李銀洛，唐才林，盛長(zhǎng)城，陳 宇，龍興震，白 雪△

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550002； 2.貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002； 3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002）

帶狀皰疹后神經(jīng)痛（PHN）是帶狀皰疹的常見并發(fā)癥，疼痛劇烈，常用藥物非甾體類解熱鎮(zhèn)痛藥和阿片類鎮(zhèn)痛藥的療效均不理想。加巴噴丁和普瑞巴林是治療PHN 的一線藥物，但對(duì)50%的患者治療無效或療效欠佳［1-2］。據(jù)報(bào)道，加巴噴丁和普瑞巴林的個(gè)體間血藥濃度差異大［3-4］，其血藥濃度與臨床療效、不良反應(yīng)存在相關(guān)性［5］。部分國(guó)家要求對(duì)服用加巴噴丁和普瑞巴林的患者進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)［6］，但我國(guó)尚未見相關(guān)報(bào)道。在PHN 的臨床藥物治療中，常用治療方案為當(dāng)加巴噴丁治療無效時(shí)換用普瑞巴林或普瑞巴林治療無效時(shí)換用加巴噴丁，并非同時(shí)使用。有研究報(bào)道，兩藥聯(lián)用可提高治療有效率，減少不良反應(yīng)和用藥劑量［7-9］。加巴噴丁和普瑞巴林的血藥濃度監(jiān)測(cè)可為評(píng)估PHN 患者的給藥劑量、血藥濃度與療效和不良反應(yīng)的相關(guān)性提供參考，提高PHN 藥物治療的有效性和安全性。目前，加巴噴丁和普瑞巴林的血漿藥物濃度測(cè)定方法有高效液相色譜法［10-11］、液相色譜- 熒光法［12-13］和液相色譜-質(zhì)譜法［14-15］等但兩藥均無紫外吸收，需進(jìn)行柱前衍生化，導(dǎo)致血漿樣品前處理復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，同時(shí)測(cè)定兩藥血藥濃度的方法尚未見報(bào)道。為此，本研究中建立了同時(shí)測(cè)定血漿中加巴噴丁和普瑞巴林濃度的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法，以期為提高臨床治療PHN 的有效率及個(gè)體化藥物治療提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AB SCIEX 3500 型高效液相色譜- 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)AB Sciex公司），操作軟件工作站為Analyst 1.6.3；AL204 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo，精度為萬分之一）；TGL - 16WC 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘銳離心機(jī)有限公司）；XH - B 型渦旋混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）。

1.2 試藥

加巴噴丁對(duì)照品（批號(hào)為100655-201903，含量為99.8%），普瑞巴林對(duì)照品（批號(hào)為101106-202003，含量為99.4%），茶堿對(duì)照品（批號(hào)為100121-201805，含量為99.9%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（HPLC 級(jí)），甲醇（LC 級(jí)），均購(gòu)于美國(guó)Tedia 公司；甲酸（LC級(jí)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；空白血漿取自志愿者；純凈水（華潤(rùn)怡寶飲料有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

預(yù)柱：Phenomenex Security GuardTMULTRA 柱；色譜柱：Phenomenex Luna?Omega C18柱（50 mm × 2.1 mm，1.6 μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（程序見表1）；流速：0.30 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase

2.1.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離（ESI）；離子極性及檢測(cè)模式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；噴霧電壓（IS）：5 500 V；霧化溫度（TEM）：550 ℃；氣簾氣（CUR）：30.0 psi（氮?dú)猓慌鲎矚猓–AD）：7 psi；霧化氣（GS1）：50.0 psi；輔助氣（GS2）：50.0 psi；入口電壓（EP）：10 V。其余參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜條件部分參數(shù)設(shè)置Tab.2 Partial parameter settings for mass spectrometry conditions

