吳 艷,黎娜銘,2,張宇鑫,張 偉,陳穗蓮,黃 云,田永寬,曾智勇,吳學(xué)祥*,王 彬*

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽 550025;2.貴州省獨山縣麻尾鎮(zhèn)人民政府,貴州獨山 558200)

豬呼吸道疾病是世界范圍內(nèi)豬生產(chǎn)中最常見的健康問題之一。盡管在診斷、控制和預(yù)防領(lǐng)域取得了重大進(jìn)展,呼吸系統(tǒng)疾病仍然是商品豬生產(chǎn)中面臨挑戰(zhàn)的問題。引起豬呼吸道疾病的病原種類較多,包括細(xì)菌、病毒及支原體等病原體[1]。其中與豬呼吸道感染有關(guān)的病原菌包括豬鏈球菌(Streptococcussuis,SS)、豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,App)、豬多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,Hps)、豬支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica,Bb)等以及豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)。以上病原菌常呈現(xiàn)混合感染,不僅使豬群發(fā)病更嚴(yán)重,也增加了診斷的困難程度[2]。因此,臨床上迫切需要建立一種能同時檢測豬呼吸道疾病病原菌單獨或混合感染的方法。PCR檢測方法具有高度特異性和敏感性,是臨床檢測病原菌常用的方法,而多重PCR(mPCR)可以在一次反應(yīng)中檢測多種目標(biāo)病原菌,極大的節(jié)約了時間和成本,為相關(guān)疫病大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)支持[3]。本研究針對SS、App、Pm、Hps、Bb和Mhp對應(yīng)的gdh、apxⅣA、KMT1、16SrRNA、fla和p36ldh基因分別設(shè)計特異性引物,經(jīng)過系列條件的優(yōu)化,建立一種能同時檢測SS、App、Pm、Hps、Bb和Mhp的多重PCR,并將其應(yīng)用于貴州省各豬場豬呼吸道病原菌的臨床檢測,為相應(yīng)病原的快速診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及臨床樣品 支氣管敗血波氏桿菌和多殺性巴氏桿菌A型,由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)吳斌教授惠贈;豬胸膜肺炎放線桿菌血清1型2株,分別由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)余興龍教授和吉林大學(xué)雷連成教授饋贈;豬肺炎支原體168株滅活菌液,由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院馮志新研究員饋贈;鏈球菌菌株和副豬嗜血桿菌菌株血清6型,由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)金卉教授饋贈;大腸埃希氏菌、奇異變形桿菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌,由本實驗室分離保存。臨床樣品取自2020年10月至2021年3月貴州省9個市(州)部分豬場的發(fā)病豬鼻拭子(25份)、發(fā)病豬肺臟組織病料(14份)和表觀健康豬鼻拭子(430份)樣品共469份。

1.1.2 主要試劑 Goldview核酸染料,百泰克公司產(chǎn)品;瓊脂糖,Biowest公司產(chǎn)品;PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye),寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;2×TaqMaster Mix (Dye Plus)、2×TaqPlus Master Mix Ⅱ(Dye Plus)、GreenTaqMix (with ddH2O)、2×AceTaqMaster Mix (Dye Plus)、DL 2 000 PLUS DNA Marker,南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品;2×SanTaqPCR Master Mix (with Blue Dye),生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品;金牌Mix(green),北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 PCR擴增儀(T100TMThermal Cycler)、Ge1 DOC XR凝膠成像系統(tǒng),美國Bio-Rad有限公司產(chǎn)品;電泳儀(JY600C)和電泳槽(JY-SPCT),北京君意東方電泳儀設(shè)備有限公司產(chǎn)品;超凈工作臺(SW-CJ-ID(D),蘇州蘇泰凈化設(shè)備工程有限公司產(chǎn)品;Thermo高速冷凍離心機(17R),美國Thermo Fisher有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 參考文獻(xiàn)報道和NCBI中AppapxⅣA(FJ807045.1)、PmKMT1(AF016259.1)、SSgdh(AB246887.1)、Bbfla(Hozbor D等[4])、Hps 16SrRNA(AB004041.1)和Mhpp36ldh(MG813444.1)序列,利用NCBI Primer Blast、Primer 5.0軟件和PrimerSelect軟件,按照引物設(shè)計原則,設(shè)計6對特異性引物(表1),引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列及大小

