體I（GSI）、氣體II（GSII）和氣簾氣分別設(shè)置為50、60 psi和25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。在QQQ和線(xiàn)性離子阱模式下分別用10 μmol/L與100 μmol/L的聚丙二醇溶液進(jìn)行儀器調(diào)諧和質(zhì)量校準(zhǔn)。QQQ掃描用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，并將碰撞氣體（氮?dú)猓┰O(shè)置為中等。

質(zhì)控樣本：質(zhì)控（quality control，QC）樣本由4 組樣本的提取物等量混合制備而成，并采用與分析樣本相同的方法處理和檢測(cè)，重復(fù)3 次。在儀器檢測(cè)的過(guò)程中，每10 個(gè)檢測(cè)分析樣本中插入1 個(gè)QC樣本，以達(dá)到監(jiān)測(cè)整個(gè)分析過(guò)程的重復(fù)性。

1.3.3 鐵觀(guān)音包揉過(guò)程中揮發(fā)性代謝物分析

1.3.3.1 樣品前處理

從―80 ℃冰箱取出鐵觀(guān)音樣品進(jìn)行液氮研磨后，渦旋混合均勻，稱(chēng)取大約1.00 g樣品，加入到含有10 μL（50 μg/mL）正丁醇內(nèi)標(biāo)溶液和飽和氯化鈉溶液的15 mL頂空瓶中，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)。頂空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）條件：頂空瓶于100 ℃的恒溫條件下振蕩5 min后，120 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入樣品頂空瓶，頂空萃取15 min，于250 ℃解吸5 min，然后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分離鑒定。萃取頭在Fiber Conditioning Station中的250 ℃溫度條件老化5 min。新萃取頭在萃取前在Fiber Conditioning Station中老化2 h。

1.3.3.2 GC-MS采集條件

GC條件：DB-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm，Agilent J&W Scientific,Folsom,CA,USA），載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），恒流流速1.2 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣，溶劑延遲3.5 min。程序升溫：40 ℃保持3.5 min，以10 ℃/min升至100 ℃，再以7 ℃/min升至180 ℃，最后以25 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

MS條件：電子電離源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度280 ℃，電子能量70 eV，掃描方式為全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z50～500。

1.3.4 氣味活度值（odor activity value，OAV）分析

參照Guo Xiangyang等[20]方法進(jìn)行OAV計(jì)算。

式中：Ci為每種揮發(fā)性化合物含量/（μg/kg）；Ti為香氣閾值/（μg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

參照Wang Pengjie等[4]的方法，基于碎片模式，保留時(shí)間、m/z與武漢邁特維爾生物科技有限公司自建MWDB V2.0數(shù)據(jù)庫(kù)及公共數(shù)據(jù)庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)非揮發(fā)性代謝物進(jìn)行定性，代謝物定量利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式分析。獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜后，對(duì)物質(zhì)質(zhì)譜峰的峰面積進(jìn)行積分，同時(shí)對(duì)不同樣品中同一代謝物的質(zhì)譜峰進(jìn)行積分校正，利用軟件Analvst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)；非揮發(fā)性代謝物每個(gè)色譜峰的峰面積表示相應(yīng)物質(zhì)的相對(duì)含量。

參照邵淑賢等[21]的方法，基于MWGC數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)揮發(fā)性代謝物進(jìn)行質(zhì)譜定性，篩選保留質(zhì)譜匹配度＞80%的揮發(fā)性代謝物，定量通過(guò)與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比較，得到香氣成分的含量，即：揮發(fā)性成分的含量/（μg/kg）＝（香氣成分物質(zhì)峰面積×內(nèi)標(biāo)物含量）/內(nèi)標(biāo)物峰面積。基于邁維云平臺(tái)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類(lèi)分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），并結(jié)合變量投影重要性（variables important in the projection，VIP）值＞1.0，差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）≥1.2或FC≤0.83且P＜0.05篩選非揮發(fā)性差異代謝物[22]。使用Office Excel 2019軟件制作餅圖，使用Graphpad Prism 8.0.2軟件制作柱狀圖，使用SPSS 26.0進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵觀(guān)音包揉過(guò)程中非揮發(fā)性代謝物組成分析

如圖2A所示，共鑒定出12 類(lèi)973 種非揮發(fā)性代謝物，包括類(lèi)黃酮241 種、酚酸167 種、脂質(zhì)138 種、有機(jī)酸69 種、氨基酸及其衍生物70 種、生物堿69 種、核苷酸及其衍生物55 種、木脂素和香豆素36 種、鞣質(zhì)29 種、萜類(lèi)10 種、糖及醇類(lèi)54 種和其他類(lèi)35 種。