2.2 溶液制備

系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：取加巴噴丁和普瑞巴林對(duì)照品各適量，精密稱定，置不同容量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并定容，分別配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的對(duì)照品貯備液，于4 ℃冰箱中保存，備用。取上述對(duì)照品貯備液各適量，混勻，用50%甲醇溶液逐級(jí)稀釋，得質(zhì)量濃度分別為1.00，2.00，4.00，8.00，16.00，32.00，64.00，96.00，128.00 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

系列混合質(zhì)控工作液：取上述對(duì)照品貯備液各適量，混勻，用50%甲醇溶液逐級(jí)稀釋，得質(zhì)量濃度分別為2.00，64.00，96.00 μg/mL 的系列混合質(zhì)控工作液。同時(shí)，配制質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL 的混合定量下限工作液。

內(nèi)標(biāo)工作液：取茶堿對(duì)照品適量，精密稱定，用50%甲醇溶液溶解，超聲處理，定容，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/ mL 的內(nèi)標(biāo)貯備液，于4 ℃冰箱中保存，備用。用50%甲醇溶液作為稀釋溶液，配制質(zhì)量濃度為20.00 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控血漿樣品：取空白血漿樣品90 μL，置1.5 mL 離心管中，加入10 μL 系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（或系列混合質(zhì)控工作液）和內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋，混勻，加入290 μL 有機(jī)溶劑甲醇沉淀血漿蛋白，渦旋1 min，低溫高速離心（4 ℃，12 000 r/ min）10 min，取上清液，即得。

2.3 血漿樣品前處理

取血漿樣品100 μL，置1.5 mL 離心管中，加10 μL內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋，混勻，加290 μL 甲醇沉淀血漿蛋白，渦旋1 min，低溫高速離心（4 ℃，12 000 r/min）10 min，取上清液適量，注入液相色譜儀自動(dòng)進(jìn)樣器模塊（溫度設(shè)為10 ℃）中，進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取不同來源的志愿者空白血漿90 μL，分別加入10 μL系列混合質(zhì)控工作液和內(nèi)標(biāo)工作液，按2.3 項(xiàng)下方法處理，即得；取空白血漿，按2.3 項(xiàng)下方法處理，即得；取空白血漿90 μL，分別加入加巴噴丁和普瑞巴林對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為6.40 μg/ mL）10 μL，混勻，按2.3 項(xiàng)下方法處理，即得。結(jié)果顯示，加巴噴丁和普瑞巴林的出峰時(shí)間分別為2.51 min 和2.50 min，在其對(duì)應(yīng)離子通道下，血漿樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)化合物的色譜峰。色譜圖見圖1。

1.加巴噴丁 2.普瑞巴林A.空白血漿 B.空白血漿+ 加巴噴丁、普瑞巴林和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液 C.空白血漿+ 加巴噴丁對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為6.40 μg / mL）D.空白血漿+ 普瑞巴林對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為6.40 μg / mL）圖1 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖1.Gabapentin 2.PregabalinA.Blank plasma B.Blank plasma + gabapentin，pregabalin and internal standard reference solution C.Blank plasma + gabapentin reference solution（mass concentration：6.40 μg / mL）D.Blank plasma + pregabalin reference solution（mass concentration：6.40 μg / mL）Fig.1 HPLC chromatograms

標(biāo)準(zhǔn)曲線建立和定量下限（LLOQ）確定：取血漿樣品90 μL，置1.5 mL 離心管中，分別加入10 μL 系列標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液和內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋，混勻，加290 μL 有機(jī)溶劑甲醇沉淀血漿蛋白，渦旋1 min，低溫高速離心（4 ℃，12 000 r/ min）10 min，取上清液，即得加巴噴丁和普瑞巴林質(zhì)量濃度分別為100.00，200.00，400.00，800.00，1 600.00，3 200.00，6 400.00，9 600.00，12 800.00 ng/ mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品。取適量，按2.1項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以加巴噴丁和普瑞巴林的質(zhì)量濃度（X，ng/ mL）為橫坐標(biāo)、待測(cè)物的峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)峰面積（Ai）比值（Y）為縱坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析。得回歸方程分別為Y加=0.002 1X加- 0.051 9（r= 0.999 2，n= 9）和Y普=0.000 7X普-0.01 4（r=0.999 6，n=9）。結(jié)果表明，加巴噴丁和普瑞西林的質(zhì)量濃度在100.00～12 800.00 ng/ mL范圍內(nèi)與待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)峰面積比值線性關(guān)系良好。2 種待測(cè)物的LLOQ為100.00 ng/mL。