1.2.2 細(xì)菌核酸的提取 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒根據(jù)說明書分別提取純化后SS、App、Pm、Hps、Bb、Mhp、大腸埃希氏菌、奇異變形桿菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌的基因組DNA,置-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 單項PCR擴增及反應(yīng)條件的優(yōu)化 確定單項PCR反應(yīng)體系為25 μL,對單項PCR的引物添加量和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,引物濃度為10 μmol/L,引物添加量優(yōu)化范圍為0.5～2.5 μL,退火溫度優(yōu)化范圍為50～62 ℃。優(yōu)化結(jié)束后,選取最優(yōu)反應(yīng)條件進(jìn)行單項PCR擴增,取5 μL PCR擴增產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測,其余PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序鑒定。

1.2.4 多重PCR擴增及反應(yīng)條件的優(yōu)化 在單項PCR各反應(yīng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上,多重PCR反應(yīng)體系選擇為50 μL,對多重PCR的引物添加量和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。引物濃度為10 μmol/L,App引物添加量優(yōu)化范圍為0.25～2.5 μL,Pm、SS、Hps、Bb和Mhp的引物添加量優(yōu)化范圍為0.25～1.0 μL,退火溫度優(yōu)化范圍為50～62 ℃。

1.2.5 多重PCR特異性試驗 采用優(yōu)化后的反應(yīng)條件,分別以SS、App、Pm、Hps、Bb、Mhp、大腸埃希氏菌、奇異變形桿菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌的DNA為模板進(jìn)行多重PCR擴增,設(shè)ddH2O為陰性對照,評估建立的多重PCR方法的特異性。

1.2.6 多重PCR敏感性試驗 將1.2.2提取的各目的病原菌基因組DNA利用微量分光光度計測定濃度,根據(jù)Genome中登錄的參考菌株基因組堿基總長度中位數(shù)(SS:2.106 23 Mb、App:2.275 54 Mb、Pm:2.320 25 Mb、Hps:2.248 12 Mb、Bb:5.199 88 Mb、Mhp:0.725 85 Mb),采用公式:基因組DNA拷貝數(shù)(copies/μL)=(6.02 × 1023) × (核酸濃度(ng/μL)× 10-9) / (DNA 長度(bp) × 660),計算各細(xì)菌基因組DNA拷貝數(shù)。將各菌基因組DNA按1.2.4優(yōu)化后的比例混合,用滅菌的ddH2O 10倍倍比稀釋(10-1～10-8),按照1.2.4建立的多重PCR方法擴增,以檢測多重PCR方法的敏感性。

1.2.7 多重PCR對臨床樣品的檢測 取發(fā)病豬肺臟組織20～30 mg等比加入滅菌ddH2O,勻漿,11 500 r/min離心1 min,棄上清,取沉淀利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取14份發(fā)病豬肺臟組織樣本中細(xì)菌的DNA;分別取25份病豬鼻拭子置于2 mL生理鹽水中充分混勻,于11 500 r/min離心1 min,棄上清,利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取沉淀中細(xì)菌的DNA;取表觀健康豬鼻拭子置于TSB培養(yǎng)基中搖床振蕩過夜培養(yǎng),培養(yǎng)菌液于11 500 r/min離心1 min,棄上清,取沉淀利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取430份表觀健康豬鼻拭子經(jīng)過夜培養(yǎng)后細(xì)菌的DNA。并用所建立的多重PCR和1.2.3所述的單項PCR方法對469份臨床樣品進(jìn)行檢測,比較多重PCR和單項PCR的檢測結(jié)果,計算兩者的符合率。

2 結(jié)果

2.1 單項PCR擴增及反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

利用表1中的6對引物分別對SS、App、Pm、Hps、Bb和Mhp的基因組DNA模板進(jìn)行單項PCR擴增。結(jié)果顯示,單項PCR最佳反應(yīng)體系為:2×AceTaqMaster Mix (Dye Plus) 12.5 μL,DNA(SS/App/Pm/Hps/Bb/Mhp)模板均為2.0 μL,App、Bb上、下游引物量(10 μmol/L)各為1.5 μL ,Pm、SS、Hps和Mhp上、下游引物量(10 μmol/L)各為1.0 μL,ddH2O補足25μL。單項PCR最佳反應(yīng)程序為:95 ℃5 min;94 ℃30 s,62 ℃45 s,72 ℃45 s,共35個循環(huán);72 ℃10 min。在以上優(yōu)化條件下,單項PCR擴增效果最佳(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1.App; 2.Pm; 3.SS; 4.Hps; 5.Bb; 6.Mhp