圖2 鐵觀(guān)音包揉過(guò)程中非揮發(fā)性代謝物分析Fig.2 Analysis of non-volatile metabolites in Tieguanyin oolong tea during wrapping-twisting

由圖2B可知，PC1和PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為23.51%和28.54%，可解釋各非揮發(fā)性代謝物52.05%的總變異。從圖2B可以看出，除RN與CQ分布距離較近外，在包揉加工過(guò)程中BY和BL均能較好地區(qū)分開(kāi)來(lái)，說(shuō)明包揉過(guò)程中的代謝物含量及組成主要在BY和BL兩個(gè)階段變化明顯。PCA結(jié)果基本能夠反映出包揉過(guò)程中4 組樣品之間的代謝物差異。隨后對(duì)各樣本代謝物的相對(duì)含量進(jìn)行HCA，發(fā)現(xiàn)聚類(lèi)熱圖中不同包揉階段樣本的非揮發(fā)性代謝物存在明顯差異（圖2C），這與PCA的結(jié)果一致。

為了解包揉過(guò)程中非揮發(fā)性代謝物整體的變化規(guī)律，對(duì)其相對(duì)含量進(jìn)行聚類(lèi)（圖2D），12 類(lèi)非揮發(fā)性代謝物總量呈現(xiàn)如下變化趨勢(shì)：RN＞CQ＞BY＞BL。與RN相比，包揉過(guò)程中非揮發(fā)性代謝物在BL階段變化明顯，類(lèi)黃酮、氨基酸及其衍生物、糖及醇類(lèi)含量下降，而木脂素類(lèi)和香豆素類(lèi)、生物堿類(lèi)、酚酸類(lèi)、核苷酸及其衍生物、有機(jī)酸類(lèi)、脂質(zhì)含量上升。

2.2 鐵觀(guān)音包揉過(guò)程中非揮發(fā)性差異代謝物篩選

為進(jìn)一步了解包揉工藝對(duì)非揮發(fā)性代謝物的影響，對(duì)不同包揉階段的差異代謝物進(jìn)行篩選。如圖3A所示，在RN vs CQ、CQ vs BY和BY vs BL的3 個(gè)比較組中分別篩選出差異代謝物201 種（105 種上調(diào)，96 種下調(diào)）、269 種（116 種上調(diào)，153 種下調(diào)）和258 種（154 種上調(diào)，104 種下調(diào)）。不同包揉階段的差異代謝物種類(lèi)存在差別，且上下調(diào)數(shù)量不同，隨著包揉加工的進(jìn)行，類(lèi)黃酮、糖及醇類(lèi)主要呈下調(diào)趨勢(shì)，脂質(zhì)呈上調(diào)趨勢(shì)（圖3B）。另外，在包揉過(guò)程中有差異代謝物46 種，包括草酸、丙二酸、沒(méi)食子兒茶素、香草酸乙酯、山柰酚-3-O-(2”-沒(méi)食子酰)葡萄糖苷、槲皮素-3-O-(6”-O-沒(méi)食子酰)半乳糖苷和茶黃素-3-沒(méi)食子酸酯等（圖3C）。

圖3 鐵觀(guān)音包揉階段非揮發(fā)性差異代謝物的篩選Fig.3 Screening of differential non-volatile metabolites in Tieguanyin oolong tea during wrapping-rolling stages

2.3 鐵觀(guān)音包揉過(guò)程中非揮發(fā)性差異代謝物變化規(guī)律

在3 個(gè)比較組中共鑒定出差異代謝物468 種，包括黃酮107 種、酚酸80 種、脂質(zhì)72 種、生物堿33 種、氨基酸及其衍生物31 種、核苷酸及其衍生物30 種、有機(jī)酸26 種、糖及醇類(lèi)24 種、鞣質(zhì)20 種、木脂素和香豆素18 種、萜類(lèi)3 種和其他類(lèi)24 種。為研究不同樣品組間差異代謝物的變化趨勢(shì)，將全部差異代謝物的相對(duì)含量進(jìn)行Z-score標(biāo)準(zhǔn)化，隨后進(jìn)行K均值（K-Means）HCA（圖4），結(jié)果顯示，包揉過(guò)程中的差異代謝物主要分為8 種變化趨勢(shì)，其中趨勢(shì)3和6中的114 個(gè)差異代謝物在包揉過(guò)程中總體呈上調(diào)模式；趨勢(shì)1和5中的113 個(gè)差異代謝物在包揉過(guò)程中總體呈下調(diào)模式；趨勢(shì)7中的差異代謝物主要在BL階段下調(diào)，且最終含量低于RN。