精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)：定量吸取90 μL 空白血漿，分別加入內(nèi)標(biāo)和LLOQ、低、中、高4 種質(zhì)量濃度（100.00，200.00，6 400.00，9 600.00 ng/mL）的系列混合質(zhì)控工作液各10 μL，按2.3項(xiàng)下方法操作，即得加巴噴丁和普瑞巴林的混合質(zhì)控血漿樣品。每個(gè)質(zhì)量濃度平行制備6份樣品，連續(xù)制備3 d并測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，加巴噴丁和普瑞巴林的日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)的LLOQ 樣品均值在標(biāo)示濃度± 20%范圍內(nèi)，RSD均小于20%（n= 6）；低、中、高3 種質(zhì)量濃度樣品均值在標(biāo)示濃度± 15%范圍內(nèi)，RSD均小于15%（n=6）。詳見表3。

表3 血漿中加巴噴丁和普瑞巴林的精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of precision and accuracy tests of gabapentin and pregabalin in plasma（n = 6）

提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)：配制血漿樣品，2 種待測(cè)物低、中、高質(zhì)量濃度依次為200.00，6 400.00，9 600.00 ng/mL，各平行6 份，按2.3 項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣檢測(cè)加巴噴丁、普瑞巴林和內(nèi)標(biāo)的峰面積（A）。取200 μL 空白血漿樣品，加600 μL 有機(jī)溶劑甲醇沉淀蛋白后，取上清液380 μL，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的系列混合質(zhì)控工作液和內(nèi)標(biāo)工作液各10 μL，混勻，置低溫高速離心機(jī)中離心10 min，取上清液，檢測(cè)加巴噴丁、普瑞巴林和內(nèi)標(biāo)的峰面積（B）。定量吸取90 μL 甲醇，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的系列混合質(zhì)控工作液和內(nèi)標(biāo)工作液各10 μL，混勻，加300 μL甲醇，置低溫高速離心機(jī)中離心10 min，取上清液，檢測(cè)加巴噴丁、普瑞巴林和內(nèi)標(biāo)的峰面積（C）。計(jì)算提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)，提取回收率（%）=A/B× 100%，基質(zhì)效應(yīng)（%）=B/C×100%。結(jié)果，血漿中加巴噴丁和普瑞巴林的低、中、高質(zhì)量濃度的提取回收率分別為93.89% ～101.55% 和94.38%～101.93%，基質(zhì)效應(yīng)分別為88.76%～100.95% 和91.87%～102.08%，均符合要求。內(nèi)標(biāo)的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)的平均RSD分別為9.56%和5.77%，均小于15%，符合要求。詳見表4。

表4 血漿中加巴噴丁與普瑞巴林的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果（n=6）Tab.4 Extraction recovery rate and matrix effect results of gabapentin and pregabalin in plasma（n = 6）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：不同保存條件下，低、中、高質(zhì)量濃度加巴噴丁和普瑞巴林血漿和儲(chǔ)備樣品的穩(wěn)定性，各平行6 份，分別置常溫下8 h，常溫24 h，進(jìn)樣室24 h，4 ℃冰箱48 h，-80 ℃冰箱24 h 反復(fù)凍融3 次，-80 ℃冰箱40 d。結(jié)果的RSD均小于15%，表明加巴噴丁和普瑞巴林樣品均穩(wěn)定。