2.2 多重PCR擴增及反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

以6種病原菌DNA混合進(jìn)行多重PCR擴增,對引物添加量和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示,多重PCR最佳反應(yīng)體系為:2×TaqPlus Master Mix Ⅱ 25 μL,加入引物(10 μmol/L)量為App 2.5 μL,Bb 1.0 μL ,Pm 、SS、Hps、Mhp 各0.5 μL,DNA模板量為App 5.0 μL,Pm、SS、Hps和Mhp各1.0 μL,Bb 2.0 μL,滅菌ddH2O補足50 μL。多重PCR最佳反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s、62 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min,共30個循環(huán);72 ℃ 10 min。多重PCR反應(yīng)退火溫度優(yōu)化,在50～62 ℃溫度范圍內(nèi)均能擴增出6條PCR產(chǎn)物條帶,且無非特異性擴增,為了避免實際應(yīng)用中非特異性條帶的干擾,因此選擇62 ℃作為退火溫度(圖2)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～8.退火溫度分別為50.0、50.8、52.3、54.6、57.3、59.6、61.1、62.0℃

2.3 多重PCR特異性試驗結(jié)果

分別以這6種病原菌的混合和單獨基因組DNA為模板,用1.2.2建立的多重PCR方法進(jìn)行擴增。結(jié)果顯示,該方法僅對SS、App、Pm、Hps、Bb和Mhp混合或單獨基因組DNA有特異性擴增,對大腸埃希氏菌、奇異變形桿菌、停乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌DNA及陰性對照均無擴增條帶(圖3),表明所建立的多重PCR方法特異性強。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陰性對照;2.App、Pm、SS、Hps、Mhp和Bb混合基因組DNA;3.APP;4.Pm;5.SS;6.HPS;7.Bb;8.Mhp;9.大腸埃希氏菌;10.奇異變形桿菌;11.停乳鏈球菌;12.金黃色葡萄球菌

2.4 多重PCR敏感性試驗結(jié)果

紫外分光光度計測定提取的病原菌DNA濃度分別為SS 20 ng/μL、App 262.5 ng/μL、Pm 21.9 ng/μL、Hps 22.2 ng/μL、Bb 43 ng/μL、Mhp 30.7 ng/μL,計算得到各病原菌DNA的拷貝數(shù)分別為SS 8.66 ×106拷貝/μL、App 1.05×108拷貝/μL、Pm 8.61 ×106拷貝/μL、Hps 9.01×107拷貝/μL、Bb 7.54×107拷貝/μL、Mhp 3.86×108拷貝/μL,將其按照1.2.2的體系混合后10倍倍比稀釋(10-1～10-8),采用建立的多重PCR進(jìn)行擴增。經(jīng)測定,6種病原菌DNA的最低檢限分別為SS 8.66 ×102拷貝/μL、App 1.05×104拷貝/μL、Pm 8.61 ×102拷貝/μL、Hps 9.01×102拷貝/μL、Bb 7.54×102拷貝/μL、Mhp 3.86×103拷貝/μL(圖4),表明該方法的敏感性較高。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～8依次為101～ 108稀釋的各菌混合物

2.5 多重PCR對臨床樣品的檢測結(jié)果

利用本研究建立的多重PCR和單項PCR對貴州省不同地區(qū)的469份臨床樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,多重PCR中6種病原菌的陽性檢出率分別為:App 0.85%(4/469)、Pm 15.35%(72/469)、SS 59.49%(279/469)、Hps 52.67%(247/469)、Mhp 6.40%(30/469)、Bb 5.12%(24/469);各病原菌單項PCR的陽性檢出率為App 1.07%(5/469)、Pm 18.12%(85/469)、SS 60.13%(282/469)、Hps 53.09%(249/469)、Mhp 6.61%(31/469)、Bb 5.54%(26/469)(表2)?；旌细腥局饕許S和Hps為主,陽性檢出率為30.92%(145/469),其次是Pm、SS和Hps混合感染,陽性檢出率為7.04%(33/469)(表3),其他混合感染情況占比較低。多重PCR和單項PCR方法的總陽性符合率為96.76%,表明本研究建立的多重PCR方法可用于臨床樣品的檢測。