圖4 所有差異代謝物的K均值HCA圖Fig.4 K-means cluster analysis of all differential metabolites

包揉過(guò)程中，各活性物質(zhì)間的相互協(xié)調(diào)對(duì)鐵觀(guān)音特征風(fēng)味品質(zhì)的形成起到重要作用。為進(jìn)一步分析包揉過(guò)程中的非揮發(fā)性特征差異代謝物，本研究將上述5 種存在明顯變化趨勢(shì)的代謝物進(jìn)行可視化，并對(duì)其進(jìn)一步討論。

2.3.1 鐵觀(guān)音包揉過(guò)程中呈下降趨勢(shì)的非揮發(fā)性特征差異代謝物分析

類(lèi)黃酮為茶葉中的關(guān)鍵次生代謝產(chǎn)物，與烏龍茶滋味的形成密切相關(guān)，是苦澀味形成的主要原因[23]。由圖5可知，類(lèi)黃酮在包揉過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，主要在BY和BL階段變化顯著，這與張妍等[11]研究結(jié)果一致。在茶葉中，黃酮醇糖苷類(lèi)主要以O(shè)-糖苷的形式存在，在苷元的C-3位具有糖苷部分（如槲皮素、山柰酚和楊梅素），其含量越低，則茶湯滋味愈加醇和，反之則苦澀[24]。本研究中，山柰酚-3-O-阿拉伯糖苷、山柰酚-3-O-(6”-丙二酰)半乳糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖鼠李糖苷等黃酮醇糖苷類(lèi)在包揉過(guò)程中呈下降趨勢(shì)；此外，沒(méi)食子兒茶素、芹菜素-8-C-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-新橙皮糖苷等呈先上升后下降趨勢(shì)。研究表明，山柰酚-3-O-葡萄糖苷和山柰酚-3-O-半乳糖苷為茶葉澀味成分且閾值極低，對(duì)影響茶湯口感有重要作用[25]；黃酮類(lèi)受到高溫、氧化、物理機(jī)械等作用而發(fā)生反應(yīng)，兒茶素和黃酮醇苷的含量降低，使茶湯愈加醇和[26]。本研究中大多數(shù)黃酮醇糖苷類(lèi)化合物含量下降，可能是包揉過(guò)程中的高溫濕熱作用和高強(qiáng)度的揉搓擠壓力促進(jìn)其發(fā)生非酶促氧化、熱解和聚合轉(zhuǎn)化等反應(yīng)，苷類(lèi)配基脫去，轉(zhuǎn)化為黃酮或黃酮醇，有助于減輕茶湯苦澀感。此外，異阿魏酸和咖啡酸在包揉結(jié)束后含量達(dá)到最低值，茶葉中的咖啡酸含量越高其茶湯苦味和澀味越明顯[27]，因此包揉過(guò)程中其茶葉苦澀味降低還可能與酚酸類(lèi)含量降低有關(guān)。

隨著包揉加工的進(jìn)行，氨基酸及其衍生物（L-谷氨酸）和糖及醇類(lèi)（如D-蔗糖、D-潘糖、D-麥芽四糖、蔗果四糖等）呈持續(xù)下降趨勢(shì)，L-亮氨酸、L-酪氨酸和水蘇糖則呈先上升后下降趨勢(shì)。谷氨酸與茶湯鮮味呈正相關(guān)，茶湯的甜味強(qiáng)度和糖類(lèi)物質(zhì)、甜味氨基酸呈顯著正相關(guān)[28-29]；因此包揉過(guò)程中氨基酸及其衍生物和糖及醇類(lèi)含量的下降可能影響茶湯滋味的鮮爽度和甜度。包揉加工的過(guò)程中茶葉伴隨著兩次高溫烘焙，茶葉在高溫作用下易發(fā)生Strecker降解和美拉德反應(yīng)使糖及氨基酸轉(zhuǎn)化為香氣等物質(zhì)[30]，氨基酸及糖類(lèi)物質(zhì)含量下降可能與包揉過(guò)程高溫烘焙轉(zhuǎn)化為香氣等物質(zhì)有關(guān)。