2.5 人體藥代動(dòng)力學(xué)研究方案與應(yīng)用

該研究方案已獲貴州省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［批件號(hào)為倫審字（科研）〔2019〕75 號(hào)］，患者簽署知情同意書。納入服用加巴噴丁或普瑞巴林的PHN 患者各20 例，采用滴定給藥方式，加巴噴丁和普瑞巴林最大給藥劑量分別為1.50 g/d 和0.30 g/d。口服加巴噴丁表現(xiàn)出飽和吸收，即一種非線性（零級(jí)）過程，使其藥代動(dòng)力學(xué)更難預(yù)測(cè)，血藥濃度不隨劑量增加而成比例增加；普瑞巴林的吸收是線性（一級(jí)）過程，血漿濃度隨劑量的增加而增加。在藥物給藥劑量穩(wěn)定后，持續(xù)服藥48 h，于次日清晨采集患者空腹靜脈血，并按上述方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表5。加巴噴丁的血藥濃度為4 083.62～12 287.04 ng /（mL·g），經(jīng) 劑 量 校 正 后 濃 度 為2 268.68～13 652.27 ng/（mL·g）；普瑞巴林的血藥物濃度為2 307.04～6 588.49 ng/（mL·g），經(jīng)劑量校正后濃度為11 987.27～36 518.73 ng/（mL·g）?？梢?，患者體內(nèi)兩藥的血藥濃度差異較大。因此，有必要對(duì)這2 種藥物進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)，并在后續(xù)研究中探討血藥濃度和臨床療效間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而為患者的藥物治療劑量制訂及個(gè)體化用藥提供參考。

表5 患者血漿中加巴噴丁與普瑞巴林的藥物濃度Tab.5 Concentration of gabapentin and pregabalin in patient's plasma

3 討論

方法建立階段，分別嘗試了不同比例的等度洗脫和梯度洗脫來優(yōu)化待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的峰形、保留時(shí)間，最終選擇上述方法中的梯度洗脫程序。后續(xù)考察了水相中不同濃度的甲酸體積分?jǐn)?shù)（0.05%，0.10%，0.15%），5.00 mmol/ L 醋酸銨（0.10%甲酸），50.00 mmol/ L 磷酸二氫鈉（pH=2.5），有機(jī)相分別采用甲醇和乙腈進(jìn)樣測(cè)試，較多出現(xiàn)峰形分叉、肩峰或拖尾現(xiàn)象，最終采用0.10%甲酸水溶液和乙腈，可得到較好的峰形和響應(yīng)。在血漿樣品前處理階段，分別嘗試了甲醇和乙腈作為沉淀劑的一步蛋白沉淀法，該方法操作簡(jiǎn)便，進(jìn)樣后2 種沉淀劑的峰形和響應(yīng)相差不大，最后選擇價(jià)格便宜、毒性較小的甲醇作為沉淀劑。

國(guó)內(nèi)目前的加巴噴丁和普瑞巴林治療PHN 研究大部分為臨床療效的觀察?；颊咴诜幒蟪４嬖谥委煙o效的情況，且由于采用逐步遞增的給藥劑量方式，使達(dá)到給藥劑量后藥物無效更換藥物時(shí)患者需忍受更多疼痛。相同給藥劑量下，加巴噴丁和普瑞巴林的血藥濃度存在顯著的個(gè)體差異，故血藥濃度比給藥劑量能更直觀地反映藥物的體內(nèi)效應(yīng)。本研究中為后續(xù)加巴噴丁和普瑞巴林的血藥濃度監(jiān)測(cè)奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)，以期通過對(duì)患者的血藥濃度監(jiān)測(cè)，為止痛效果不理想PHN患者的下一步治療策略提供參考，減少患者的痛苦。同時(shí)，該方法學(xué)的建立也為下一步臨床探索加巴噴丁和普瑞巴林聯(lián)合個(gè)性化治療難治性PHN 提供了治療藥物監(jiān)測(cè)的方法學(xué)基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究中建立了同時(shí)測(cè)定PHN 患者血漿中加巴噴丁和普瑞巴林濃度的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，血漿樣本前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快，穩(wěn)定性好，血漿消耗量少，可為臨床提供大量樣本測(cè)定。