表2 樣品中病原菌檢測結(jié)果

表3 樣品中病原菌感染情況

3 討論

豬呼吸道疾病在臨床上多發(fā),是養(yǎng)豬業(yè)最常見的疾病之一。豬肺炎支原體(Mhp)和胸膜肺炎放線菌(App)常與豬鏈球菌(SS)、副豬嗜血桿菌(Hps)、豬支氣管敗血波氏桿菌(Bb)和多殺性巴氏桿菌(Pm)等病原菌混合感染或繼發(fā)感染,引起的發(fā)病癥狀相似且能增加豬呼吸道疾病的嚴(yán)重程度[5-7],給臨床診療造成極大的困擾和經(jīng)濟損失。因此,建立一種能準(zhǔn)確快速診斷Mhp、App、SS、Hps、Bb和Pm的檢測方法是臨床診療的迫切需求。多重PCR作為PCR最重要的衍生技術(shù)之一,可以同時檢測多種病原菌,具有高效性和靈活性,在世界范圍內(nèi)得到廣泛的應(yīng)用[8-9]。本研究針對SS、App、Pm、Hps、Bb和Mhp這6種常見豬呼吸道病原菌的相關(guān)基因設(shè)計特異性引物,經(jīng)過反應(yīng)條件和反應(yīng)程序的優(yōu)化,建立了同時檢測上述6種豬呼吸道病原菌的多重PCR,該多重PCR能對臨床樣品進(jìn)行快速、特異和敏感的檢測,使臨床病例的診斷和流行病學(xué)的調(diào)查更加快捷。

根據(jù)多重PCR引物設(shè)計原則,本研究針對AppapxⅣA、PmKMT1、SSgdh、Hps 16SrRNA、Mhpp36ldh和Bbfla的部分基因片段,設(shè)計了6對特異性引物。在該多重PCR目的基因的選擇上,其中App的4種apx毒素基因中,僅有apxⅣA存在于App所有的血清型中,而apxⅣ由apxⅣA基因編碼,因此選取的apxⅣA基因具有種特異性[10]。細(xì)胞壁蛋白基因KMT1對Pm高度保守和特異[11]。豬鏈球菌gdh基因在豬鏈球菌莢膜類型中十分保守,與地理來源無關(guān),因此針對該基因設(shè)計的引物具有特異性[12]。p36基因編碼乳酸脫氫酶,此酶是Mhp的一種特異性免疫蛋白[13]。fla為Bb鞭毛蛋白基因[14],該基因具有種屬特異性。Hps 16SrRNA基因序列設(shè)計的引物可以與其他細(xì)菌區(qū)分[15]。將上述引物擴增出的條帶進(jìn)行比對測序,并使用DNA Star軟件分析核苷酸相似性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)所選取的目的基因片段與NCBI中相關(guān)基因片段同源性均在98.6%以上,表明所選取的目的基因片段均高度保守和特異。

本研究采用建立的多重PCR對貴州省469份臨床樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,SS和Hps的感染率最高,Pm、Mhp和Bb次之,App感染率最低。多重PCR和單項PCR檢出病原菌的總陽性符合率較高,為96.76%,證明本研究建立的六重PCR檢測方法可靠。同時,這些樣品普遍存在混合感染情況,其中SS和Hps的混合感染情況最嚴(yán)重,占總樣本數(shù)的30.92%,其次是Pm 、SS和Hps的混合感染,占總樣本數(shù)的7.04%,未檢測出同時感染這6種病原菌的臨床樣品。薛云等[2]對華中地區(qū)豬群的研究結(jié)果顯示,Mhp和Hps的混合感染率最高,占19.2%,其次是Mhp和Bb混合感染,占12.0%。丁文文等[16]對河南及周邊省份2 445個臨床樣本的研究結(jié)果顯示,Hps的感染率最高,占21.7%。以上結(jié)果表明,全國各地區(qū)的豬群呼吸道感染情況具有地方特點,提示在防控豬呼吸道疾病時,應(yīng)做到因地制宜。與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離方法相比,本研究建立的方法更加快速、便捷、高效,具有較好的實用性,為豬呼吸道疾病臨床病例快速鑒別診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)支撐。