2.3.2 鐵觀(guān)音包揉過(guò)程呈上升趨勢(shì)非揮發(fā)性特征差異代謝物分析

由圖6可知，槲皮素-7-O-葡萄糖苷和山柰酚在包揉過(guò)程中含量增加，隨著包揉加工的進(jìn)行山柰酚含量增加，而山柰酚糖苷類(lèi)化合物含量下降，這也進(jìn)一步證實(shí)了包揉過(guò)程中存在黃酮醇糖苷類(lèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。茶葉中的酚酸按其結(jié)構(gòu)性質(zhì)可分為苯甲酸和羥基肉桂酸的衍生物，對(duì)茶湯滋味和香氣均存在影響[27]；包揉過(guò)程中的香草酸甲酯和4-O-咖啡?？鼘幩岷吭黾印Ｏ悴菟峒柞ナ瞧咸丫浦袑?duì)其香氣貢獻(xiàn)度較大的揮發(fā)性香味成分[31]，可能對(duì)鐵觀(guān)音的特征風(fēng)味品質(zhì)形成具有貢獻(xiàn)，而4-O-咖啡酰奎寧酸是咖啡酸的衍生物，包揉過(guò)程中咖啡酸含量下降伴隨著4-O-咖啡?？鼘幩岷康脑黾?，說(shuō)明包揉過(guò)程中的差異代謝物處于動(dòng)態(tài)變化，有利于改善鐵觀(guān)音的滋味。

圖6 包揉過(guò)程中呈上升趨勢(shì)的特征差異代謝物熱圖Fig.6 Heatmaps of characteristic differential metabolites showing an upward trend during the wrapping-rolling process

脂質(zhì)是一種重要的生物活性物質(zhì)，其獨(dú)特而豐富的風(fēng)味和香氣是高品質(zhì)烏龍茶不可或缺的[32]。隨著包揉加工的進(jìn)行，游離脂肪酸（棕櫚油酸、亞麻酸甲酯、11-十八碳烯酸和月桂酸）、甘油酯（2-α-亞麻酸甘油酯和1-α-亞麻酸甘油酯）、溶血磷脂酰乙醇胺18:0、溶血磷脂酰膽堿20:1等主要呈上升趨勢(shì)。棕櫚油酸是脂肪酸揮發(fā)物前體物質(zhì)，易轉(zhuǎn)化為庚醛、壬醛和庚醇[33]。磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺在加熱條件下還可誘導(dǎo)脂質(zhì)降解，形成羰基代謝物[34]。

包揉過(guò)程中的茶葉發(fā)生葉組織晶格位移、組織細(xì)胞排列不整齊的現(xiàn)象，茶汁外溢，受到力和高溫濕熱共同作用[11]。本研究中，包揉葉在CQ階段主要以機(jī)械產(chǎn)生的揉搓擠壓力為主，在BY和BL階段的茶葉樣品同時(shí)受高溫烘焙和機(jī)械作用力影響，因此脂質(zhì)類(lèi)化合物相較于RN變化顯著。高溫改變?nèi)~綠體中類(lèi)囊體的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，導(dǎo)致磷脂酰乙醇胺的含量降低，而甘油酯（甘油三酯和甘油二酯）含量增加[35]。游離脂肪酸、甘油酯和溶血磷脂類(lèi)化合物含量增加可能與包揉過(guò)程中的高溫烘焙和機(jī)械力作用有關(guān)。Guo Li等[36]研究表明鐵觀(guān)音的脂肪酸含量在造型階段增加，而在干燥過(guò)程中顯著下降。Feng Zhihui等[37]研究認(rèn)為茶葉加工過(guò)程中部分脂肪酸易轉(zhuǎn)化為脂肪酸揮發(fā)物，在后期干燥過(guò)程轉(zhuǎn)化為醇、酯、醛和酮等。由此可知，鐵觀(guān)音包揉過(guò)程中的脂質(zhì)類(lèi)化合物含量增加還可為后期干燥過(guò)程中脂肪酸類(lèi)揮發(fā)性成分的轉(zhuǎn)化提供有利條件。

2.4 鐵觀(guān)音包揉過(guò)程中揮發(fā)性代謝物組成分析

對(duì)鐵觀(guān)音不同包揉階段的4 個(gè)加工樣品進(jìn)行揮發(fā)性代謝組學(xué)研究，如表1所示，共篩選鑒定出47 種揮發(fā)性成分，包括酯類(lèi)20 種、萜烯類(lèi)13 種、醇類(lèi)7 種、酮類(lèi)2 種、醛類(lèi)2 種和其他類(lèi)3 種?；?7 種揮發(fā)性成分的峰面積進(jìn)行PCA，如圖7A所示，PC1和PC2分別為74.67%和13.31%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為87.98%，圖中4 個(gè)樣品組間有較好地區(qū)分，說(shuō)明在包揉過(guò)程中其代謝物含量與組成發(fā)生明顯變化。PCA結(jié)果能夠較好反映出包揉過(guò)程中4 組樣品之間的揮發(fā)性代謝物差異。隨后進(jìn)行HCA，圖7B中的各樣本組內(nèi)重復(fù)性好，組間有較好地區(qū)分，說(shuō)明在不同包揉階段的香氣特征差異明顯，這與PCA結(jié)果一致。

表1 包揉過(guò)程中的揮發(fā)性成分及含量Table 1 Contents of volatile components during wrapping-twisting process

烏龍茶包揉過(guò)程中其香氣特征主要受萜烯類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)和酮類(lèi)等香氣組分含量的影響[11]，不同包揉階段的各揮發(fā)性組分種類(lèi)相同，其含量為萜烯類(lèi)＞醇類(lèi)＞酯類(lèi)＞其他類(lèi)＞酮類(lèi)＞醛類(lèi)，且隨著包揉加工的進(jìn)行，各組分相對(duì)含量總體呈下降趨勢(shì)（圖7C）。

通過(guò)對(duì)表1中各揮發(fā)性成分分析發(fā)現(xiàn)，隨著包揉加工的進(jìn)行，具有脂肪香或青草味等不愉悅氣味的β-紅沒(méi)藥烯、庚醛、(E)-2-己烯基己酸酯和順-3-己烯基異丁酸酯等含量呈下降趨勢(shì)。具有花香、果香或奶香的揮發(fā)性成分含量則呈兩種變化趨勢(shì)。

研究表明，包揉成品茶中醇類(lèi)化合物含量較高[9]，包揉過(guò)后，茶葉香氣的總量下降，芳樟醇及其氧化物、順式茉莉酮和α-法尼烯等相對(duì)含量減少[41]，這與本研究結(jié)果一致。烏龍茶在生產(chǎn)過(guò)程中由多重壓力導(dǎo)致特征香氣形成，包揉過(guò)程中的機(jī)械力作用促使細(xì)胞破碎，在濕熱作用下促使葉綠素降解，兒茶素自動(dòng)氧化等，影響茶葉香氣[10,42]，其中烘焙處理會(huì)導(dǎo)致鐵觀(guān)音香氣組分發(fā)生明顯變化[42]。大多數(shù)揮發(fā)性成分含量在包揉過(guò)程中下降，可能是包揉產(chǎn)生高強(qiáng)度的機(jī)械力作用使細(xì)胞破碎，茶汁擠出，同時(shí)兩次高溫烘焙處理增加了葉表溫度，包揉過(guò)程中的物質(zhì)間相互接觸，濕熱和非酶性氧化等作用促使揮發(fā)性代謝物發(fā)生熱降解、熱聚合等反應(yīng)，導(dǎo)致其含量降低。由此可知，在包揉過(guò)程中的機(jī)械力作用和烘焙處理可能是影響茶葉揮發(fā)性成分含量變化的重要因素。α-法尼烯、芳樟醇、茉莉內(nèi)酯和順式茉莉酮等是組成烏龍茶的特征香氣成分，在加工過(guò)程中其含量下降，但仍對(duì)烏龍茶具有重要貢獻(xiàn)[44]。因此本研究中大多數(shù)花香類(lèi)化合物相對(duì)含量的下降并不能代表對(duì)鐵觀(guān)音總體香氣特征的貢獻(xiàn)度，本實(shí)驗(yàn)將結(jié)合香氣閾值對(duì)其進(jìn)一步探討。

2.5 鐵觀(guān)音包揉過(guò)程中的特征香氣分析

OAV是結(jié)合揮發(fā)性化合物的濃度和香氣閾值來(lái)評(píng)價(jià)各揮發(fā)性成分對(duì)其樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)大小的一種方法，OAV＞1被認(rèn)為對(duì)茶葉的整體香氣特征具有貢獻(xiàn)，其OAV＞10則貢獻(xiàn)顯著[20]。如表2所示，共篩選鑒定出14 種OAV＞1的香氣成分，包括苯甲酸己酯、水楊酸甲酯、茉莉酸甲酯、茉莉內(nèi)酯、羅勒烯、(E)-β-羅勒烯、α-法尼烯、月桂烯、芳樟醇氧化物II、芳樟醇氧化物I、芳樟醇、順式茉莉酮、香葉基丙酮和庚醛。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)有6 種OAV＞10的揮發(fā)性成分，其中OAV＞100的為芳樟醇，10＜OAV≤100的為α-法尼烯、順式茉莉酮、茉莉酸甲酯、茉莉內(nèi)酯和羅勒烯。

表2 包揉過(guò)程中揮發(fā)性成分的OAVTable 2 OAV of volatile components during wrapping-twisting process

Zheng Yucheng等[19]研究表明具有花香的芳樟醇（OAV＝50.6）是鐵觀(guān)音的特征香氣成分，在加工過(guò)程中呈現(xiàn)較高的OAV。Feng Zhihui等[46]研究表明茉莉酸甲酯（OAV＝15）是安溪鐵觀(guān)音中似蘭花香的主要香氣成分之一，其氣味強(qiáng)度與茶葉中茉莉酸甲酯的濃度直接相關(guān)。茉莉內(nèi)酯有助于鐵觀(guān)音茶湯呈現(xiàn)奶香和甜美花香[47]。榮波等[48]研究發(fā)現(xiàn)茉莉內(nèi)酯和順式茉莉酮是鐵觀(guān)音的關(guān)鍵香氣成分，其中具有花香和甜香的順式茉莉酮OAV＞10?？梢园l(fā)現(xiàn)，在14 種OAV＞1的揮發(fā)性成分中，除具有青草味的庚醛和冬青油香的水楊酸甲酯外，其他12 種揮發(fā)性成分可能對(duì)不同包揉階段的鐵觀(guān)音呈花香、果香和奶香的特征具有貢獻(xiàn)，以芳樟醇、α-法尼烯、順式茉莉酮、茉莉酸甲酯、茉莉內(nèi)酯和羅勒烯對(duì)不同包揉階段的鐵觀(guān)音具有濃郁的花香、果香和奶香特征的貢獻(xiàn)顯著。值得注意的是，包揉使一些具有脂肪香、青草味和花香、果香化合物含量下降的同時(shí)改變了香氣成分的組成，部分具有不良風(fēng)味的揮發(fā)性成分散失，促使花香更顯露，起到純化香氣的作用，盡管鐵觀(guān)音中的關(guān)鍵呈香成分的含量在包揉過(guò)程中主要呈下降趨勢(shì)（表1），包揉結(jié)束后其OAV仍然大于1，其對(duì)鐵觀(guān)音在包揉過(guò)程中形成的特征風(fēng)味仍具有貢獻(xiàn)。

3 結(jié)論

采用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)和HS-SPME-GC-MS技術(shù)檢測(cè)鐵觀(guān)音包揉過(guò)程中非揮發(fā)性及揮發(fā)性代謝物。非揮發(fā)性代謝組學(xué)分析表明：在不同包揉階段共鑒定出12 類(lèi)973 種非揮發(fā)性代謝物，隨著包揉加工的進(jìn)行，類(lèi)黃酮、氨基酸及其衍生物、糖及醇類(lèi)呈下降趨勢(shì)，脂質(zhì)類(lèi)代謝物呈上升趨勢(shì)，其中具有明顯苦澀味的山柰酚-3-O-葡萄糖苷和咖啡酸在包揉結(jié)束后含量下降，有助于減輕茶湯苦澀，使滋味更醇和，棕櫚油酸、1-α-亞麻酸甘油酯含量增加可為后期干燥過(guò)程中特征香氣成分的轉(zhuǎn)化提供有利條件。揮發(fā)性代謝組學(xué)分析表明：不同包揉階段共鑒定出6 類(lèi)47 種揮發(fā)性成分，揮發(fā)性組分相對(duì)含量總體下降。具有脂肪香或青草味等不愉悅氣味的β-紅沒(méi)藥烯、庚醛、(E)-2-己烯基己酸酯和順-3-己烯基異丁酸酯等的含量呈下降趨勢(shì)，呈花香、果香的茉莉酸甲酯、苯甲酸芐酯、香葉基丙酮和3,7-二甲基-1,5,7-辛三烯-3-醇等的含量呈上升趨勢(shì)，使鐵觀(guān)音茶葉花果香更顯幽雅。本研究基于代謝組學(xué)技術(shù)了解包揉過(guò)程中的非揮發(fā)性和揮發(fā)性特征差異代謝物變化規(guī)律，為后期烏龍茶包揉品質(zhì)形成機(jī)制研究提供一定理論參考。